果蔬发酵汁是风靡于我国台湾地区及日本的植物功能食品，又可称为水果酵素，指以一种或多种新鲜果蔬、菌菇、中草药等为原料，经多种或单一菌株发酵而成的果蔬汁类饮料。果蔬发酵汁大多采用乳酸菌发酵，利用乳酸菌代谢产生与酸味呈正相关的γ-氨基丁酸和可口酸味的琥珀酸等小分子有机酸，产生醛类、醇类和羧酸类等芳香成分，增加果蔬汁的口感风味；同时发酵可引起植物细胞的降解，引起不同抗氧化物质的释放与合成，增加果蔬汁的抗氧化力[1-2]；一些乳酸菌株还具有高产γ-氨基丁酸[3]和胞外多糖[4]的能力，在改善口感的同时对人体产生益生功效。
果蔬发酵汁中的功能性物质主要包括多糖类、多酚类和黄酮类，多糖是以免疫调节声称最多的功能性物质，可通过刺激巨噬细胞、T/B 淋巴细胞、NK 细胞的活化与增殖，调节细胞因子和抗体的分泌等直接作用增强免疫力，亦可通过提高体内与免疫相关金属离子如钙离子、 铜离子等来增强机体免疫力[5]；多酚类和黄酮类具有重要的抗氧化作用，作为还原介质（自由基终止剂）、金属螯合剂、单线态氧猝灭剂或H+受体来清除体内过多的自由基[2]，有研究表明体内免疫细胞在抵抗病原体入侵的同时本身就会产生较多的活性氧，处于慢性氧化应激的状态[6]。保护免疫细胞免受氧化应激损伤会对增强机体免疫具有重要作用。本试验研究的复合果蔬发酵汁以苹果、香蕉、梨、葡糖、哈密瓜、西瓜、黑木耳、银耳、胡萝卜、白萝卜、西葫芦、火龙果、枸杞、香菇、西红柿、黄瓜和山药为原料，以乳酸菌发酵为主，配合酵母菌发酵的果蔬发酵饮品。主要考察复合果蔬发酵果蔬汁对小鼠脾淋巴的促增殖作用和抗氧化能力，同时对果蔬发酵汁的成分按照溶剂极性大小，用水、乙醇、正丁醇、乙酸乙酯和氯仿进行萃取，探讨其中起免疫调节作用的主要组分，为果蔬发酵汁的开发奠定试验基础。
复合果蔬发酵汁，自制研发产品；小鼠（Balb/c，6～8 周龄），北京维通利华实验动物技术有限公司；刀豆蛋白A、脂多糖、MTT、DCFH-DA、AAPH，Sigma 公司；RPMI-1640 培养基，Hyclone 公司；胎牛血清（FBS），四季青公司；胰蛋白酶、红细胞裂解液、缓冲液PBS、青霉素链霉素溶液（双抗），碧云天生物技术研究所；芦丁、没食子酸标准品，中检所；无水葡萄糖，北京益利精细化学品有限公司；DMSO，西陇化工股份有限公司；无水乙醇、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇，北京化工厂。
Spectra MR 多功能酶标仪，美国Dynex 公司；ESCO AC2-6S1 生物安全柜，新加坡艺思高科技有限公司；HF90 二氧化碳培养箱，力康生物医疗科技控股有限公司；BD C6 流式细胞仪；KQ-250E型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；IKA RV10 旋转蒸发仪，德国IKA；真空冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司；3K15 冷冻离心机，Sigma。
1.3.1 复合果蔬发酵汁分极萃取及成分分析
1.3.1.1 复合果蔬发酵汁的分极萃取 向果蔬发酵汁中加入10 倍体积90%的乙醇，室温静止过夜，于60 ℃下超声萃取40 min，离心合并醇溶组分，此作为多酚和黄酮提取液；残渣溶于5 倍发酵液体积的蒸馏水中，于60 ℃下超声萃取50 min，过滤，收集水溶组分，此作多糖提取液；残渣用蒸馏水洗涤下来，作为发酵汁残渣。分别将醇溶组分和水溶组分进行旋蒸浓缩，并与残渣进行真空冷冻干燥，得各组分干物质，并计算所占发酵汁总干物质比重。
取醇溶组分冻干物溶于4 倍体积的蒸馏水中，加入3 倍体积的氯仿相，磁力搅拌30 min，分离氯仿相和水相；水相中加入3 倍体积的乙酸乙酯，磁力搅拌30 min，分离乙酸乙酯相和水相；水相中加入3 倍体积的正丁醇，磁力搅拌30 min，分离正丁醇相和水相；之后将氯仿相、乙酸乙酯相、正丁醇相和最后所得水相分别减压回收溶剂，真空冷冻干燥，得各组分干物质，并计算所占发酵汁总干物质比重。
1.3.1.2 复合果蔬发酵汁的成分分析 依据农业行业标准NYT 1676-2008 《食用菌中粗多糖含量的测定》 检测复合果蔬发酵汁及其分极萃取产物中多糖含量。
依据农业行业标准NY-T 1600-2008《水果、蔬菜及其制品中单宁含量的测定 分光光度法》检测复合果蔬发酵汁及其分极萃取产物中多酚含量。
依据国标GB/T 19416-2003 《山楂汁及其饮料中果汁含量的测定》 检测复合果蔬发酵汁及其分极萃取产物中黄酮含量。
1.3.2 复合果蔬发酵汁及其萃取物对小鼠脾淋巴细胞的影响[7]
1.3.2.1 小鼠脾细胞悬液的制备 将小鼠（Balb/c）颈椎脱臼处死，无菌取脾脏，剪碎、研磨，制备脾淋巴细胞悬液，流式细胞仪调整细胞浓度至2×106个细胞/mL，台盼蓝染色检测细胞存活率大于95%。
1.3.2.2 复合果蔬发酵汁及其萃取物对脾淋巴细胞增殖的影响 MTT 法检测奶粉对脾淋巴细胞增殖的影响。将调整好细胞浓度的脾细胞悬液100 μL/孔接入到96 孔板中，将细胞分为空白对照组和试验组，试验组加入不同稀释倍数的果蔬发酵汁，于二氧化碳培养箱内培养24 h，离心弃上清液，每孔加入0.5 mg/mL MTT，继续培养4 h，离心弃上清，加入DMSO 100 μL，振荡使溶解，用酶标仪测定OD490 nm 值，增殖率计算公式：
1.3.2.3 果蔬发酵汁及其萃取物对T/B 淋巴细胞增殖的影响 将调整好浓度的脾细胞悬液按100 μL/孔加入到96 孔板中，设置试验组、模型组和空白对照组，模型组分别加入终质量浓度5 μg/mL的LPS 和终质量浓度10 μg/mL ConA，试验组在加入LPS 和Con A 的同时加入复合果蔬发酵汁及各分极萃取物质，每组做4 个复孔，将培养板置于二氧化碳培养箱中培养72 h。之后，离心弃上清液，每孔加入0.5 mg/mL MTT，继续培养4 h，离心弃上清，加入DMSO 100 μL，振荡使溶解，用酶标仪测定OD490 nm 值，对T/B 淋巴细胞增殖作用结果用刺激指数（Stimulation index，SI）表示，计算如下：
1.3.2.4 复合果蔬发酵汁萃取物对脾淋巴细胞氧化应激的影响 用AAPH 诱导小鼠脾淋巴细胞建立细胞氧化应激模型，用流式细胞仪检测各萃取物对脾淋巴细胞胞内ROS 产生量的影响。设置空白对照组、模型组和试验组，试验组分别加入不同浓度萃取物质，除对照组外每孔再加入终浓度为800 μmol/L 的AAPH。胞内ROS 产生量以细胞相对荧光强度（%）来表示，相对荧光强度（%）=试验组的荧光值/模型组的荧光值。
采用SPSS16.0 统计软件对数据进行处理，试验结果以均值±标准偏差（Mean±SD）表示。采用组间t 检验，P<0.05 具有显著性差异，P<0.01 具有极显著性差异。
果蔬中含有低聚糖、多糖、功能性脂类、氨基酸和酚类等具有增强免疫力、抗氧化、促进肠道菌平衡等功效的功能性成分，果蔬发酵汁经过接种前和灌装阶段的高温灭菌处理后，其营养功能性成分主要为多糖、 多酚和黄酮等具有一定热稳定性的物质。本试验主要以多糖类、多酚类和黄酮类物质为主线来分析果蔬汁中起功效的主要组分。其中复合果蔬发酵汁中含有总多糖含量为（1.81±0.021）mg/mL，总多酚为（1.45±0.15）mg/mL，总黄酮为（606.61±25.13）μg/mL。所提取出的各组分成分含量如表1中所述，水溶组分中除多糖类物质外，还含有一定量的多酚类物质，醇溶组分中以多酚类和黄酮类为主。
表1 复合果蔬发酵汁各萃取物成分含量
Table 1 Extracts compositions analysis of compound fermented fruit and vegetable juice
总多糖（mg/mg提取组分）总黄酮（μg/mg提取组分）总多酚（mg/mg提取组分）占发酵汁总干物质比例/%醇溶组分水溶组分 0.53 ± 0.016 6.70 ± 1.56 14.86 ± 1.15 6.25氯仿相组分 0.45 ± 0.015 53.77 ± 4.43 10.83 ± 0.77 0.59乙酸乙酯相组分 0.30 ± 0.0011 70.73 ± 5.19 34.33 ± 0.85 1.66正丁醇相组分 0.58 ± 0.017 11.61 ± 1.10 18.04 ± 1.28 11.33水相组分 0.54 ± 0.013 10.02 ± 2.03 11.38 ± 1.28 79.23残渣 未检测 未检测 未检测 0.57
乳酸菌会代谢果蔬汁中的碳水化合物产生大量的有机酸，经发酵后果蔬汁中的营养物质和pH值均会发生变化 （果蔬汁发酵前pH 值为6.5，发酵后pH 值为3.9），复合果蔬汁在发酵前、发酵后pH 调整至6.5 及复合果蔬发酵汁对小鼠对T 淋巴细胞增殖的影响见图1，对B 淋巴细胞增殖的影响见图2。由图1、图2可知，相比于发酵前，复合果蔬发酵汁具有一定促进T/B 淋巴细胞增殖的作用，说明果蔬汁经发酵后具有一定增强免疫的功效；相比于复合果蔬汁发酵后pH 调整至6.5，复合果蔬发酵汁对小鼠淋巴细胞也具有较好的促增殖作用，说明发酵后产生的有机酸对免疫调节具有增强作用。
关于果蔬发酵汁增强免疫力的研究已有报道，王智鼎等人[8]研究发现灌胃小鼠混合果蔬发酵饮品30 d，可促进小鼠T/B 淋巴细胞增殖、增强巨噬细胞吞噬功能；吴彬彬等[9]研究发现灌胃S180荷瘤小鼠植物果蔬发酵液可改善其免疫调节功能。关于有机酸免疫调节作用的研究报道，主要是将其添加到饲料中，促进家禽的生长性能[10-11]。同时，果蔬富含多酚类物质，乳酸菌会降解植物细胞，分解大分子酚类物质为小分子[12-13]，一些小分子酚酸如绿原酸[14]会对机体免疫具有促进作用。
果蔬发酵汁各萃取物质对脾淋巴细胞增殖的影响见图3。试验从果蔬发酵汁中萃取得到了水溶组分和醇溶组分，从醇溶组分中又按溶剂极性大小萃取得到氯仿相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相，共6 个组分，分别选取各组分的4 个浓度研究其对脾淋巴细胞的作用程度。由图4可知，所选各组分的4 个浓度均不会影响脾淋巴细胞的正常生长代谢。具体通过各组分物质对T/B 淋巴细胞的促增殖结果来判断各组分的免疫促进作用，得到最佳的功效组分。
图1 果蔬发酵汁对ConA 诱导的小鼠T 淋巴细胞增殖的影响
Fig.1 Effect of compound fermented fruit and vegetable juice on proliferation of T lymphocyte
注：*P<0.05，**P<0.01（与模型组比较）。
图2 果蔬发酵汁对LPS 诱导的B 淋巴细胞增殖的影响
Fig.2 Effect of compound fermented fruit and vegetable juice on proliferation of B lymphocyte
注：*P<0.05，**P<0.01（与模型组比较）。
图3 果蔬发酵汁萃取物对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响
Fig.3 Effect of extracts of compound fermented fruit and vegetable juice on proliferation of murine splenocytes
注：*P<0.05，**P<0.01（与对照组比较）。
图4 水溶组分和醇溶组分对Con A 诱导的小鼠T 淋巴细胞增殖的影响
Fig.4 Effect of water soluble and alcohol components of the juice on proliferation of T lymphocyte
注：**P<0.01（与模型组比较）。
水溶组分和醇溶组分对T/B 淋巴细胞增殖作用的影响见图4、图5。由图4可知，醇溶组分相比来说具有较好促进T 淋巴细胞增殖的作用；由图5可知，醇溶组分和水溶组分对B 淋巴细胞的增殖均没有显著性的影响，但醇溶组分相比水溶组分来说仍具有较好的作用。故本试验最终将从醇溶组分中筛选得到免疫调节最佳功效组分。
从醇溶组分中萃取得到的各相对T/B 淋巴细胞增殖的影响见图6、图7。由图6可知，正丁醇相具有较好促进T 淋巴细胞增殖的作用，氯仿相、水相均在较高浓度下具有较好促进T 淋巴细胞增殖的功效，而乙酸乙酯相对T 淋巴细胞的促增殖作用表现不明显；由图7可知，正丁醇相和水相相对来说对B 淋巴细胞的促增殖作用表现比较明显，而乙酸乙酯相在200 μg/mL 下对B 淋巴细胞的增殖具有显著抑制作用（P<0.05）。
图8为醇溶组分各相对脾淋巴细胞氧化应激的影响，各组分均具有极显著的抑制胞内ROS 产生的作用（P<0.01），保护脾淋巴细胞免受氧化应激的损伤。乙酸乙酯相中所含酚类和黄酮类最多，其活性氧清除能力亦较强。关于酚类物质抗炎作用——抑制T/B 淋巴细胞增殖的文献报道也比较多，本文主要是筛选促进T/B 淋巴细胞增殖的组分，如前所述，机体免疫细胞本身就处于慢性氧化应激的状态，保护脾淋巴细胞免受氧化应激的损伤对免疫细胞发挥其生理功效都具有重要的作用。
图5 水溶组分和醇溶组分对LPS 诱导的小鼠B 淋巴细胞增殖的影响
Fig.5 Effect of water soluble and alcohol components of the juice on proliferation of B lymphocyte
图6 果蔬发酵汁醇溶各组分对ConA 诱导的小鼠T 淋巴细胞增殖的影响
Fig.6 Effect of alcohol components of the juice on proliferation of T lymphocyte
注：*P<0.05，**P<0.01（与模型组比较）。
图7 果蔬发酵汁醇溶各组分对LPS 诱导的B 淋巴细胞增殖的影响
Fig.7 Effect of alcohol components of the juice on proliferation of B lymphocyte
注：*P<0.05，**P<0.01（与模型组比较）。
图8 果蔬发酵汁醇溶各组分对脾淋巴细胞胞内ROS 产生量的影响
Fig.8 Effect of the extracts of the juice on production of ROS in cells of murine splenocytes
注：**P<0.01（与模型组比较）。
植物多酚类物质分子质量在500～3 000 范围内，为极性有机化合物，可溶于水、乙醇、 乙酸乙酯等有机溶剂。关于多酚的分离纯化，通常采用有机溶剂分步萃取。植物多酚分子质量不同，极性强弱也不同，在不同有机溶液中的溶解度也就有差异，有研究表明在一定分子质量范围内，其分子质量越大，含酚羟基越大，极性越大[15]。关于多酚类物质定量分析方法主要包括紫外分光光度法和色谱法，色谱法可进一步鉴别酚类物质的种类及结构[16]。植物黄酮类化合物亦属于植物多酚，以C6-C3-C6 结构为基础，包括黄酮、黄酮醇、黄烷酮（二氢黄酮）、异黄酮、查耳酮等，可溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯等有极溶剂，可用简单的显色反应对其种类进行初步鉴定[17]。本试验从醇溶组分中萃取得到的4 个组分中还含有一定的糖类物质，经硅胶G 薄层层析鉴定主要为蔗糖、 多糖和少量的葡萄糖，且对醇溶组分进行黄酮显色反应鉴定，其所含黄酮类物质主要为黄酮和异黄酮。
综合以上试验结果，本试验研制的果蔬发酵汁具有一定增强T/B 淋巴细胞增殖的能力。通过对果蔬发酵汁进行萃取，得到水溶组分和醇溶组分，醇溶组分中按照溶剂极性大小又分离得到氯仿相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相。通过对小鼠脾淋巴细胞作用的比较，得到最佳功效组分为正丁醇相，其所占果蔬发酵汁干物质比例为11.33%。本试验果蔬发酵汁来源于17 种果蔬，造成发酵汁成分复杂，分析困难，试验通过对发酵汁进行萃取，可以进一步缩小分析范围或者只是单纯的纯化酚类物质，后期可通过多酚黄酮的显色反应结合原料中所含成分和高效液相色谱法进一步去推测正丁醇相中所含物质。通过最佳组分含量鉴定，可以进一步研究其来源，筛选原料及工艺，得到具有更好功效的果蔬发酵产品。
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Studies on the Effect of Compound Fermented Fruit and Vegetable Juice on Murine’s Splenocytes in Vitro