茶油是我国一种具有保健功能的植物油脂，对高血压、心脏病等疾病有很好的预防作用，拥有广大的发展前景[1]。茶油富含长链甘油三酯，在体内消化吸收慢。为克服这一缺陷，将长链的甘油三酯（LCT）结合到中链的甘油三酯（MCT）分子上，得到的中长链结构酯（MLCT）不仅具备MCT 消化吸收快的特点，还兼具LCT 的优势。MLCT[2]是一种天然油脂经结构重组或改性而得到的具有特殊营养功效或生理功能的油脂[3-5]，目前被美国、日本等国家运用于食品强化剂、家庭食用油、婴幼食品等食品工业领域[6-7]，然而，MLCT 不溶于水的特性，使其在水相中的应用上受到一定的阻碍。
近几年来，纳米乳液在食品工业中的应用得到极大的发展。其作为传输系统，可以改善亲脂性物质的水溶性、稳定性等，而且可使功能性物质在人体内得到更好的吸收。制备乳液的方法有高能乳化法和低能乳化法。超声乳化技术作为高能乳化的一种，具有成本低、时间短、乳化得到的粒径小等优点[8-11]。吐温80 是一种小分子的乳化剂，相对于大分子的乳化剂而言，吸附到油水界面的速率快，制备的纳米乳液粒径更小[12]。
因体内试验具有费时及成本高的弊端，故大量的学者倾向于成本低、效率高的体外试验。通过模拟，可以测定不同类型的脂质在胃、肠消化中发生的化学及结构的变化[13]。pH-stat 法是模拟脂肪在小肠内消化常用的方法，用滴定消耗碱的量来确定脂肪被酶水解后释放脂肪酸的量[14]。Dahan等[15]用pH-stat 法对中链和长链的甘油三酯进行体外消化的比较。本文以吐温80 为乳化剂，通过超声乳化技术制备中长链结构酯纳米乳液，对乳液稳定性进行分析，并对其体外消化进行研究，为中长链结构酯纳米乳液应用于食品工业及其他行业上提供技术支持。
茶油，江西赣森食品有限公司；樟树籽油，溶剂法提取；Lipozyme RM IM（酶活150 IU/g），丹麦诺维信公司；胰脂肪酶，BR 级，美国Sigma 公司；胃蛋白酶，BR 级，美国Sigma 公司；吐温80 食品级，氯化钠、盐酸、氢氧化钠、胆盐、无水氯化钙等均为分析纯，天津市大茂化学试剂厂。
AR1140 电子分析天平，美国奥豪斯贸易公司；SHA-C 恒温磁力搅拌器，金坛市荣华仪器制造有限公司；GA92-IIDA 型超声波细胞粉碎机，无锡市上佳生物科技有限公司；Nano-ZS90 粒度分析仪，英国马尔文公司；CX31 电子显微镜，日本东京Olympus 有限公司。
1.2.1 酶法合成中长链结构酯 精确称取物质的量比1∶1 的樟树籽油与茶油50 g，置于具塞锥形瓶中。加入10% wt 的固定化RMIM 脂肪酶，锥形瓶中充入氮气而后密封，将其放入恒温磁力搅拌器，保持温度60 ℃，转速200 r/min 条件下反应3 h。终止反应，过滤除去固定化脂肪酶。滤液低温下保存以备分析。
1.2.2 中长链结构酯纳米乳液制备 将乳化剂吐温80 加入油相（中长链结构酯）中，油相水相分别加热至75 ℃；在普通搅拌条件下将油相加入水相制备粗乳液，转速为600 r/min，搅拌冷却至40℃，超声乳化形成纳米乳液。
1.2.3 单因素试验
1.2.3.1 超声时间对纳米乳液平均粒径的影响油相质量分数为6%，吐温80 质量分数为3%，乳化温度75 ℃条件下制备粗乳液。在功率分别为200，400，600，800，1 000 W 的超声条件下反应15 min。测定所制备纳米乳液的平均粒径。
1.2.3.2 超声功率对纳米乳液平均粒径的影响油相质量分数为6%，吐温80 质量分数为3%，乳化温度75 ℃条件下制备粗乳液。在超声功率400 W 的超声条件下超声时间分别为5，10，15，20，30 min。测定所制备纳米乳液的平均粒径。
1.2.3.3 油相质量分数对纳米乳液平均粒径的影响 乳化剂质量分数为3%，分别添加质量分数为4%，6%，8%，10%，12%的油相至水相中，乳化温度为75 ℃，超声频率400 W，超声时间15 min。测定所制备纳米乳液的平均粒径。
1.2.3.4 乳化剂质量分数对纳米乳液平均粒径的影响 油相质量分数10%，乳化剂质量分数分别为1%，2%，3%，4%，5%，乳化温度75 ℃，超声频率400 W，超声时间15 min。测定所制备纳米乳液的平均粒径。
1.2.4 响应面试验设计 根据单因素试验，选取三因素三水平，以平均粒径为响应值进行响应面分析。
1.2.5 稳定性考察
1.2.5.1 pH 值稳定性 乳化剂质量分数为3%，油相质量分数为6%，将乳化温度75 ℃，超声功率400 W，超声时间15 min 条件下制备的纳米乳液分装于4 支试管中，分别调pH 至3.0，5.0，7.0，9.0于室温条件下测定纳米乳液的平均粒径及电位。
1.2.5.2 储藏稳定性 将制备的纳米乳液于常温下放置7，15，30，60 d 测定纳米乳液的平均粒径和电位。
1.2.6 模拟胃肠液体外消化 为考察茶油纳米乳液及中长链结构酯纳米乳液的生物利用情况，用优化所得最佳条件制备茶油及中长链结构酯纳米乳液，在Liu[16]和Garrett[17]等人研究方法的基础上，模拟其体外胃肠消化过程，同时测定不同阶段的电位及粒径。
胃液消化过程如下：首先配制模拟胃液，7 mL HCl，2 g NaCl 和3.2 g 胃蛋白酶混合，定容至1 L。通过1.0 mol/L 的 HCl 调节胃液pH 值为1.2。取5 mL 的纳米乳液于100 mL 烧杯中，加入15 mL 的胃液，调节pH 稳定在1.2，在37 ℃磁力搅拌条件下，250 r/min 搅拌2 h。
肠液消化过程如下：取胃液消化后的液体10 mL，依次加入4 mL 48.5 mg/mL胆盐，1 L 750 mmol/L 氯化钙溶液，5 mL 12 mg/mL 胰脂肪酶。混合均匀；以0.05 mol/L 的NaOH 调节体系的pH至7.0，模拟肠液消化过程。在此过程中，通过加入0.01 mol/L 的NaOH 来维持体系pH 维持在7.0。记录不同时间段消耗NaOH 的体积，以计算游离脂肪酸的释放率。整个肠液消化过程维持在常温条件下，磁力搅拌转速为250 r/min，搅拌时间2 h。
1.2.6.1 粒径和电位分析 为避免多重散射带来的干扰，将制备的中长链结构酯纳米乳液用去离子水稀释100 倍。采用Nano-ZS90 粒度分析仪于常温下测定纳米乳液的电位和粒径。
1.2.6.2 乳液微观形态的观察 将制备的乳液原样及胃液肠液消化后的液体，取少量于载玻片上，盖上盖玻片，用光学显微镜观察其微观形态，并拍照。放大倍数400 倍。
1.2.7 脂肪酸释放率的测定 在模拟肠液消化过程中，中长链结构脂在胰脂肪酶的作用下不断被水解成为游离脂肪酸，在此过程中，一分子的甘油三酯，水解成为一分子的甘油一酯和两分子的游
离脂肪酸 （如下反应式所示）。因此，通过消耗NaOH 的体积，可计算出体系中结构脂水解后释放出游离脂肪酸（FFAs）的量。
m——样品中中长链结构酯的总质量（g）；M——中长链结构酯的平均分子质量（g/mol）；C——滴定消耗NaOH 溶液的浓度（mol/L）；V——消化t 时所消耗NaOH 的体积（L）。
在不同的超声功率，超声时间，乳化剂质量分数和油相质量分数条件下制备中长链甘油酯纳米乳液，其对乳液粒径的影响如图1。
图1 超声功率、超声时间、乳化剂质量分数及油相的质量分数对纳米乳液平均粒径的影响
Fig.1 Effects of ultrasound powers，ultrasound process time，emulsifier content and oil content on the particle size of nano-emulsions
2.1.1 超声功率对乳液粒径的影响 图1a为超声功率对纳米乳液平均粒径的影响。当超声功率为400 W 时有最小粒径110.3 nm，随着超声功率的增加，平均粒径呈现先减小后增加的趋势。超声辐射乳液的聚合源于空化效应，存在一个最佳功率值，超声的强度越大，分散作用增强，强烈的剪切作用形成更小的液滴。但过大时，增加了粒子间相互碰撞的可能性，更容易聚集而使粒径增大[17]。
2.1.2 超声时间对乳液粒径的影响 图1b为超声时间对纳米乳液平均粒径的影响。随着超声时间的增加，平均粒径减小。这与Vaiyapuri 等[18]的研究一致。但超声时间的延长会造成能耗及成本增加，故选择15～20 min 最佳。
2.1.3 乳化剂质量分数对乳液粒径的影响 图1c为乳化剂质量分数对纳米乳液平均粒径的影响。乳化剂质量分数为3%时，有最小平均粒径87.37 nm。平均粒径随着乳化剂质量分数的增加呈现先减后增的趋势。当乳化剂的质量分数较低时，没有足量的乳化剂来乳化油滴，所以粒径较大。而乳化剂质量分数超过3%时，乳化剂过量，多余的乳化剂吸附于液滴表面，导致乳液粒径的增加[19]。
2.1.4 油相质量分数对乳液粒径的影响 图1d为油相质量分数对纳米乳液平均粒径的影响。当油相质量分数为6%时有最小平均粒径87.37 nm。随着油相质量分数的增加，纳米乳液的粒径先减小后增加。陈冬等用超声制备姜油纳米乳液也有类似的趋势[20]。
根据单因素试验结果，选取超声时间15 min，以超声功率，乳化剂质量分数以及油相质量分数3 个指标为自变量，平均粒径为响应值进行三因素三水平的响应面优化试验。因素水平设计表如表1所示。
试验设计与结果如表2所示，利用Design Expert 8.0 软件对结果进行分析，得到回归模型方程（A，B，C 分别表示超声功率、油相质量分数、乳化剂质量分数），系数方差分析如表3所示。
R=82.14+2.50A+0.40B+4.10C+10.37AB+7.12AC+15.75A2+22.25B2+11.75C2 该回归模型P＜0.05，说明模型显著。而失拟项不显著（P＞0.05）；说明该方程有良好的模拟性，可用于优化本试验的设计，以确定所制备乳液的最佳平均粒径。从表4的数据可知，A2、B2、AB （P＜0.01）差异极显著，AC、C2（P＜0.05）差异显著。3 个因素对乳液平均粒径的影响从小到大依次为超声功率，乳化剂的质量分数，油相质量分数。
表1 因素水平设计表
Table 1 The design of factors and levels in the response surface
编码 超声功率/W 油相质量分数/%乳化剂质量分数/%-1 200 4 2 0 400 6 3 1 600 8 4
表2 响应面优化试验设计与结果
Table 2 Response surface design and results
试验序号 A B C 平均粒径/nm 试验序号 A B C 平均粒径/nm 1 0 0 1 92 10 0 -1 0 102 2 1 1 167 11 1 -1 1 130 3 -1 -1 1 135 12 -1 -1 -1 142 4 -1 0 0 98 13 -1 1 1 118 5 1 0 0 92 14 0 0 0 82 6 0 0 -1 90 15 0 0 0 87 7 1 -1 -1 121 16 0 0 0 89 8 1 1 -1 128 17 0 1 0 101 1 9 -1 1 -1 120
表3 回归模型系数方差分析
Table 3 Results of ANOVA of regression model coefficient
来源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值模型 8 506.06 8 1 063.26 18.57 0.0002** 显著A-A 62.5 1 62.5 1.09 0.3267 B-B 1.6 1 1.6 0.028 0.8714 C-C 168.1 1 168.1 2.94 0.125 AB 861.13 1 861.13 15.04 0.0047**AC 406.13 1 406.13 7.09 0.0287*BC 153.12 1 153.12 3.52 0.1029 A2 664.92 1 664.92 11.61 0.0093**B2 1 326.81 1 1 326.81 23.17 0.0013**
（续表3）
注：* 表示差异影响显著（P≤0.05），** 表示差异影响极显著（P≤0.01）。
来源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值C2 370.13 1 370.13 6.46 0.0346*残差 458.06 8 57.26失拟项 432.06 6 72.01 5.54 0.1608 不显著纯误差 26 2 13总方差 8 964.12 16
在上述模型的基础上，以某个因素为零水平，考察另外两个因素对乳液粒径的影响，得到的三维响应面图如图2所示。利用Expert 8.0 软件进行优化，优化的结果为：超声功率400 W，乳化剂含量3%，油含量6%。预测该条件下得到的平均粒径为82 nm。进行验证试验，得到的平均粒径为85 nm±1.43 nm。
图2 超声功率、油含量与乳化剂含量对乳液粒径的影响
Fig.2 Effects of ultrasonic power，oil content and emulsifier content on the average size in nano-emulsions
2.3.1 pH 稳定性 pH 值对纳米乳液平均粒径和电位的影响分别如图3a、图3b所示。当pH 在3～9范围内，吐温作为乳化剂制备的中长链酯纳米乳液的平均粒径基本保持不变，电位变化不显著（P＞0.05），因为吐温80 作为非离子型乳化剂的一种，受pH 的影响很小。这与Hsu 等[21]的研究一致，表明制备的乳液具有良好的pH 稳定性，可用于酸性或碱性食品的开发。
图3 pH 值对纳米乳液平均粒径和Zata 电位的影响
Fig.3 Effects of pH on the paticle size and Zata potential of nano-emulsion
图4 不同储藏时间对纳米乳液平均粒径和Zata 电位的影响
Fig.4 Effects of different storage times on the paticle size and Zata potential of nano-emulsion
2.3.2 储藏稳定性 将制备的中长链酯纳米乳液于常温下放至7，14，21，28 d。测定平均粒径及电位的变化如图4a、图4b所示。随着储藏时间的延长，乳液的粒径有略微增加，但变化不显著（P＞0.05）。由于时间越长，粒子间相互碰撞的几率增大，导致粒子的聚合，平均粒径有所增加[18]。而电位随着储藏时间的延长，变化不显著（P＞0.05）。电位是表明乳液稳定性的一个常见指标，电位绝对值越大，表明两个相同电荷的粒子间相互作用越强，排斥力越大，粒子更不容易聚合，则稳定性越好[22]。粒径电位变化不显著说明乳液具有良好的储藏稳定性，有利于运用到以后的应用中。
2.4.1 乳液经体外消化后的稳定性及微观结构乳液经过模拟胃肠消化后的微观结构及平均粒径、电位的变化如图5和图6所示。纳米乳液经过模拟胃液消化后粒径并没有明显的变化。乳液之所以可以在胃液作用后稳定存在，可能是因为吐温分子的聚氧基头部基团提供的强静电作用。吐温80 是一种非离子型的乳化剂，分子中含有亲水头部，具有高的表面活性。Nik 等[23]的研究也表明非离子型的乳化剂制备的乳液可以在胃酸作用的条件下稳定存在。经过肠液消化之后粒径明显增加，由于脂肪酸，胆盐等大量的表面活性物质的存在，取代了体系中最初吸附于液滴表面的吐温80。导致整个体系的稳定性遭到了破坏，使得乳液的粒径相应增加。而茶油制备的乳液与中长链结构酯纳米乳液相比具有更大的粒径，更小的电位绝对值，无论是在消化前还是消化后。这与徐俊杰等人[24]的研究结果一致。不同链长的油脂具有不同的物理化学性质，从而影响其体内的消化[25]。对影响脂质消化吸收因素的不断研究，使食品工业能够设计生产出控制脂肪消化吸收的食物，对人体健康及疾病控制有重要意义。
图5 模拟胃肠消化后平均粒径和电位的变化
Fig.5 Changes of particle size and Zata potential after simulated digestion
图6 模拟胃肠消化后乳液的微观结构
Fig.6 The microstructure of emulsion after simulated digestion
2.4.2 消化过程中脂肪酸释放率变化 图7为模拟小肠消化的2 h 内，游离脂肪酸的释放率随时间的变化情况。在前15 min，脂肪酸的释放率快速上升，15 min 后上升的幅度变缓。最后趋于稳定。Yan Li 等[26]的研究有类似的趋势。中长链结构酯纳米乳液与茶油纳米乳液相比有更快的消化速率，且最终释放率为70.58%。结构酯消化水解是一种界面反应，不同粒径大小的乳液与脂酶有不同的接触表面积[27]。由于中长链结构酯纳米乳液具有更小的初始粒径，结构酯与脂酶的接触表面积更大，则消化速率更快。
图7 脂肪酸释放曲线
Fig.7 Free fatty acids released curve
超声制备中长链结构酯纳米乳液，通过响应面试验得到制备的最优条件为超声功率400 W，乳化剂的含量3%，中长链甘油酯的含量6%，所得纳米乳液的平均粒径为85 nm±1.43 nm。制备的乳液具有良好的pH 稳定性和储藏稳定性。与茶油乳液相比具有更快的消化速率。是一种极具潜力的功能油脂纳米乳液。下一步研究工作将对中长链酯纳米乳液的功能特性进行研究。通过体内试验，研究其与茶油相比对于心血管以及脂代谢相关疾病预防的优势。
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