图1 提取温度对SIME 得率的影响
Fig.1 Effects of temperature on extraction of SIME
鱿鱼（Todarodes pacificus）属软体动物门，头足纲，二鳃亚纲，十腕目，枪乌贼科动物，也称枪乌贼、柔鱼。近年来，鱿鱼捕捞已成为我国海洋渔业的重要组成部分，2014年我国鱿鱼捕捞量达37.4727 万t[1]。鱿鱼加工是我国水产加工业的主要组成部分，鱿鱼可食部分约占总体重的80%。其加工过程中鱿鱼皮、鱿鱼墨囊、肝脏等副产物往往被废弃或加工成低值饲料，造成严重的资源浪费和环境污染。鱿鱼墨囊约占总体重的1.3%，主要化学成分是黑色素和蛋白多糖复合体[2-3]。虽然有关于鱿鱼墨的研究及应用近十年才有报道，但乌贼墨的应用历史却甚为悠久，早在唐代陈藏器的《本草拾遗》中便对乌贼墨有味涩，入心经，活血化瘀，凉血止血的描述[4]。鱿鱼墨成分和乌贼墨十分相似[5]。近年来，鱿鱼墨抗肿瘤、抗溃疡、提高免疫力等活性也逐渐被报道[6-9]。另外，鱿鱼在远洋深海生活，本身受到的污染较少，因此鱿鱼墨极具开发潜力。目前鱿鱼墨的综合利用成为废弃物高值化利用的研究热点。
黑色素是生物体中广泛存在的保护性色素。随着黑色食品如黑芝麻、乌骨鸡、黑木耳等食物潜在的抗氧化、抗衰老等功效的报道，黑色素引起人们浓厚的兴趣，天然黑色素的研究和应用日益增多[10-12]。相比其它动植物组织中黑色素的研究，鱿鱼墨黑色素的研究相对较少，且主要集中在结构和理化性质上，而对其生物活性的研究鲜见报道。鱿鱼墨多肽能抑制DU-145、PC-3 细胞增殖[13]，而鱿鱼黑色素对肿瘤细胞的作用未见报道，仅有少量其免疫活性、 自由基清除活性等方面的报道[14-18]。其提取分离方法不同会导致活性差异，目前黑色素的提取、 分离方法主要有水洗法、 酶解法、酸水解法、碱水解法及超声法[19]。本文采用酸碱法提取黑色素提取物（SIME），在此基础上，以人肺腺癌细胞系A549 为对象，通过研究细胞增殖及细胞迁移能力等方面探讨SIME 对A549 细胞的影响，以期为鱿鱼墨高值化利用提供理论依据。
北太平洋鱿鱼墨囊由中国水产舟山海洋渔业公司提供，在-18 ℃冻藏。使用时4 ℃下解冻，挤压丢弃表皮膜与内部的网状膜即得鱿鱼墨。
试验所用试剂氢氧化钠、 盐酸、 二甲基亚砜（DMSO）等均为国产分析纯，国药集团化学试剂有限公司；四甲基偶氮唑盐（MTT），购于美国Sigma公司。RPMI-1640 培养基，美国HyClone 公司；胎牛血清（FBS），美国Gibco 公司；吖啶橙，北京Solarbio 公司；胰蛋白酶，北京全式金生物技术有限公司；A549 细胞，购于中科院上海细胞生物学研究所细胞库。
试验所用主要设备与仪器：5804R 高速离心机，德国Eppendorf；5430R 小型高速离心机，德国Eppendorf；MCO-15AC CO2 培养箱，日本SANYO；荧光倒置显微镜，日本Nikon；Infinite 200 PRO 多功能酶标仪，瑞士Tecan；UV-1700 紫外-可见分光光度计，日本岛津。
1.2.1 鱿鱼墨黑色素的提取 称取一定量鱿鱼墨，按不同料液比加入不同浓度NaOH 溶液，在一定温度下提取一定时间后，离心（10 000 r/min，10 min），沉淀继续按上述操作提取2 次。合并上清液，用浓盐酸调pH 至2.0，静置12 h 后离心（10 000 r/min，10 min）取沉淀，沉淀水洗3 次后冷冻干燥即得鱿鱼墨黑色素提取物。SIME 得率（mg/g）=SIME 质量/原料质量。
1.2.1.1 浸提温度对SIME 提取的影响 料液比1∶40，提取时间1 h，NaOH 溶液浓度1 mol/L，提取温度分别为60，70，80，90，100 ℃进行提取。每组试验设3 个平行组，取平均值。
1.2.1.2 浸提时间对SIME 提取的影响 料液比1∶40，提取温度100 ℃，NaOH 溶液浓度1 mol/L，提取时间分别为0.5，1，1.5，2，2.5 h 进行提取。每组试验设3 个平行组，取平均值。
1.2.1.3 料液比对SIME 提取的影响 提取温度100 ℃，提取时间1 h，NaOH 溶液浓度1 mol/L，料液比分别为1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60 进行提取。每组试验设3 个平行组，取平均值。
1.2.1.4 碱液浓度对SIME 提取的影响 料液比1∶40，提取温度100 ℃，提取时间1 h，NaOH 溶液浓度分别为0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mol/L 进行提取。每组试验设3 个平行组，取平均值。
1.2.1.5 SIME 提取条件的确定 根据料液比、浸提温度、 浸提时间、 碱液浓度对SIME 提取的影响，进行L9（34）正交试验。
1.2.2 细胞培养 无菌条件下，把A549 细胞接种到装有适量RPMI-1640 培养液（含10%FBS）的培养瓶，并放于37 ℃、5% CO2 培养箱中培养，每天换液。待细胞覆盖率达到80%～90%时，用适量0.25%胰酶消化，取1∶4 比例进行传代，继续培养。
1.2.3 吖啶橙荧光染色观察SIME 对A549 细胞的作用 取对数生长期的细胞，经消化分散制备单细胞悬液，调整细胞密度，以每孔4×104 个的细胞密度接种于12 孔板，每孔加入细胞悬液2 mL，然后放入37 ℃、5% CO2 培养箱培养。培养24 h待细胞贴壁后，分别加入质量浓度为0，0.5，1 mg/mL 的SIME 样液0.5 mL。继续培养72 h 后，吸弃上清液，用PBS（pH 7.4）清洗3 次。常温避光，每孔加入0.5 mL 吖啶橙溶液（0.1 mg/mL）进行染色，然后在荧光倒置显微镜下观察。
1.2.4 SIME 对A549 细胞增殖率的影响 采用MTT 法[20]。取对数生长期的细胞，经消化分散制备单细胞悬液，调整细胞密度，以每孔3×103 个的细胞密度接种于96 孔板，每孔加入细胞悬液100 L，然后放入37 ℃、5% CO2 培养箱培养。培养24 h待细胞贴壁后，分别加入浓度梯度为0，0.125，0.25，0.5，0.75，1 mg/mL 的SIP 样液，继续培养48 h 及72 h 后，每孔加入20 L MTT 溶液（5 mg/mL），4 h 后3 000 r/min 离心10 min，吸弃孔中上清液，每孔加入100 L DMSO，振荡均匀。490 nm 波长下，置酶标仪上测定各孔吸光值。细胞增殖抑制率=（1-OD样品/OD空白）×100%
1.2.5 SIME 对A549 细胞迁移能力的影响 采用石惠等[21]的方法。取对数生长期的细胞，经消化分散制备单细胞悬液，调整细胞密度，以每孔1.5×105 个的细胞密度接种于24 孔板，待细胞长满时，用20 L 的小枪头在每孔中划一条直线，吸弃孔中培养液后用PBS 清洗3 次，更换新鲜培养液，并分别加入不同剂量的SIME，培养24 h 后拍照。
1.2.6 数据处理 采用Excel 进行统计分析，并计算标准偏差。
由图1可知，提取温度对SIME 的提取有较大的影响，得率随浸提温度升高而增加，这可能是由于黑色素本身的物化性质，在试验温度范围内随着提取温度的增强其在碱液中的溶解能力也随之越强。图2表明，SIME 得率随浸提时间的延长而增加，1.5 h 后得率增加缓慢，长时间浸提延长样品提取周期，且处理时间过长还可能会对黑色素造成破坏，因此浸提时间选择1.5 h 以内较为合适。由图3可知，SIME 得率随料液比增加而增加，料液比1∶40 之后，得率略有下降，这可能是由于随着料液比的增加，黑色素的浸出总量并没有明显增加，导致提取液中的黑色素浓度下降，致使黑色素在酸沉过程中沉降不完全，从而导致得率略有降低，同时，料液比的增加会大大增加试验工作量，因此，料液比的选择以不超过1∶40 较为合适。由图4可知，当碱浓度小于1.0 mol/L 时，SIME 得率随碱浓度增加而增加，但碱浓度过高时，SIME得率随碱浓度增加而急剧下降，这可能是由于黑色素与蛋白质、脂类等物质以结合形式存在，碱浓度过高对蛋白质及脂类物质造成较大影响，从而影响黑色素的提取，同时，碱浓度增加可能会导致碱溶性杂质的增加，且在进行酸沉时会导致酸的用量加大，从而影响黑色素酸沉的效率，故碱浓度为1.0 mol/L 较合适。
图1 提取温度对SIME 得率的影响
Fig.1 Effects of temperature on extraction of SIME
图2 提取时间对SIME 得率的影响
Fig.2 Effects of time on extraction of SIME
图3 料液比对SIME 得率的影响
Fig.3 Effects of material-liquid ratio on extraction of SIME
图4 碱液浓度对SIME 得率的影响
Fig.4 Effects of alkali concentration on extraction of SIME
根据各因素对SIME 得率的影响，设计L9（34）正交试验（表1）。根据正交试验的结果（表2）可知，影响SIME 提取效果的因素依次为：碱浓度＞提取时间＞提取温度＞料液比；SIME 提取的最佳条件为A3B3C1D2，即提取温度100 ℃，提取时间1.5 h，料液比1∶30，碱液浓度1.0 mol/L，在此条件下SIME 得率为20.13%。
SIME 作用A549 细胞72 h 后，经吖啶橙染色，荧光倒置显微镜下观察发现，空白组细胞数量较多，状态良好，细胞呈长梭形或多角形，胞质饱满，相邻细胞生长融合成片。加入SIME 后，细胞数量和形态都发生了变化，当质量浓度为0.5 mg/mL 时，A549 细胞数量减少，细胞质部分收缩，出现明显树突结构；当质量浓度达到1 mg/mL 时，细胞数量骤减，细胞质收缩，出现固缩的圆形结构。结果表明，SIME 对A549 细胞生长具有抑制作用，且伴随一定浓度效应。
表1 L9（34）正交试验因素与水平设置表
Table 1 Factors and levels of L9（34）orthogonal test
水平 因素温度（A）/℃ 时间（B）/h 料液比（C） 碱浓度（D）/mol·L-1 80 0.5 1∶30 0.5 2 90 1.0 1∶40 1.0 3 100 1.5 1∶50 1.5 1
表2 L9（34）正交试验结果表
Table 2 The results of L9（34）orthogonal test
试验号 因素 得率/%A B C D 1 9.25 2 1 2 2 2 16.94 1 1 1 1 3 16.29 4 2 1 2 3 14.96 1 3 3 3 5 13.07 6 2 3 1 2 19.23 2 2 3 1 7 16.51 8 3 2 1 3 18.14 3 1 3 2 9 3 3 2 1 14.68 k1 42.48 40.72 46.62 37.00 k2 47.26 48.15 46.58 52.68 k3 49.33 50.20 45.87 49.39 K1 14.16 13.57 15.54 12.33 K2 15.75 16.05 15.53 17.56 K3 16.44 16.73 15.29 16.46 R 2.28 3.18 0.25 5.23
图5 SIME 对A549 细胞的影响
Fig.5 Effects of SIME on A549 cells
注：A：0 mg/mL；B：0.5 mg/mL；C：1 mg/mL。
由图6可知，SIME 可抑制A549 细胞生长，且呈一定量效和时效关系，作用相同时间下，SIME对A549 细胞的生长抑制效果随SIME 浓度增加而增强，SIME 浓度相同时，随着所用时间的延长，SIME 对A549 细胞的抑制作用增强。作用48 h后，SIME 质量浓度0.5 mg/mL 时，其对A549 细胞的增殖抑制率为27.81%，质量浓度为1 mg/mL时，抑制率达79.94%。作用72 h 后，SIME 质量浓度0.25 mg/mL 时，对细胞的增殖抑制率为42.93%，远高于48 h 时的18.17%。
通过划痕试验观察SIME 对A549 细胞非定向迁移的影响，结果如图7所示。空白组细胞经24 h 生长后，细胞迁移距离较大，划痕宽度明显变窄，而SIME 作用下，经24 h 生长后，细胞迁移距离远小于空白组细胞，划痕仅略微变窄。结果表明，SIME 具有抑制细胞非定向迁移的作用。
图6 SIME 对A549 细胞增殖率的影响
Fig.6 Effects of SIME on proliferation rate of A549 cells
图7 SIME 对A549 细胞迁移能力的影响
Fig.7 Effects of SIME on A549 cells migration
黑色素广泛存在于动植物体内，其基础结构是一些共价交联的吲哚环，根据产生前体不同可分为：真黑色素、棕黑色素和神经元黑色素三类。鱿鱼墨黑色素属于典型的真黑色素，虽然目前已有一些研究涉及其提取制备[22-26]，但不同的提取分离方法对黑色素得率、 纯度及生物活性均有较大的影响。高速离心法操作简单，不影响其生物活性，但只能去除墨汁中水溶性杂质，且所得黑色素纯度不高；酸、碱水解法制备所得黑色素虽然纯度较高，但过程中酸碱作用下剧烈水解，会破坏黑色素结构完整性，研究表明，强酸水解会导致黑色素脱羧基，且容易使蛋白转变成类色素物，而强碱处理会导致黑色素与蛋白质发生作用；而酶解法处理相对温和，不会破坏黑色素结构，但无法去除不被酶解的杂质，且成本较高，条件苛刻。刘显威等[26]利用黑色素碱溶酸沉的特性来提取鱿鱼墨黑色素，此方法所得黑色素纯度较高，且结构和表面形态未受破坏，得率为16.69%。本试验亦利用此特性制备SIME，提取条件有别于前人的研究，最优条件下SIME 得率为20.13%，略高于刘显威等人报道。这不仅与提取工艺有关，还可能受鱿鱼品种、原料含水量等因素影响。不仅提取方法可能会影响黑色素的结构，导致活性差异，干燥方法同样会影响黑色素的聚集方式，也可能会影响黑色素的溶解性及生物活性。目前制备黑色素的干燥方法主要有真空冷冻干燥、减压干燥、喷雾干燥等，本试验采用真空冷冻干燥法。本试验未对SIME进一步精制即进行活性研究，而纯度也可能会影响其活性，因此后期需对SIME 提取物进一步精制，以便于更全面地研究黑色素活性及其作用机制。
关于SIME 生物活性的研究报道较少，陈士国等[14-15]研究发现SIME 具有较高的清除自由基能力，能显著提高机体免疫功能，甄天元、雷敏等[16-18] 也证实了SIME 能有效改善免疫低下模型小鼠的免疫调节机能，具有增强机体抗氧化能力、延缓衰老的功效。本试验以A549 为研究对象，探讨SIME 对肺癌细胞的影响。结果表明，SIME 对A549 的增殖具有较好的抑制作用，且伴随一定剂量与时间效应。SIME 作用细胞48 h 时，半数抑制浓度（IC50）为0.747 mg/mL，作用72 h 时，IC50 为0.396 mg/mL，随着SIME 作用时间的延长，SIME对细胞的抑制效果增加明显。吕留庄等[27]研究表明蓝莓总花青素作用对A549 细胞活力有明显抑制作用，作用72 h 后，IC50 值为176.652 g/mL，其作用效果优于SIME；戴关海等[28]报道3.13 mg/mL 杨梅醇作用A549 细胞48 h 后，细胞存活率约50%，其对A549 细胞的抑制作用也远远优于SIME。虽然SIME 对肿瘤细胞的作用未见报道，但鱿鱼墨多肽对肿瘤细胞的作用曾被研究，李丽等[13]试验表明鱿鱼墨多肽能抑制DU-145 和PC-3 细胞增殖，并诱导其细胞凋亡。SIME 对A549 细胞作用机制及其对其他肿瘤细胞的作用效果均有待进一步研究。
肿瘤转移是一个复杂的过程，降低肿瘤细胞迁移能力是抑制肿瘤转移的关键。本试验通过划痕试验发现，SIME 能有效抑制A549 细胞的迁移。肿瘤细胞的转移受多因素、多步骤调控，研究表明MMP-2 和MMP-9 的表达水平与肺癌的转移密切相关。赵若琳等[29]试验表明桔梗皂苷D 抑制A549细胞粘附、 侵袭、 迁移与下调MMP-2、MMP-9 mRNA、 蛋白表达及抑制其上游ERK 信号通路和p-Akt 表达有关。SIME 对A549 细胞迁移的抑制作用机制尚有待进一步研究，同时，MMP-2 和MMP-9 表达受多个上游信号通路调控，信号中的关键靶蛋白及其对应的靶基因也有待更深入的研究。
本试验对鱿鱼加工下脚料墨囊进行利用，提取制备SIME，并探讨SIME 对A549 细胞增殖及细胞迁移的影响。试验结果为鱿鱼墨等海洋资源加工副产物高值化利用提供了途径，同时也为进一步探讨黑色素生物活性及作用机制提供了一定参考。
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Extraction of Melanin from Squid Ink and Its Effects on A549 Cells