大肠杆菌（E.coli）O157：H7 是肠出血性大肠杆菌中最常见的血清型，也是其多种血清型中最主要的致病菌株，感染剂量低于5 CFU[1-2]。感染该菌可使人患腹泻、出血性结肠炎（hemorhabic colitis，HC），还可引发溶血性尿毒综合征（hemolytic uremic syndrome，HUS）及血栓性血小板减少紫癜（thrombotic thrombocytopenic purpura，TTP）等严重并发症，致死率达5%～10%[3]。自1983年美国Riley 等[4]首次报道肠出血性大肠杆菌O157：H7以来，相继在英国、加拿大、日本、德国等多国出现爆发性流行病例。我国自1986年江苏徐州市首次报道大肠杆菌O157：H7 感染以来，广西、海南、广东等地都先后出现并分离到大肠杆菌O157：H7[5]。在世界范围内，家畜及其肉制品是大肠杆菌O157：H7 主要的传播途径，其中鸡、牛、猪等是该菌主要感染对象[6]。如何快速检测食品尤其是肉类食品中污染的大肠杆菌O157：H7，是有效防控大肠杆菌O157：H7 食源性疾病爆发的必要条件。
目前检测大肠杆菌O157：H7 的方法主要有传统分离培养、免疫学和分子生物学检测[7-9]。这些方法在不同的检测要求下都有各自的优点，也都存在不足，比如耗费时间长，操作过程繁琐及检测灵敏度低等。环介导等温扩增技术自2000年日本科学家Notomi 发明以来[10]，因其可在等温条件下数十分钟内完成核酸的高倍扩增，从而成为继PCR 技术之后又一新型快速、 简便的分子生物学检测技术。目前各国研究人员在此基础上发展出多种病原菌的LAMP 检测方法，比如副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis）[11]、沙门氏菌[12]、人乳头瘤病毒（HPV16）[13]、副溶血性弧菌[14]等。与PCR 等其它方法相比，LAMP 有独特的优点，如在等温条件下即可完成扩增反应，反应时间短 （40～60 min），灵敏度较高，反应温度较低（60～65 ℃），甚至可肉眼直接判断反应结果[15]。
许多研究表明，食品中存在多种水溶性DNA聚合酶抑制剂，会干扰PCR 等分子生物学方法检测食品中致病菌。活性炭是一种具有较大表面积、复杂孔隙结构的物质，具有良好的吸附性能，可以用来消减干扰PCR 聚合酶活性的抑制剂[16]。由于活性炭同时能吸附细菌，所以需对其表面进行适当封闭，从而防止细菌被吸附。据文献[17]报道，使用蒙脱石封闭的活性炭可以消减食品中抑制剂，不影响食品中细菌的回收。
Midori Green 是一种新型的核酸荧光染料，具有灵敏性高，毒性低，安全性好的优点，而利用该染料进行实时荧光定量LAMP 法 （Rti-LAMP）的报道不多[18]。本研究采用Midori Green 为核酸染料，建立大肠杆菌O157：H7 的Rti-LAMP 检测技术；通过模拟鸡肉污染大肠杆菌O157：H7，建立基于Rti-LAMP 检测鸡肉样品中的大肠杆菌O157：H7 并与国标检测法进行对比。
大肠杆菌O157：H7 ATCC BAA-708 菌株，本实验室保存；鸡脯肉样品，市场购买；月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST）、EC 肉汤等，青岛高科园海博科技有限公司产品；胰蛋白酶大豆肉汤（TSB），美国Difco 公司；Bst DNA polymerse，新西兰Biolabs 公司；Midori Green，dNTPs，Bulldog Bio公司；2×Taq Master Mix，上海欣百诺生物科技有限公司；Whirl-Pak 均质过滤袋，美国Nasco 公司；八 连 管，BIO-RAD；Activated carbon （Filtrasorb 200），美国Calgon Carbon 公司。
拍击式均质机，AES chemuex 公司；紫外可见分光光度计（WFZ-UV-2100），尤尼科（上海）仪器有限公司；GL-21M 高速冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；XB-150B 全自动雪花制冰机，宁波新艺超声设备有限公司；凝胶成像系统，法国Vibler Lourmat 公司；电泳仪（EPS300）、电泳槽（VE-180），上海天能科技有限公司；荧光PCR 仪，CFX Connect Real-time System，BIORAD。
1.3.1 引物设计与合成 针对大肠杆菌 O157：H7 （VT2）基因，参考Hara-Kudo 等[19]设计了6 条特异性引物用于Rti-LAMP，包括两条内引物（FIP/BIP），两条外引物（F3/B3），两条环引物（Loop F/ Loop B），详见表1。引物由北京鼎国生物技术有限公司合成。
1.3.2 细菌培养、计数及细菌DNA 提取 将活化的大肠杆菌O157：H7 接种于3 mL TSB 液体培养基中，37 ℃，150 r/min 过夜培养16～18 h，以3%菌液量转接于10 mL TSB 液体培养基，37 ℃，150 r/min 培养1.5 h 左右至对数期细菌（OD600≈0.5）。将菌液用灭菌的生理盐水按10 倍梯度依次稀释，取100 μL 涂于平板，培养18～24 h 细菌计数，测定OD600 的数值，建立OD600 值与菌浓度的标准曲线。
细菌总DNA 制备，生理盐水稀释的细菌500 μL 加入500 μL 2×TZ 裂解液[20]，于99.5 ℃下加热10 min，冰上冷却后高速离心5 min，取上清即为细菌DNA 模板。
表1 LAMP 引物
Table 1 Primers used in the Rti-LAMP
引物 序列（5’～3’）FIP GCT-CTT-GAT-GCA-TCT-CTG-GTA-CAC-TCA-CTG-GTT-TCA-TCA-TAT-CTG-G BIP CTG-TCA-CAG-CAG-AAG-CCT-TAC-GGA-CGA-AAT-TCT-CCC-TGT-ATC-TGC-C F3 CAG-TTA-TAC-CAC-TCT-GCA-ACG-TG B3 CTG-ATT-CGC-CGC-CAG-TTC Loop F TGT-ATT-ACC-ACT-GAA-CTC-CAT-TAA-CG Loop B GGC-ATT-TCC-ACT-AAA-CTC-CAT-TAA-CG
1.3.3 Rti-LAMP 反应 Rti-LAMP 反应体系总体积 为25 μL：2.5 μL 10×buffer，5 μL 25 mmol/L MgCl2，2.5 μL 12.5 mmol/L dNTPs，2 μL 20 mmol/L FIP，2 μL 20 mmol/L BIP，0.4 μL 20 mmol/L F3，0.4 μL 20 mmol/L B3，1.2 μL 20 mmol/L Loop F，1.2 μL 20 mmol/L Loop B，1 μL 1 ∶500 稀释的荧光染料Midori Green，0.9 μL Bst 聚合酶，2 μL DNA 模板，无菌去离子水补足至25 μL。制备好的反应管放入BIO-RAD CFX Connect Real-time System 内65 ℃扩增反应60 min。每分钟读取荧光数值，设定样品荧光值出现指数增加的时间为Tp值（类似于Rti-PCR 的Ct 值）[21-22]，测定Tp 值与细菌浓度之间关系函数。
1.3.4 琼脂糖凝胶电泳 Rti-LAMP 产物上样于2%琼脂糖凝胶，将1 μL 的Midori Green 原液加入到20 mL 琼脂糖凝胶后进行电泳。电泳条件为：电压80 V，电流60 mA，时间35 min，取出置于凝胶成像系统拍照观察。
1.3.5 蒙脱石封闭活性炭（BCAC）的制备 16 g活性炭用蒸馏水冲洗至流水无色，放入烘箱烘干待用。取蒙脱石4 g 加蒸馏水200 mL，振荡摇匀至完全溶解，转移至250 mL 离心杯中室温下700 r/min，1 min，将上清液倒入加了上述活性炭的三角瓶中，37 ℃下150 r/min，振荡3 h。然后转移到55℃烘箱中烘干备用。
1.3.6 模拟大肠杆菌O157：H7 污染鸡肉样品 取25 g 经国标检测大肠杆菌O157：H7 阴性的鸡肉样品，置于装有75 mL PBS（50 mmol/L）缓冲液的Whirl-Pak 均质过滤袋中，加入生理盐水稀释至适宜浓度的大肠杆菌O157：H7 0.5 mL，以制备浓度为0，140，450，1 400，4 500，14 000，45 000 CFU/g的人工模拟污染样品，将均质袋置于均质机中，37℃下拍打1 min，随后放入37 ℃的水浴增菌4 h。样品过滤液转移至离心杯中，800 r/min 离心5 min，上清液通过含0.5 g 玻璃棉的灭菌注射器过滤，取过滤液用于样品中细菌DNA 的提取。
1.3.7 封闭活性炭对鸡肉样品前处理 模拟大肠杆菌O157：H7 污染鸡肉样品的步骤见1.3.6 节，但不经过增菌培养。滤液转移至离心杯中，10 000 r/min 离心5 min，除去上清，用30 mL PBS（50 mmol/L）缓冲液重悬，加入4 g 制备的BCAC，37℃150 r/min 振荡15 min，用含0.2 g 玻璃棉的灭菌注射器过滤，取过滤液用于样品中细菌DNA 的提取。
1.3.8 样品中细菌DNA 的提取 将过滤液于10 000 r/min 下离心5 min，弃上清，沉淀重悬于0.5 mL 生理盐水，加入等体积2×TZ 裂解液，混匀后于99.5 ℃下加热10 min，冰浴2 min 后12 000 r/min 离心10 min，上清即为样品DNA 模板，取2 μL 作为Rti-LAMP 反应模板。
1.3.9 临床鸡肉样品的对比检测 从市场上购买51 份冷冻鸡肉样品，利用增菌Rti-LAMP、封闭活性炭预处理未增菌的Rti-LAMP 和国标法（GB 4789.38-2012 食品安全国家标准食品微生物学检验），同时检测这些鸡肉样品中大肠杆菌O157：H7污染情况。
以大肠杆菌 O157：H7 裂解液为模板，结合Midori green 核酸荧光染料，通过设计的6 条特异性引物进行Rti-LAMP 反应，其结果显示阳性样品在30 min 之内出现荧光值呈指数增加，而阴性样品则没有荧光指数增加现象。为测定Rti-LAMP的灵敏度，设置了0，1.1，3.5，11，35，110，350 CFU/管，共7 个梯度，结果表明3.5 CFU/管可稳定扩增检出，低于该浓度则检出稳定性不够，故该Rti-LAMP 的检测灵敏度为3.5 CFU/管（图1）。以荧光值500 作为衡量各反应荧光指数增加出现的时间（Tp 值），以Tp 值为纵坐标，lg（CFU/管）为横坐标，则细菌CFU 与Tp 值之间的线性回归方程为Y=-2.1632X+22.655，决定系数R2=0.9896，表明在3.5～350 CFU/管范围内，其细菌浓度与其相应的Tp 值具有良好的线性关系，通过Rti-LAMP的Tp 值可实现定量检测大肠杆菌O157：H7（图1）。大肠杆菌O157：H7 的Rti-LAMP 扩增产物电泳图如图2所示，典型LAMP 扩增产物是一系列梯度的DNA 片段混合物，在电泳图上呈现出规律的梯状条带，表明本研究建立的Rti-LAMP 法检测大肠杆菌O157：H7 具有良好的特异性。
图1 典型Rti-LAMP 扩增大肠杆菌O157：H7 荧光曲线及Tp 值与lg（CFU/反应）的线性回归方程
Fig.1 Rti-LAMP plots and linear detection plot of E.coli O157：H7 derived from various numbers of log phase E.coli O157：H7 cells
为研究Rti-LAMP 检测鸡肉样品中大肠杆菌O157：H7 的灵敏度和特异性，本研究人工模拟大肠杆菌O157：H7 污染鸡肉样品，经37 ℃增菌4 h后，提取样品DNA 进行Rti-LAMP 检测。结果表明，Rti-LAMP 能稳定检测140 CFU/g 的样品，显示该方法检测灵敏度为140 CFU/g（图3），整个检测时间约为7 h。以Tp 值为纵坐标，lg（CFU/g）为横坐标，建立的线性回归方程为：Y=-3.9792X+31.218，决定系数R2=0.9504，表明本研究增菌前处理的Rti-LAMP 具有定量分析检测鸡肉样品中大肠杆菌O157：H7 的污染程度（图3）。如图4所示，扩增产物与纯菌扩增产物的电泳条带完全一致，说明该方法检测鸡肉中大肠杆菌O157：H7 特异性良好。
图2 Rti-LAMP 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图
Fig.2 Product of amplicons derived from Rti-LAMP reactions by agarose gel electrophoresis
图3 Rti-LAMP 检测模拟大肠杆菌O157：H7 污染的鸡肉样品的扩增曲线及Tp 值与lg（CFU/g）的线性函数
Fig.3 The fluorescence curves of the amplified products by Rti-LAMP and linear detection plot of E.coli O157：H7 derived from various numbers of seeded chicken
图4 模拟污染的鸡肉样品Rti-LAMP 扩增产物电泳图
Fig.4 Product of amplicons derived from Rti-LAMP reactions in samples filtrate of chicken by agarose gel electrophoresis
注：泳道M：DNA 标记；泳道0～6：0，140，450，1400，4500，14000，45000 CFU/g。
封闭活性炭的用量经本实验室优化[23]后，确定处理每份样品的用量为4 g。使用封闭活性炭处理人工模拟污染大肠杆菌O157：H7 的鸡肉样品，不经过增菌步骤，提取样品DNA 进行检测。结果表明，使用封闭活性炭处理后的Rti-LAMP 能稳定检测出12 CFU/g 的鸡肉样品（图5），表明经封闭活性炭预处理的Rti-LAMP 较增菌前处理的Rti-LAMP 检测灵敏度提高约10 倍。3 次重复试验，以Tp 平均值为纵坐标，lg（CFU/g）为横坐标，线性回归方程为：Y=-3.1888X+24.684，决定系数R2=0.9905，说明在12～4 000 CFU/g 范围内具有良好的可定量分析特性。
图5 经活性炭处理后Rti-LAMP 的扩增曲线及Tp 值与lg（CFU/g）的线性函数
Fig.5 The fluorescence curves of the amplified products by Rti-LAMP after activated carbon treated and linear detection plot of E.coli O157：H7 derived from various numbers of seeded chicken
使用上述建立的两种大肠杆菌O157：H7 的Rti-LAMP 方法和国标法进行对比检测分析，对市场上购买的51 份冷冻鸡肉样品进行大肠杆菌O157：H7 检测，检测结果见表2。结果表明，增菌前处理的Rti-LAMP 和国标法，均检测到1 份大肠杆菌O157：H7 阳性样品，且为同一份鸡肉样品；而使用封闭活性炭预处理的Rti-LAMP 法，还检测到另外7 份阳性样品（共8 份）。因此，本研究建立的鸡肉样品中大肠杆菌O157：H7 增菌前处理的Rti-LAMP 检测方法与国标法灵敏度相当，而使用封闭活性炭前处理的Rti-LAMP 检测方法则具有更高的检测灵敏度，且检测时间极大地缩短至4.5 h 左右。
表2 3 种检测方法对临床鸡肉样品中大肠杆菌O157：H7 的检测结果
Table 2 Three methods detected clinical chicken samples for E.coli O157：H7
*注：3 种方法均检测到此份临床鸡肉样品为大肠杆菌O157：H7 阳性。
临床鸡肉样品 阳性 阴性国标法 51 1* 50增菌前处理的Rti-LAMP 51 1* 50封闭活性炭前处理的Rti-LAMP 51 1*+7 43
为验证临床鸡肉样品大肠杆菌O157：H7 Rti-LAMP 检测的特异性，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳（图6），结果DNA 扩增条带与大肠杆菌O157：H7 纯菌扩增条带一致，表明本研究建立的Rti-LAMP 检测鸡肉样品中大肠杆菌O157：H7 具有良好的特异性。
图6 临床鸡肉样品Rti-LAMP 扩增产物电泳图
Fig.6 Detection of amplicons derived from Rti-LAMP reactions in clinical samples of chicken by agarose gel electrophoresis
注：泳道M：DNA 标记；泳道0：阴性对照；泳道1～6：样品1～6；泳道7：阳性对照
本研究根据大肠杆菌O157：H7 的VT2 基因设计了6 条特异性引物，结合Midori Green 新型核酸染料，建立了大肠杆菌O157：H7 的Rti-LAMP 检测方法，其中纯培养菌液灵敏度达到3.5 CFU/反应，模拟大肠杆菌O157：H7 污染的鸡肉样品中增菌前处理的Rti-LAMP 检测灵敏度为140 CFU/g，整个检测流程可在7 h 内完成；而经封闭活性炭前处理的Rti-LAMP 检测灵敏度为12 CFU/g，需时约4.5 h 左右。
检测的51 份临床鸡肉样品，增菌前处理的Rti-LAMP 方法和国标法检出率均为1.96%。据Zhang 等[5]对中国南方多个省市183 份鸡肉污染情况调查，结果大肠杆菌O157：H7 的阳性检出率为3.28%。这与本试验的检测结果大致相似，表明Rti-LAMP 与国标法具有相同的检测灵敏度，但Rti-LAMP 所需时间约7 h，可在一个工作日内完成，较国标法节省了时间和人力。
研究表明，由于食品成分的复杂性，其中存在着多种水溶性DNA 聚合酶抑制剂，对检测的灵敏度和稳定性产生很大的影响[16]。例如本研究中未经封闭活性炭处理的Rti-LAMP 对模拟污染的鸡肉样品进行检测，其线性函数的R2 系数较低（0.9504），显示食品组分中的抑制剂对扩增反应有一定的影响。本研究尝试使用蒙脱石封闭的活性炭进行前处理以消减抑制剂，结果表明经封闭的活性炭前处理人工模拟大肠杆菌O157：H7 污染的鸡肉样品，相比增菌但未使用封闭活性炭处理的Rti-LAMP 方法灵敏度提高了约10 倍。封闭活性炭前处理的Rti-LAMP 检出临床鸡肉样品8份大肠杆菌O157：H7 阳性，进一步说明该方法检测灵敏度确实有很大的提高，同时不需要增菌，极大地缩短检测至4.5 h。封闭活性炭前处理的Rti-LAMP 法检出鸡肉样品大肠杆菌O157：H7 高阳性率，推测可能的原因主要有两点：一是鸡肉中污染的大肠杆菌O157：H7 浓度并不低，但由于食品在加工储藏过程中会对细菌造成抑制和损伤，导致细菌活力降低甚至死亡，增菌培养时，损伤细菌不易生长繁殖，从而影响了国标法的检出率；但由于Rti-LAMP 法是对目标菌DNA 的扩增检测，损伤细菌其DNA 可以作为扩增模板；二是封闭活性炭消减鸡肉中可溶性抑制剂效果好，解除了抑制剂对DNA 聚合酶的抑制作用，从而极大地提高了Rti-LAMP 检测灵敏度。国家食品安全标准（GB 29921-2013）中规定，同一批次的5 份样品中大肠杆菌O157：H7 的检出率为0，说明对大肠杆菌O157：H7 有着严格的限定标准，所以严格控制大肠杆菌O157：H7 的检出对于保障食品安全具有重要意义。当然，本研究建立的Rti-LAMP 方法无法区别目标菌是死菌还是活菌，如何利用分子生物学方法进行鉴别，实现临床样品致病菌更精准的检测，仍需进一步研究。
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