近几十年，全球患糖尿病的人数增长速度加快。根据最新一项流行病学调查结果显示，中国大陆糖尿病患者总数估计为1.298 亿，中国成人糖尿病患病率高达12.8%，中国成人糖尿病前期比例高达35.2%[1]。在多相、多组分和多尺度同时存在的复杂食品体系中，食物组分之间的相互作用机制与糖尿病患者的糖代谢和血糖应答水平有着密不可分的关系。快消化淀粉含量在很大程度上决定餐后血糖应答，含有较高抗性淀粉或慢消化淀粉的食物属低血糖生成指数（GI）食品，可保证人体的餐后血糖稳定，改善餐后血糖负荷，增加人体对胰岛素的敏感性。食物组分间的相互作用及其对淀粉消化性的影响已成为国际食品科学界的研究热点。
淀粉与蛋白质是食物体系中的两大典型组分。基于淀粉和蛋白混合体系，国内外学者研究表明内源蛋白质和外源蛋白质均会对淀粉的消化酶解特性产生影响[2-3]。内源蛋白影响淀粉的消化，主要归因于内源蛋白可以附着在淀粉颗粒表面或者镶嵌在淀粉之中，阻碍淀粉酶对淀粉的酶解作用从而降低淀粉的消化率和预期血糖生成指数[4-6]。此外，淀粉-蛋白质的相互作用会导致血糖反应速率和淀粉消化率降低[7-8]。内源蛋白质可能阻碍酶在淀粉颗粒表面的催化活性[9]。外源蛋白对淀粉的体外消化性也有很大影响：外源蛋白在淀粉颗粒表面形成吸附或者包埋，进而降低酶对淀粉的接触和酶解[10-12]；蛋白与淀粉非共价结合降低了淀粉的消化性[13-14]；蛋白以非催化的方式与淀粉酶分子结合，抑制了酶对淀粉的催化酶解能力[15]。
Aravind 等[16]研究淀粉体外消化水解率的影响因素，即意大利面中硬质小麦淀粉和蛋白组成。研究表明，面筋蛋白、麦谷蛋白和高分子质量的麦谷蛋白亚基使面团更难被α-淀粉酶酶解，归因于三者使面团的结构更加致密强劲。与之形成对比的是，麦醇溶蛋白和低分子质量的麦谷蛋白亚基则使面团更容易被α-淀粉酶水解，归因于其通过二硫键的作用可以削弱面团的网络结构，使面团的结构更加疏松。前期的抑制动力学研究表明，小麦面筋蛋白对猪胰α-淀粉酶（Porcine pancreatic αamylase，PPA）存在较强的抑制作用，且属于混合型竞争性抑制[15]。面筋蛋白中有两个重要组分，分别为麦谷蛋白（Glutenin，Glu）（30%～40%）和麦醇溶蛋白（Gliadin，Gli）（40%～50%）[17]。面筋蛋白的混合型竞争性抑制作用可能归因于其中的不同蛋白组分，然而其对淀粉酶的抑制机制尚待明确。基于此，本文通过半抑制浓度（IC50）来研究面筋蛋白中麦谷蛋白和麦醇溶蛋白对PPA 的抑制活性。结合Dixon 方程和Cornish-Bowden 方程探究其抑制类型及抑制机理。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
玉米淀粉（食用级），杭州普罗星淀粉有限公司；无水乙醇、氢氧化钠、盐酸、碳酸钠，天津大茂化学试剂厂；PAHBAH、PBS 缓冲液、面筋蛋白、麦醇溶蛋白、猪胰α-淀粉酶，美国Sigma-Aldrich公司（≥1 000 units/mg）；其它试剂均为国产分析纯级。
1.2 设备与仪器
恒温水浴锅（HH-6 型），江苏环宇科学仪器厂；立式电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9420A 型），上海齐欣科学仪器有限公司；电子分析天平（FA2204 型），常州市衡正电子仪器有限公司；台式高速离心机（TG20-WSI），湘麓离心机仪器有限公司；磁力加热搅拌器（Hei-Tec），德国Heidolph公司；超声波清洗器（WD-9415B 型），上海齐欣科学仪器有限公司；紫外分光光度计（UV-3200），深圳市科力易翔仪器设备有限公司；水分测定仪（MA35），赛多利斯仪器系统有限公司。
1.3 方法
1.3.1 面筋蛋白中麦谷蛋白的分离 称取100 g面筋蛋白置于1 L 烧杯中，加入300 mL 蒸馏水溶解，搅拌混匀后加入α-淀粉酶溶液（Dry protein basis，1%），在60 ℃条件下水浴恒温反应1.5 h，酶解反应结束后冷却至室温。酶解液在4 000 r/min条件下离心20 min 以沉降蛋白质，除去上层水液。重复3 次离心，即可基本除去全部淀粉。取出沉降蛋白质，在低温条件下干燥后保存。称量已除淀粉的面筋蛋白100 g 于1 L 烧杯中，加入体积比为115∶25 的乙醇和异丙醇的混合溶液600 mL。用磁力加热搅拌器在60 ℃条件下搅拌4 h 后，用离心机在5 000 r/min 转速下离心20 min。取上清液旋转蒸发浓缩后，在30 ℃环境下干燥，完成后称量并保存。再用蒸馏水反复洗涤溶液沉淀后，进行冷冻干燥，完成后称量并保存[18]。
1.3.2 麦谷蛋白和麦醇溶蛋白对PPA 半抑制浓度（IC50）的测定 将20 mL PBS 缓冲液加入到50 mL 带盖离心管中，再加入准确称量的玉米淀粉，使溶液质量浓度为1 mg/mL，随后分别加入准确称取的麦谷蛋白/麦醇溶蛋白，淀粉和麦谷蛋白的质量比分别设定为：1∶2.5，1∶5，1∶10，1∶15 和1∶20。用涡旋机混匀后放入烧杯中100 ℃水浴，让淀粉糊化30 min 后取出，在室温冷却后置于37 ℃恒温水浴中进行磁力搅拌。准确移取1 mL PPA（3 U/mL）到离心管中，充分涡旋，置于37 ℃恒温水浴中进行酶解反应并准确计时。分别于4，8，12 min后，移取300 μL 酶解液到1.2 mL 0.3 mol/L 的Na2CO3 溶液中并充分涡旋混匀以终止酶解反应。在4 000×g 条件下将酶解液离心10 min，得到上清液。
上清液中的还原糖含量通过PAHBAH 的方法来测定。PAHBAH 显色剂的配制方法如下：首先用5 mL 0.5 mol/L 的HCl 溶液溶解250 mg PAHBAH，继续添加45 mL 0.5 mol/L NaOH 溶液，以保证PAHBAH 能够完全溶解，显色剂需要现配现用。100 μL 不同时间点的酶解液与1 mL 的PAHBAH 试剂混合，置于100 ℃水浴加热5 min，经冷却后在410 nm 波长处测定吸光度。采用麦芽糖溶液（0.01～0.9 mm，100 μL）来绘制标准曲线，以100 μL 去离子水作为对照。利用麦芽糖标准曲线将吸光度值转换为还原糖浓度。初始反应速度（v）由反应溶液中还原糖浓度与时间曲线的斜率决定，PPA 的抑制率I（%）按照公式（1）计算。
式中，v 和v0——存在和不存在蛋白质时的初始反应速度（mg/mL·min）。
绘制抑制率与抑制剂浓度的比值曲线。
式中，I——抑制剂质量浓度（mg/mL）；Imax——最大抑制百分比（%）。
运用SPSS 采用非线性回归方法拟合计算式（2），计算IC50，设置不同浓度条件下蛋白的抑制率为响应频率，蛋白浓度为协变量[19]。
1.3.3 麦谷蛋白和麦醇溶蛋白的PPA 抑制动力学试验 麦谷蛋白/麦醇溶蛋白的PPA 抑制动力学试验是通过设计不同浓度底物（煮熟的玉米淀粉）在不同浓度麦谷蛋白/麦醇溶蛋白中存在的情况下进行的。将10 mL PBS 缓冲液（pH 7.2）加入到50 mL 带盖离心管中，再准确称取适量的玉米淀粉和麦谷蛋白/麦醇溶蛋白加入离心管中，得到一系列的麦谷蛋白/麦醇溶蛋白溶液 （2.5～20 mg/mL）和玉米淀粉溶液（2.5～20 mg/mL）。待充分涡旋混匀后置于100 ℃的水浴锅中恒温水浴蒸煮糊化30 min，取出后在37 ℃水浴中以160 r/min 进行磁力搅拌。加入1 mL PPA（3 U/mL），充分涡旋，在恒定温度（37 ℃）水浴中进行酶解反应，并准确计时。分别于4，8，12 min 后，移取300 μL 的混合酶解液加入到装有1.2 mL 0.3 mol/L 的Na2CO3 的离心管中，充分涡旋混匀以终止酶解反应。5 000×g 离心10 min 以得到上清液。上清液中的还原糖含量用PAHBAH 的方法测定，参照1.3.2 节的方法。
运用Dixon 方程和Cornish-Bowden 方程来分析阐释蛋白质对PPA 的抑制机理和抑制类型。以时间为横坐标，还原糖含量为纵坐标得到的图像的斜率为初始反应速率（v）。
为了描述蛋白质对α-淀粉酶的抑制机理，采用Dixon 方程分析初始反应速度（v）与抑制剂浓度（i）的关系。以还原糖含量为纵坐标，时间为横坐标做图，通过斜率可以得到初始反应速率（v）。通过Dixon 方程计算Kic 和Kiu。
混合型抑制的Dixon 方程如式（3）。
式中，Vmax——最大初始速度 （mg/mL·min）；a——淀粉质量浓度 （mg/mL）；Km——米氏常数；i——抑制剂质量浓度（mg/mL）；v——初始反应速度（mg/mL·min）。
对Dixon 方程两边同时取倒数得式（4），通过多个淀粉浓度，可以推导出Kic=-i，即Kic 为不同淀粉底物浓度所对应的各条曲线的交点的横坐标绝对值。
通过多个淀粉浓度值绘制a/v 与i 的关系来建立Cornish-Bowden 图。
混合型抑制的Cornish-Bowden 方程如式（5）。
将方程两边同时取倒数如式 （6），Cornish-Bowden 方程可以绘制成以i 为横坐标，a/v 为纵坐标的线性图。使用上述计算方法，可以得出方程的Kiu=-i，式中Kiu 于不同淀粉底物浓度所对应的各条曲线的交点的横坐标绝对值。
2 结果与分析
2.1 麦醇溶蛋白和麦谷蛋白对PPA 的抑制作用
麦醇溶蛋白对PPA 抑制作用曲线如图1（a，c，e）所示。添加不同质量浓度的麦醇溶蛋白的体系与未添加蛋白的相对比，都可以降低淀粉酶的初始反应速率。同时，随着麦醇溶蛋白质量浓度的增加，淀粉酶的初始反应速率逐渐降低，抑制作用逐渐增强。不同质量比（1∶2.5，1∶5，1∶0，1∶15 和1∶20）的麦醇溶蛋白对PPA 的抑制率分别为：6.31%±1.96%，17.65%±1.05%，27.89%±2.46%，28.69%±0.978%和39.04%±0.811%。通过SPSS 软件进行回归得到麦醇溶蛋白的IC50 为 （33.193±0.621）mg/mL。
麦谷蛋白对PPA 抑制作用曲线如图1（b，d，f）所示。与麦醇溶蛋白出现相似的趋势，添加了不同质量浓度的麦谷蛋白的体系与未添加蛋白的相对比，均可以降低淀粉酶的初始反应速率。同时随着麦谷蛋白质量浓度的增加，淀粉酶的初始反应速率逐渐降低，抑制作用逐渐增强。淀粉和麦谷蛋白在不同质量比（1∶2.5，1∶5，1∶10，1∶15，1∶20）条件下的抑制率分别为：22.69%±2.15%，25.54%±2.35%，40.80%±4.31%，52.64%±1.35%和59.12%±0.186%。通过SPSS 软件进行回归得到麦谷的IC50 为（14.014±1.089）mg/mL。与麦醇溶蛋白相比，麦谷蛋白对PPA 表现出更强的抑制作用。
图1 特定浓度淀粉在不同质量浓度的蛋白抑制剂下的初始反应速率（a，b）；α-淀粉酶在不同质量浓度的蛋白抑制剂下的残留活性曲线（c，d）；在不同质量浓度的蛋白抑制剂下相同浓度的淀粉对α-淀粉酶下的抑制率（e，f）
Fig.1 Initial reaction velocity of corn starch with a given concentration at different mass concentrations of protein inhibitors （a，b）；Residual activity curves of PPA at different mass concentrations of protein inhibitors （c，d）；Inhibition of PPA on starch at different mass concentrations of protein inhibitors （e，f）
2.2 α-淀粉酶抑制动力学分析
麦谷蛋白和麦醇溶蛋白对PPA 抑制作用的反应曲线如图2和图3所示。在蛋白质质量浓度一定的条件下，增加底物淀粉的浓度，体系的反应速率也随之增加。与不含蛋白的体系相比，添加了不同质量浓度的麦谷蛋白和麦醇溶蛋白均可造成PPA 初始反应速率降低，即降低PPA 对淀粉的酶解速率。此外，淀粉酶对淀粉的初始反应速率随着添加麦谷蛋白和麦醇溶蛋白质量浓度增加而逐渐
图2 麦谷蛋白对PPA 抑制作用曲线
Fig.2 The inhibitory effect of glutenin from wheat on PPA
图3 麦醇溶蛋白对PPA 抑制作用曲线
Fig.3 The inhibitory effect of gliadin from wheat on PPA
降低，表明抑制作用在逐渐增强。
不同质量浓度的淀粉在不同蛋白浓度条件下的反应初始速率如图4所示。麦谷蛋白和麦醇溶蛋白对PPA 抑制的Dixon 方程和Cornish-Bowden方程如图5和6所示。麦谷蛋白和麦醇溶蛋白对PPA 抑制的Dixon 方程和Cornish-Bowden 方程特征值如表1所示。
图4 不同质量浓度的淀粉在不同质量浓度的麦谷蛋白（a）和麦醇溶蛋白（b）下的初始反应速率
Fig.4 Initial reaction velocity of starch with different mass concentrations in glutenin （a） and gliadin from wheat （b）with different mass concentrations
图5 麦谷蛋白（a）和麦醇溶蛋白（b）对PPA 抑制Dixon 方程
Fig.5 Dixon （insets） curves for PPA inhibition by glutenin （a） and gliadin from wheat （b）
图6 麦谷蛋白（a）和麦醇溶蛋白（b）对PPA 抑制Cornish-Bowden 方程
Fig.6 Cornish-Bowden （insets） curves for PPA inhibition by glutenin （a） and gliadin from wheat （b）
表1 麦谷蛋白和麦醇溶蛋白对PPA 抑制的Dixon 方程和Cornish-Bowden 方程特征值
Table 1 Characteristic value of Dixon and Cornish-Bowden equations for PPA inhibition by glutenin and gliadin from wheat
注：采用SPSS Statistics 26.0 进行Duncan's least significant test 方法分析，同列不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
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从麦谷蛋白的Dixon 方程和Cornish-Bowden方程可以看出有明显的交点，这就表明，麦谷蛋白对PPA 的抑制既有竞争性抑制又有反竞争性抑制，即其类型属于混合型竞争性抑制。经计算得到麦谷蛋白的竞争性抑制常数（Kic）为（20.533±3.582）mg/mL，其反竞争性抑制常数（Kiu）为（49.358±9.779）mg/mL（表1）。对于麦谷蛋白而言，竞争性抑制常数比反竞争性抑制常数小，表明相对于它与游离PPA 的结合，它与淀粉和PPA 形成的中间产物的结合要更为紧密[20-21]。
从麦醇溶蛋白的Dixon 方程图中可以看到有明显的交点，而Cornish-Bowden 方程则是显示相互平行的直线。因此表明，麦醇溶蛋白对PPA 的抑制作用类型属于竞争性抑制。经过公式计算得到麦醇溶蛋白的竞争性抑制常数（Kic）为（49.619±5.949）mg/mL（表1）。
2.3 抑制机理
抑制剂与酶结合，会抑制底物与酶的相互作用，从而对酶解反应产生竞争性抑制；抑制剂只能和底物与酶相互作用产生的中间产物结合形成三元复合物，从而形成反竞争性抑制。在混合型竞争抑制模型中，无论淀粉是否与酶结合，抑制剂都会与酶结合。
在本试验中，蛋白质对PPA 的抑制作用可能存在以下几种抑制机理。首先，蛋白质可能通过非共价作用力，包括氢键、共轭作用和疏水作用力等与PPA 发生相互作用。PPA 的活性位点（Asp197，Glu233 和Asp300） 可能会通过氢键能与蛋白质中含有的羟基结合[19]。蛋白中的C=O 双键能够通过电子云的离域来与苯环形成л-л 共轭增强共轭作用，可能改变酶的构象，使酶中的活性位点不能结合淀粉。因此，蛋白质对PPA 构成竞争性抑制作用。其次，推测酶中还可能存在二级碳水化合物结合位点（非活性位点），这些非活性位点远离，并会进一步与蛋白质结合。已被证实这两个非活性结合位点具有特殊的功能，能够加强酶对淀粉的水解[22]。当蛋白质发生变性之后可能与这些非活性位点结合，协同阻碍酶对淀粉的水解。再次，从反竞争性抑制的角度考虑，当淀粉与PPA相互结合后，可能会改变酶的空间构象，因此形成的淀粉酶-淀粉复合物会更易于与蛋白质的某些部位结合。
麦谷蛋白是由多个亚基通过二硫键相互结合而组成的非均质大分子聚合物，亚基包括高分子质量和低分子质量麦谷蛋白亚基，分子质量较大，约在十万到数百万之间[23]。而麦醇溶蛋白是一种单体蛋白，分子质量较小，约在30～80 ku 之间，分子间的相互作用力也较小，分子内通过氢键、疏水键和二硫键相互连接，形成比较紧凑的三维结构，没有亚基结构和肽链间二硫键[24]。麦谷蛋白经蒸煮后，蛋白分子展开，因各种分子间作用力即氢键、静电引力、二硫键、疏水作用等形成网络状结构，形成具有一定孔洞结构的凝胶[25-26]。蒸煮之后的麦谷蛋白结构变得松散，因而其内部的疏水性基团便暴露出来，从而增加了与猪胰α-淀粉酶相互作用的几率。而麦醇溶蛋白在蒸煮过程中，由于其热凝固性，变性后依然不易溶于水[27]。因此，蒸煮之后变性的麦谷蛋白更易与α-淀粉酶结合，即麦谷蛋白较麦醇溶蛋白对α-淀粉酶的抑制作用更强。
3 结论
本研究采用Dixon 方程和Cornish-Bowden 方程来探讨麦谷蛋白和麦醇溶蛋白对PPA 的抑制动力学。研究表明，麦谷蛋白对PPA 的抑制作用类型是混合型竞争性抑制，包括竞争性抑制和反竞争性抑制。麦谷蛋白与游离的PPA 的结合相对于蛋白质与淀粉和PPA 形成的中间产物的结合更加紧密。麦醇溶蛋白对PPA 的抑制作用属于竞争性抑制。麦谷蛋白和麦醇溶蛋白均可以抑制PPA 的活性，延缓淀粉的消化，且麦谷蛋白的抑制作用更强。这些研究结果对于碳水化合物限制饮食体系低GI 食品开发和以蛋白质为基础的功能食品的探究具有重要的实用价值。
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