大气等离子体是在大气环境下产生的气体放电现象，放电产生的电子温度虽高达上万度，但离子温度较低，整体上表现为室温，也称为低温等离子体[1-3]。大气等离子体内部含有大量的活性成分，如电子、离子、自由基、激发态粒子等，具有较高的氧化特性，可对食品表面的各类食源性有害微生物进行灭杀，是一种存在巨大应用潜力的食品冷杀菌技术[4-6]。Albertos 等[7]研究发现在70 kV、5 min 条件下采用介质阻挡放电处理鲱鱼，可以减少好氧菌属、假单胞菌属、肠杆菌属的存在水平，同时该处理对脂质氧化等品质指标没有显著影响。Kim 等[2]研究发现射频放电产生的活性氧可灭活牛肉干中的金黄葡萄球菌，且处理对牛肉干的颜色、剪切力、脂肪酸的含量没有显著影响。Jayasena 等[8]研究发现介质阻挡放电处理可显著降低猪肉中单增李斯特菌、沙门氏菌和大肠杆菌，长时间处理后对猪肉的颜色、感官评价产生负面影响。乔维维等[9]研究发现介质阻挡放电对牛肉的杀菌率达93%，而对牛肉的色泽没有较大的影响。由此可知，大气等离子体放电可有效灭杀食品表面的各类食源性有害微生物，在贮藏保鲜方面具有一定的优势，然而，大气等离子体中的活性成分是否对处理对象的品质造成不利影响，还有待验证。例如：介质阻挡放电会产生·OH、·O2－、H2O2、O3等多种具有强氧化性的活性自由基，可促进猪肉的脂质氧化[10]。此外，大气等离子体放电模式较多，如何在保障杀菌的同时降低对食品品质的影响，成为大气等离子体技术在冷杀菌领域应用的关键问题。
滑动弧放电作为大气等离子体放电中的一种放电模式，兼容了热等离子体和非热等离子体的特性[11-12]。相比介质阻挡放电、射频放电，滑动弧放电具有活性离子浓度高、处理面积大、抑菌效率高的特点[13-16]，有望突破大气等离子体技术在处理面积方面的应用瓶颈。例如作者前期研究中采用滑动弧放电等离子体处理鸡蛋表面，可有效降低沙门氏菌存活率，延长了鸡蛋的贮藏保鲜周期[17]，将滑动弧放电等离子体应用于预调理鸡丁贮藏保鲜，对鸡肉的杀菌率达96%，对其品质影响较小[18]。本研究采用滑动弧放电处理冷鲜猪肉，研究其对猪肉贮藏保鲜品质的影响，探究该放电模式在肉品保鲜中的可行性。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
大肠杆菌 O157：H7（Escherichia coli O157：H7） CICC 21530、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureeus，S.aureus）CICC 10001、单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）CICC 21529、沙门氏菌（Salmonella enterica subsp）CICC22956，中国工业微生物菌种保藏管理中心；平板计数琼脂（分析纯），北京陆桥技术股份有限公司；叔丁醇（分析纯），北京畅华志诚科技有限公司；盐酸、硼酸（均为分析纯），北京化工厂；氧化镁（分析纯），天津市津科精细化工研究所；氮气、氩气，北京市海科元昌实用气体有限责任公司；2-硫代巴比妥酸（生化试剂），国药集团化学试剂有限公司；猪里脊购于北京市昌平区北农市场。
1.2 仪器与设备
非热滑动弧放电处理器，实验室自制；E1010离子溅射仪、VFD-21S 冷冻干燥仪，日本日立公司；TESCAN5136 扫描电镜，捷克斯洛伐克公司；TU-1810 紫外-可见分光光度计，上海圣科仪器设备有限公司；CM-700d1 分光测色计，日本KONICA MINOLTA 公司；JB-CJ-2FCS 洁净工作台，苏州佳宝净化工程设备有限公司；SCIENTZ-11 无菌均质器，宁波新芝生物科技股份有限公司。
图1 滑动弧放电设备示意图
Fig.1 Schematic diagram of gliding arc discharge equipment
注：1.气瓶；2.气体流量测试表；3.陶瓷反应器；4.滑动弧放电；5.基台；6.电源。
1.3 方法
1.3.1 滑动弧放电杀菌 分别将活化好的二代大肠杆菌 O157：H7、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、沙门氏菌菌悬液离心得到菌泥。将菌泥均匀涂在无菌载玻片的表面，随后分别在不同气体等离子体放电下处理30 s。将处理后的载玻片分别用无菌生理盐水反复冲洗至无菌的离心管，混匀成菌悬液，待用。吸取1 mL 上述菌悬液用无菌生理盐水梯度稀释至10-6 梯度，吸取100 μL 10-6 梯度菌悬液至固体培养皿中，倒置放入恒温恒湿培养箱中37 ℃培养12～16 h，计数。
1.3.2 样品的处理 将猪肉去掉筋膜，切成质量为25 g、厚度为5 mm 的肉片，在无菌环境中分别用空气、氮气、氩气作为载气进行滑动弧放电处理，处理时间30 s 处理功率400 W，气体流量40 L/min。将处理后的猪肉用无菌保鲜袋包装，置于4 ℃环境下保存。随后测试其贮藏期菌落总数、红度值、挥发性盐基氮、丙二醛含量，并对猪肉表面进行形态观察及感官评价。
1.3.3 猪肉贮藏期菌落总数测定 按照国标GB 4789.2-2016《食品微生物菌落总数测定》[19]方法测定菌落总数。
1.3.4 感官评价 按照国标GB/T 9959.2-2008《分割冻、鲜猪瘦肉》[20]进行感官评价并略作修改。感官评价小组由食品专业的老师及同学共12 人组成，每2 d 取出1 组不同载气滑动弧放电处理前、后的猪肉，对其色泽、气味、弹性、黏度进行打分，总分为40 分。各项指标评分细则见表1。
表1 感官评价评分表
Table 1 Sensory evaluation scores
评分 色泽 气味 组织状态 黏度10 肌肉颜色鲜艳，有光泽 具有猪肉特有的气味，无异味 弹性好，手指按压后立即恢复 表面微湿润，不粘手8 肌肉颜色较鲜艳，有光泽 猪肉气味变淡，无异味 弹性较好，手指按压后可恢复 表面微干燥，不粘手6 肌肉颜色暗红，无光泽 稍有异味 弹性一般，手指按压后缓慢恢复 表面干燥，微粘手4 肌肉颜色暗红，无光泽 有异味 无弹性，手指按压后不能恢复 表面干燥，很粘手2 肌肉颜色呈褐色，无光泽 有强异味或出现腐臭味 弹性消失，手指按压后凹陷明显 表面出现黏液，很粘手
1.3.5 猪肉红度值的测定 用标准白板校正后的CM-700d1 分光测色计测定猪肉的红度值a* 值，每2 d 测试1 次，每个样品选取5 个部位测量，取平均值为最终结果。
1.3.6 挥发性盐基氮测定 参考国标GB 5009.228-2016《食品中挥发性盐基氮的测定》[21]，采用半微量凯氏定氮法测定TVB-N 值。
1.3.7 丙二醛含量的测定 参考国标GB 5009.181-2016《食品安全国家标准 食品中丙二醛的测定》[22]，采用分光光度法测定猪肉中的丙二醛含量。
1.3.8 猪肉表面形态观察 将肉样切割成肉片，尺寸（长×宽×厚）为5 cm×5 cm×5 mm，切割方向顺着肌纤维方向，随后进行滑动弧放电处理。往培养皿中倒入戊二醛（2.5%）固定液（覆盖样品表面即可）。将切割后的小片样品放入装有戊二醛的离心管中室温静置6 h，之后放入冰箱4 ℃保存12 h。将处理后的样品与未处理的样品离心，弃上清液，用磷酸盐缓冲溶液（PBS）洗涤3 次，取2.5%戊二醛固定液于离心管中（覆盖样品表面），在室温放置6 h 后4 ℃冰箱过夜保存。次日将样品用PBS漂洗3 次，每次10 min。乙醇梯度脱水：用体积分数10%，30%，50%，70%，90%，95%的乙醇各脱水1 次，无水乙醇脱水2 次，每次持续10 min。之后用叔丁醇洗脱置换3 次，每次20 min。加入少量叔丁醇覆盖样品即可，放入-20 ℃冻存20 min。快速取出样品，在真空冷冻干燥机干燥，次日喷金，扫描电镜观察。
1.4 数据处理
本试验采用SPSS 22.0 对数据进行方差分析，采用Duncan's 进行多重比较，差异显著的标准为P<0.05。用Origin 8.0 作图。
2 结果与分析
2.1 不同微生物的杀菌效果
大肠杆菌 O157：H7、金黄葡萄球菌、沙门氏菌、单增李斯特菌均是生鲜肉中具有代表性的食源性致病菌[23]。为了验证滑动弧放电对食源性致病微生物的杀菌效果，研究了滑动弧放电对上述冷鲜肉表面可能存在的微生物的杀菌效果。由图2可知，滑动弧放电处理后，大肠杆菌、金黄葡萄球菌、沙门氏菌、单增李斯特菌的菌落总数均减少。大肠杆菌通过空气、氮气、氩气放电处理后分别降低0.3，0.7，0.9 个对数值，金黄葡萄球菌分别降低0.2，0.5，0.9 个对数值，沙门氏菌分别降低0.2，0.5，0.8 个对数值，单增李斯特菌分别降低0.1，0.5，0.9 个对数值。不同气体对4 种菌的杀菌效果各不相同，且氩气放电处理后杀菌效果最佳，氮气次之，空气最差。滑动弧放电的杀菌效果是因不同气体放电产生的活性物质的种类与浓度不同而存在差异性[3]。相对于以介质阻挡放电和大气等离子体射流占主流的大气放电模式[24-25]，滑动弧放电等离子体可在较短时间产生明显的杀菌效果，在杀菌的时效性方面具有一定的优势，也预示其在冷鲜肉保鲜方面具有潜在的应用价值。
图2 不同载气处理后菌落总数的变化
Fig.2 The changes of the total number of colonies after different carrier gas treatment
2.2 菌落总数的影响
菌落总数是反应肉的腐败程度的重要指标，当肉中的菌落总数超过6.0 个对数值时，则超出国家标准[26-27]。为了进一步研究滑动弧放电等离子体对冷鲜肉表面菌落总数的影响，研究了不同贮藏时间及不同放电气体处理，对冷鲜肉微生物指标的影响。由图3可知，随着贮藏时间的延长，不同处理条件下肉中的菌落总数呈增加趋势。对照组菌落总数在贮藏第6 天超过6.0 个对数值，而经滑动弧放电处理，氩气放电后第10 天达到这个水平，氮气组第8 天，空气组第7 天，说明滑动弧放电处理可有效降低猪肉在贮藏期内的微生物含量，最高可降低1.2 个对数值，有效改善猪肉因微生物作用造成的品质变化，从而延长猪肉的贮藏保质期。等离子体具有较好的抑菌效果[28]，在新鲜食材的贮藏保鲜方面有一定的应用。例如大气等离子体可降低新鲜果皮、预调理鸡丁表面的各种有害微生物[29-30]。
图3 不同载气处理后猪肉贮藏期内菌落总数的变化
Fig.3 The changes of the total number of colonies with pork storage period under different carrier gas treatment
2.3 感官评价、红度值的影响
在猪肉贮藏期内，各组猪肉的感官评价分数逐渐降低，其中对照组分数下降最为明显，处理组的感官评价分数均普遍高于对照组 （P＜0.05），在色泽、气味、弹性和黏度方面具有明显的提升。等离子体中的活性物质浓度及种类存在较大差异，导致其对猪肉的处理效果存在较大不同，氩气放电产生的电子密度较高，离子温度较低[3]，对猪肉的处理效果更加明显，感官评价分数最高，其次为氮气组，最低为空气组。
红度值是直观判断肉的新鲜度指标，是消费者从感官上评价猪肉品质的重要指标，受氧合肌红蛋白和高铁肌红蛋白含量的影响，当血红蛋白氧化为高铁肌红蛋白时，肉的红度值降低[31]。由表2可知，各组猪肉的红度值随贮藏时间的延长逐渐降低，原因是猪肉中的血红蛋白不断氧化。相比对照组，滑动弧放电处理的样品红度值下降趋势减缓，氩气处理组减缓的幅度最大，氮气组次之，空气组最小。这可能是因为滑动电弧放电处理在一定程度上抑制了蛋白内源酶的活性，降低了血红肌红蛋白氧化为高铁肌红蛋白的速率，更好地维持了猪肉的色泽。Jung 等[32]采用介质阻挡放电处理猪肉糜，猪肉的红度值随放电时间的延长而显著增加，并且贮藏期内处理的猪肉的红度值下降趋势减缓，与本试验的结论一致。
表2 不同气体处理猪肉在贮藏期内的感官评价、红度值
Table 2 Sensory evaluation，redness of pork treated with different gases during storage period
注：不同小写字母表示在相同贮藏期不同处理条件下差异显著（P<0.05）。
性能指标 处理条件 贮藏时间/d 0 2 4 6 8 10感官评价 对照组 38.7±0.5a 35.2±0.5a 29.5±0.3a 24.3±0.6a 22.5±0.6a 20.6±0.7a空气组 39.8±0.6a 35.4±0.4a 30.5±0.5b 26.5±0.6b 24.5±0.7b 23.8±0.4b氮气组 39.2±0.3a 35.5±0.3a 32.5±0.2c 30.3±0.6c 29.1±0.4c 27.4±0.6c氩气组 39.5±0.4a 36.5±0.5b 33.1±0.3c 31.5±0.3d 30.9±0.6d 30.1±0.7d红度值 对照组 16.3±0.3a 13.8±0.3a 12.2±0.2a 11.3±0.2a 10.8±0.3a 10.0±0.2a空气组 16.5±0.4a 14.2±0.2a 12.8±0.3b 11.9±0.4b 11.1±0.3a 10.4±0.2a氮气组 16.2±0.2a 14.1±0.3a 13.0±0.3bc 12.2±0.2b 11.7±0.2b 10.8±0.3b氩气组 16.4±0.3a 14.5±0.1b 13.4±0.1c 12.8±0.3c 12.6±0.2c 12.5±0.3c
2.4 TVB-N 值的影响
挥发性盐基氮是评价猪肉新鲜度的重要指标，反映猪肉中蛋白质被分解为氨、胺类物质的含量，表示蛋白质的降解程度。由图4可知，随着贮藏期的延长，对照样品的TVB-N 值不断增加，经滑动弧放电处理的TVB-N 值均小于对照组 （P＜0.05），氩气组处理效果好于氮气组，空气组处理效果最弱。根据GB 2707-2016《食品安全国家标准 鲜（冻）畜、禽产品》[33]挥发性盐基氮≤15 mg/100 g，对照组在第6 天TVB-N 值为 （18.1±1.1）mg/100 g，超过国家标准，氩气处理组在第8 天仍低于国家标准。针对猪肉的蛋白质易发生降解，从而影响肉制品的加工特性及营养价值[32，34]，采用滑动弧放电处理降低了微生物含量，同时抑制了酶的活性[35]，减少蛋白质的降解，从而达到保鲜效果。黄明明等[36]研究发现通过介质阻挡放电处理牛肉，减少了微生物对蛋白质的分解，从而降低了牛肉的TVB-N 值，与本试验结论相符。
图4 不同载气处理猪肉在贮藏期内TVB-N 值的变化
Fig.4 The changes of TVB-N value of pork treated with different gases during storage period
2.5 MDA 值的影响
脂肪氧化会产生一些醛、酮类化合物，会产生不良风味，降低猪肉的品质[37-38]。MDA 值是猪肉脂肪氧化程度的重要指标，表示脂肪次级氧化产生丙二醛的含量。由图5可知，贮藏期内，猪肉中脂肪发生氧化，MDA 值不断增大。空气、氮气放电处理组的MDA 值均大于对照组，氩气放电处理的MDA 值低于对照组（P＜0.05）。等离子体因放电形式、放电气体种类、放电参数不同而产生的活性粒子的浓度与种类存在较大的差异，因此对肉的脂质氧化效果不同[39]。同理，滑动弧放电处理因活性粒子成分不同而对猪肉脂肪的氧化程度存在较大差异。对于猪肉的贮藏保鲜特性，氩气处理效果最佳。
图5 不同载气处理猪肉在贮藏期内MDA 值的变化
Fig.5 The changes of MDA value of pork treated with different carrier gas during storage period
2.6 表面形貌的影响
猪肉表面结构主要为结构蛋白与肌原纤维蛋白组成的网状结构。由图6可知，经空气和氮气放电处理后，猪肉的表面结构微孔尺寸有所扩大，网络结构有所降低，这可能是因为滑动弧放电产生的一定浓度的原子氧和NO[40]，这些具有氧化性的粒子促进了脂肪中不饱和脂肪酸的氧化、分解，导致其网络结构改变。其中空气、氮气放电产生较高浓度的原子氧和NO，因此空气、氮气放电处理后微孔尺寸扩大。相比其它气体放电处理，氩气放电处理对猪肉表面的影响较小，这可能是因为氩气放电等离子体的电子密度较高，主要活性成分为低浓度的羟基自由基，不足以对猪肉表面网状结构产生影响。通过猪肉的表面形态观察可知，滑动弧放电处理的猪肉脂肪氧化结果与图5一致。
图6 不同载气处理猪肉表面结构的影响（a.对照组；b.空气处理组；c.氮气处理组；d.氩气处理组）
Fig.6 Effect of different carrier gas on pork surface structure （a.control group，b.air treatment，c.nitrogen treatment，d.argon treatment）
3 结论
采用滑动弧放电等离子体对4 种生鲜肉中常见微生物进行杀菌处理，结果发现氩气杀菌效果最佳，氮气次之，空气最差。采用滑动弧放电对猪肉表面进行处理，比较不同放电气体处理下猪肉的感官特性、红度和脂肪氧化等外观和品质指标的变化。感官评价和红度测定结果表明，氩气处理评分最高，氮气次之，空气最低，然而均高于对照组。在抑菌效果方面，氩气放电处理可降低猪肉的菌落总数，最高可达1.2 个对数值，其次为氮气和空气。脂肪氧化和表面形貌测定结果表明，空气和氮气放电处理促进脂肪氧化，氩气处理可延缓猪肉的脂肪氧化程度。总之，滑动弧放电等离子体技术为猪肉贮藏保鲜提供一种新的处理方法。
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