咖啡作为世界三大饮料之一，咖啡的消费量一直在增加[1]。咖啡具有提神醒脑、消除疲劳、生津止渴、利尿等功效[2]。咖啡分阿拉比卡（Coffea arabica）、罗布斯塔（Coffea robusta）和利比里亚（Coffea liberica）三大原种，在中国称为小粒、中粒和大粒种咖啡[3]。阿拉比卡咖啡（Coffea arabica）是全球生产最常见的咖啡品种，占咖啡总产量的75%以上[4]。云南是我国小粒咖啡主产区，咖啡种植面积和产量均占到全国的98%以上，云南具有低纬度、高海拔、昼夜温差大等地理环境和气候条件，生产的咖啡具有浓而不苦，香而不烈，略带果酸味等特点[5]。
咖啡的品质取决于烘焙过程和工艺，起始烘焙温度通常在180～250 ℃之间[6]，咖啡中酸类物质（绿原酸、柠檬酸、苹果酸、乙酸、咖啡酰奎宁酸）、生物碱类（咖啡因、葫芦巴碱）、糖类、脂肪和蛋白质等发生不同程度的美拉德、Strecker 降解、焦糖化等反应，生成吡嗪类、呋喃类、吡咯类、吡喃类和吡啶类化合物，还有大量的醛类、酮类、酚类、酯类、醇类化合物，这些化合物形成咖啡的特征风味[7-10]。烘焙咖啡中丙烯酰胺、5-羟甲基糠醛（5-HMF） 和羧甲基赖氨酸等已成为威胁咖啡饮用的安全性问题之一[11-12]。普遍认为，5-HMF 是由于糖等碳水化合物加热分解所形成[13]，Hamzalolu 等[14]认为氨基酸、氨基酸-糖类混合物、维生素、多不饱和脂肪酸和类胡萝卜素在共同加热过程中也能形成少量的5-HMF。葡萄糖加热转化的呋喃果糖可以促进5-HMF 的形成，5-HMF 是咖啡烘焙过程中形成丙烯酰胺的重要中间体，二者含量呈负相关[15]。富含天门冬酰胺和葡萄糖的食品原料中，葡萄糖和天冬酰胺反应生成丙烯酰胺，进一步加热分解而生成5-HMF；葡萄糖可直接分解为5-HMF，天门冬酰胺和葡萄糖是形成丙烯酰胺及5-HMF 的共同前体反应物。同时，5-HMF 与天冬酰胺反应也能生成丙烯酰胺[16]。5-HMF 与丙烯酰胺呈拮抗作用[15]。5-HMF 是美拉德反应和焦糖化反应的强度指示标志，用来衡量小粒咖啡烘焙热加工过程中非酶促褐变的程度[17]。随着人们生活水平、健康意识不断提升，小粒咖啡的活性成分及其生理功能备受瞩目[5]。5-HMF 作为咖啡烘焙中美拉德反应危害伴生物之一，在高浓度下，对人体黏膜、横纹肌和内脏均具有刺激和损伤作用，具有基因毒性和遗传毒性[18-19]。
目前，对云南小粒咖啡的研究主要集中在生物活性物质、抗氧化功能及品质[20-23]方面，针对烘焙过程中5-HMF 形成研究较少。本文以小粒生咖啡为对象，开展烘焙温度、烘焙时间和烘焙方式对5-HMF 形成的影响，为优化小粒咖啡烘焙工艺和质量控制提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
铁皮卡、卡蒂姆和卡杜拉生咖啡豆，普洱市思茅区云南咖啡交易中心。烘焙咖啡豆粉碎后过60目筛，盛放于咖啡包装带中，封口备用。
试剂：甲醇、乙腈（HPLC 级），德国Merck 公司产品，正己烷、氯化钠、乙酸钠、无水硫酸镁、冰乙酸（AR 级），国药集团化学试剂有限公司；N-丙基乙二胺（PSA）粉末、C18 粉，上海安谱实验科技股份有限公司；实验用水由PURELAB flex 纯水机系统制得，英国埃尔格ELGALabWater 公司。
5-羟甲基糠醛（5-Hydroxymethylfurfural）标准品（≥99%），美国Sigma-aldrich 公司。
1.2 仪器与设备
Waters e2695-2489 高效液相色谱仪、在线脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱、2489 紫外检测器、Empower 3 色谱数据工作站，美国Waters 公司；Gene Cafe 3D 热风咖啡生豆烘焙机，韩国Genesis 公司；JJ200 电子分析天平，江苏省常熟市双杰测试仪器厂产品；KQ500-E 型超声清洗器，江苏省昆山市超声仪器有限公司产品；QL-861 漩涡混合器，江苏省海门市其林贝尔仪器制造有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 烘焙温度烘焙温度为180，200，220，240，250，260 ℃，烘焙时间为10 min，烘焙量为200 g，研究烘焙温度对小粒咖啡5-HMF 形成的影响。
1.3.2 烘焙时间 烘焙时间为6.0，8.0，10.0，12.0，14.0，16.0，20.0 min，烘焙温度为230 ℃，烘焙量为200 g，研究烘焙时间对小粒咖啡5-HMF形成的影响。
1.3.3 烘焙方式[24] 烘焙量为200 g，按表1的参数进行烘焙试验，研究不同烘焙方式对小粒咖啡中5-HMF 形成的影响。
表1 咖啡豆烘焙的8 种程度参数
Table 1 Parameters of eight roasting degree in roasted coffee
烘焙时间/min浅烘焙（Light roast） 230 12肉桂烘焙（Cinnamon roast） 235 12微中烘焙（Medium roast） 240 14浓度烘焙（High roast） 250 15城市烘焙（City roast） 250 17深城市烘焙（Full city roast） 250 19法式烘焙（French roast） 250 21意式烘焙（Italian roast） 250 23烘焙程度 烘焙温度/℃
1.4 标准溶液的配制
1.4.1 5-HMF 标准储备溶液 准确称取5-HMF 10 mg（精确到0.0001 g），于10 mL 容量瓶中，用甲醇溶液溶解并稀释至刻度，配制成质量浓度为1 000 mg/L 的5-HMF 标准储备溶液，-18 ℃以下避光贮存，有效期12 个月。
1.4.2 5-HMF 标准中间溶液 准确吸取1.0 mL 5-HMF 标准品储备溶液于10 mL 容量瓶中，用甲醇溶液稀释至刻度，配制成5-HMF 标准中间溶液。-18 ℃以下避光贮存，有效期3 个月。
1.4.3 5-HMF 标准工作溶液 分别吸取5-HMF标准中间溶液0.10，0.20，0.50，1.00，2.50 mL，于10 mL 容量瓶中，用初始流动相定容至刻度，配制成5-HMF 标准工作溶液。现配现用。
1.5 样品的前处理方法
称取粉碎过60 目筛的咖啡样品2 g （精确至0.01 g）于50 mL 离心管中，先加入5 mL 正己烷，超声提取15～20 min，依次加入10 mL 水、10 mL乙腈和0.1 mL 乙酸，旋涡提取3～5 min，最后加入盐析剂（3.0 g NaCl+1.0 g NaAc），去除正己烷，取乙腈溶液5 mL，加入净化剂 （50 mg C18 粉+20 mg PSA+200 mg MgSO4），旋涡提取3～5 min，以4 500 r/min 离心5 min 后，取2 mL 乙腈溶液过0.22 μm 滤膜，待测。
1.6 色谱检测条件
Shiseido CAPCELL PAK MG C18 色谱柱（150 mm×4.6 mm i.d.，5.0 μm）；柱温30.0 ℃；流动相A为甲醇，流动相B 为水，梯度洗脱程序：0～15 min，10%A，15～20.0 min，10%～60%A，20～25 min，60%～10%A，25～30 min，10%A；流速0.80 mL/min。进样量10.0 μL，检测波长284 nm。
1.7 数据处理
利用Excel 2010 软件对数据进行统计；采用SPSS 22.0 软件 Analyze 模块下的Compare Means 进行方差分析，结果表示为“平均值±标准差”，并进行Duncan's 差异显著性分析，P＜0.05 表示差异显著；通过Excel 2010 进行数据图表的绘制。
2 结果与分析
2.1 烘焙咖啡中5-HMF 含量分析
2.1.1 提取条件的优化 烘焙咖啡基质比较复杂，含有色素、脂肪、蛋白质以及糖类等化合物[25]，常用的净化方法有液液萃取法和固相萃取法，相关文献采用正己烷液液萃取法进行净化[26]，只能去除部分脂类，对咖啡中色素、其它脂类和糖类等杂质的去除效果较差。本试验对提取剂、盐析剂和净化剂进行了优化。结果显示，提取剂为1%乙酸-乙腈溶液，盐析剂为3.0 g NaCl+1.0 g NaAc，净化剂为50 mg C18+20 mg PSA+200 mg MgSO4 时，目标峰附近无杂质峰干扰，并且实现了基线分离（见图2），确定的前处理条件分离和净化效果较好，且5-HMF 回收率较好，达到90.6%以上，能够满足试验要求。
图1 5-羟甲基糠醛标准品HPLC 图
Fig.1 HPLC chromatogram of 5-hydroxymethylfurfural standard
图2 微中烘焙中5-HMF 的HPLC 色谱图
Fig.2 HPLC chromatogram of 5-hydroxymethylfurfural in medium roasting degree
注：a.铁皮卡空白；b.铁皮卡加标。
2.1.2 线性范围、检出限和定量限 用流动相配制质量浓度为0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0 mg/L 和50.0 mg/L 的5-HMF 标准工作溶液。在优化后的测定条件下进行测定，以5-HMF 的峰面积（y）对其质量浓度（x） 做工作曲线，5-HMF 在0.5～50.0 mg/L 范围内有良好的线性关系，相关系数（r）为0.9991。以5-HMF 色谱峰3 倍信噪比（S/N）计算检出限（LOD）为0.01 mg/kg，以5-HMF 色谱峰10倍信噪比（S/N）计算定量限（LOQ）为0.03 mg/kg（见表2）。
表2 线性范围、线性方程和相关系数
Table 2 Linear ranges，linear regression equation and correlation coefficient
分析物 线性范围ρ/mg·L-1 线性方程 相关系数（r） 检出限/mg·kg-1 定量限/μg·kg-1 5-HMF 0.50～50.0 y=37913x-3362.7 0.9991 0.01 0.03?
2.1.3 回收率与精密度 微中烘焙的铁皮卡、卡蒂姆和卡杜拉样品中进行低、中、高3 种质量分数（10，20，50 mg/kg）的5-HMF 加标回收试验，每个添加水平做5 组平行试验。5-HMF 的回收率为85.50%～105.5%，相对标准偏差（RSD）为4.28%～7.59%（见表3）。
表3 方法的回收率和精密度（n=5）
Table 3 Recovery and precision of the method （n=5）
微中烘焙本底值/mg·kg-1 添加量/mg·kg-1 测得量/mg·kg-1 回收率/% 相对标准偏差/%铁皮卡 11.70 10 20 50 20.25 30.57 59.52 85.50 94.35 95.64 4.66 5.32 4.35卡蒂姆 5.94 10 20 50 15.05 24.36 53.69 91.10 92.10 95.50 7.59 4.61 4.28卡杜拉 6.22 10 20 50 16.57 25.44 58.39 103.5 96.10 104.3 6.24 5.12 5.13
2.2 小粒咖啡烘焙时间和温度曲线
咖啡生豆本身没有香气，咖啡豆经过烘焙加热，酸类物质、生物碱类、多糖、脂肪和蛋白质等发生诸如焦糖反应、美拉德反应、降解等诸多物理化学以及生化变化，产生咖啡诱人香气和风味[27]，咖啡烘焙加热是一个同时具备传热和传质的复杂过程。本试验小粒咖啡在整个烘烤过程中，自动控温和翻转，以保证受热均匀。将处于室温的咖啡生豆倒入预热后的烘焙机滚筒中，滚筒内的温度会迅速且大幅下降，原先内部积聚的热量被咖啡生豆吸收并使水分蒸发，随咖啡豆表面水分的蒸发流失，咖啡豆表面温度先是趋稳，随即迅速爬升，并在4 min 后达到约115 ℃，随烘焙时间的延长，其烘焙温度呈现升高趋势。铁皮卡、卡蒂姆和卡杜拉的烘焙时间-温度曲线基本相同（图3）。
图3 咖啡的烘焙时间-温度曲线
Fig.3 Curve temperature-time of roasting coffee process
2.3 烘焙温度对5-HMF 形成的影响
烘焙温度对铁皮卡、卡蒂姆和卡杜拉中5-HMF 形成的影响如图4所示。
图4 不同烘焙温度对烘焙咖啡5-HMF 形成的影响
Fig.4 Effects of different roasting temperature on the formation of 5-hydroxymethylfurfural in roasted coffee
5-HMF 是美拉德反应和焦糖化反应过程中形成的中间产物，其产生受糖的种类、温度、pH值、水分活度、加热时间的影响[28]。图4显示，烘焙温度对小粒咖啡中5-HMF 的生成影响较大，温度为180～240 ℃，随烘焙温度的升高，美拉德反应产物5-HMF 的生成量逐渐增多，240 ℃时达到峰值，铁皮卡为 （28.50±0.15）mg/kg、卡蒂姆为（25.34±0.22）mg/kg、卡杜拉为（16.65±0.19）mg/kg。烘焙温度大于240 ℃，5-HMF 含量随温度的升高而显著下降，260 ℃烘焙10 min 后，5-HMF 含量小于0.05 mg/kg。意味着5-HMF 可通过更高温度的烘焙而减少，小粒咖啡烘焙过程中，温度对5-HMF 的影响较大，240 ℃以上高温能促进烘焙中形成的5-HMF 快速消解。
2.4 烘焙时间对5-HMF 形成的影响
图5显示，烘焙温度为230 ℃，烘焙时间在12 min 内，小粒咖啡的5-HMF 随烘焙时间延长，其含量逐渐增加，烘焙时间为12 min，铁皮卡含量为（27.03±0.27）mg/kg、卡蒂姆（25.10±0.13）mg/kg、卡杜拉（22.99±0.25）mg/kg；烘焙时间大于12.0 min，5-HMF 含量随烘焙时间的延长而显著下降；烘焙时间达到20.0 min，铁皮卡5-HMF 含量（0.315±0.12）mg/kg、卡蒂姆（0.363±0.21）mg/kg、卡杜拉（0.321±0.12）mg/kg，该结果与Kocadağli 等[13]结论一致。说明咖啡烘焙过程中，前期（12 min）加热能促进5-HMF 的生成，烘焙时间大于12 min，烘焙咖啡的5-HMF 明显降低直至消失，230 ℃烘焙20 min 后，其5-HMF 含量低于0.06 mg/kg，可能的原因是5-HMF 降解为有机酸[29]。
图5 不同烘焙时间对烘焙咖啡5-HMF 形成的影响
Fig.5 Effects of different roasting time on the formation of 5-hydroxymethylfurfural in roasted coffee
2.5 烘焙方式对5-HMF 形成的影响
烘焙程度对铁皮卡、卡蒂姆和卡杜拉中5-HMF 形成的影响见表4。
小粒咖啡在烘焙加热过程中，水分随温度升高而蒸发。咖啡豆水分降低，体积膨胀，同时发生诸多化学物理变化。随烘焙时间的延长，除水分蒸发，还有其它成分散失，使咖啡豆的质量减少[30]。表4结果显示，随烘焙程度增加，5-HMF 含量呈快速降低趋势，不同烘焙程度咖啡豆中5-HMF 含量差异显著（P＜0.05）。浅烘焙（230 ℃，12 min）和肉桂烘焙（235 ℃，12 min）的烘焙咖啡中，5-HMF含量分别为铁皮卡（30.53±0.45）mg/kg 和（36.76±0.33）mg/kg，卡蒂姆（25.71±0.32）mg/kg 和（18.28±0.41）mg/kg，卡杜拉（17.99±0.48）mg/kg 和（15.25±0.37）mg/kg；烘焙程度达到意式烘焙 （250 ℃，23 min），5-HMF 含量降到最低，铁皮卡（0.21±0.03）mg/kg，卡蒂姆（0.12±0.04）mg/kg，卡杜拉（0.15±0.03）mg/kg，5-HMF 降解率分别为99.31%，99.53%和99.17%。不同烘焙程度的小粒咖啡5-HMF 含量由大到小为浅烘焙＞肉桂烘焙＞微中烘焙＞浓度烘焙＞城市烘焙＞深城市烘焙＞法式烘焙＞意式烘焙。
表4 不同烘焙程度的烘焙咖啡5-HMF 含量（mg/kg）
Table 4 Content of 5-hydroxymethylfurfural of roasted coffee in different roasting degree （mg/kg）
注：不同字母表示烘焙方式间5-HMF 具有显著性差异（P＜0.05）。
烘焙程度 5-HMF 含量铁皮卡 卡蒂姆 卡杜拉浅烘焙 轻 轻 中度38.53±0.45a 25.71±0.32a 17.99±0.48a肉桂烘焙 36.76±0.33a 20.28±0.41a 15.25±0.37a微中烘焙 11.72±0.36b 5.91±0.27b 6.19±0.26b浓度烘焙 中度（微深） 4.18±0.24c 2.76±0.16c 3.66±0.21c城市烘焙 中度（深） 2.11±0.12c 0.99±0.14d 0.82±0.14d深城市烘焙 微深度 0.48±0.09d 0.35±0.12d 0.47±0.17d法式烘焙 深度（法式） 0.32±0.07d 0.29±0.09d 0.33±0.08d意式烘焙 中深度（意式） 0.21±0.03d 0.17±0.04d 0.18±0.03d
烘焙方式看：浅烘焙和肉桂烘焙属于轻度烘焙，烘焙温度和时间均未超过5-HMF 的降解要求，轻度烘焙可使咖啡中累积较高含量的5-HMF；其余烘焙方式在温度和时间上均达到使5-HMF 降解的要求，促进5-HMF 含量显著降低。不同咖啡烘焙方式的5-HMF 含量研究结果与温度和时间结果一致，因此，为控制或者消除咖啡中内源污染物5-HMF 的含量，在保证风味的前体下，可通过调控烘焙的温度和时间减少烘焙咖啡中5-HMF 的含量。
3 结论
采用QuEChERS 净化方法，以乙酸-乙腈溶液为提取剂，氯化钠和乙酸钠为盐析剂，C18 粉、PSA 和无水硫酸镁为净化剂，可实现咖啡中5-HMF 的提取、盐析和净化。QuEChERS 净化方法最佳试验条件：提取溶剂为1%乙酸-乙腈溶液，盐析剂为3.0 g NaCl+1.0 g NaAc，净化剂为50 mg C18+20 mg PSA+200 mg MgSO4，5-HMF 的回收率≥85.5%。5-HMF 在0.5～50.0 mg/L 范围内有良好的线性关系，相关系数（r）为0.9991，检出限为0.01 mg/kg，定量限为0.03 mg/kg，在10，20，50 mg/kg 添加水平的回收率为85.50%～105.5%，相对标准偏差为4.28%～7.59%（n=5）。
烘焙温度180～240 ℃，随烘焙温度升高，5-HMF 生成量逐渐增加，到240 ℃时达到峰值，烘焙温度大于240 ℃，急剧下降；烘焙温度为230 ℃，烘焙时间为6～12 min，5-HMF 生成量随烘焙时间延长而增加，烘焙时间为12.0 min，5-HMF 生成量达到最大值，烘焙时间大于12 min，5-HMF 含量显著降低；烘焙程度增加，5-HMF 含量显著降低。小粒咖啡的5-HMF 随烘焙温度、烘焙时间和烘焙程度的改变，是一个逐渐产生、达到峰值和急剧下降的动态变化过程，通过调整烘焙温度、时间来控制咖啡中5-HMF 的形成。
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