盐酸氯苯胍（Robenidine hydrochloride）作为一种抗球虫药，添加于饲料中，对治疗鸡、兔的急、慢性球虫病均有较好的效果[1-2]，在水产养殖中被允许用于治疗鱼类孢子虫病的国标渔药[3-5]。然而，盐酸氯苯胍长期使用会导致球虫产生严重的抗药性[6]。农业农村部、国家卫生健康委员会、国家市场监督管理总局三部门联合发布的GB 31650-2019《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》规定氯苯胍在鸡脂肪、皮以及其它可食组织中的最高残留限量分别为200，200，100 μg/kg[7]。盐酸小檗碱是黄连、黄柏的主要有效成分，具有泻火解毒、清热燥湿效用以及抗微生物和显著的抑菌作用，用于治疗由爱德华氏菌、弧菌等引起的养殖鱼类的出血病、腹水病等疾病[8]。过量使用盐酸小檗碱会导致便秘、皮疹、发热，甚至可能导致横纹肌溶解症及乳酸中毒症，引起B 族维生素吸收障碍，出现周围神经炎。为保障我国水产品质量安全以及消费者身体健康，促进水产品养殖行业的绿色、可持续发展，建立一种同时、快速测定鱼肉中盐酸氯苯胍和盐酸小檗碱残留分析的检测方法，对水产品的质量安全与相关风险监测工作具有重要意义。
目前，对动物源性食品中的兽药残留的定性与定量分析主要有酶联免疫吸附法（ELISA）、气相色谱-电子捕获检测法、电化学法、液相色谱质谱联用法等。ELISA 具有灵明度高、检测量大、步骤简单的特点，目前广泛用于水产品中兽药残留的快速检测。王强等[9]制备免疫原MT17-KLH 并获取特异性识别甲基睾酮的多克隆抗体，通过酶联免疫吸附法建立测定水产品中甲基睾酮的方法。气相色谱对于有机磷、有机氯等易挥发药物检测具有分离效能高、技术稳定成熟的优势。符靖雯等[10]通过HLB 小柱净化、气相色谱分离、电子捕获检测，成功分离并检测出11 种拟除虫菊酯类农药和3 种氯霉素类兽药。液-质谱联用法是目前最为广泛使用的一种高效、可靠、稳定的兽药残留检测方法[11-13]。孙丕等[14]建立液-质谱联用法测定水产品、禽畜肉、牛奶中7 种喹诺酮类药物的残留。殷平等[15]采用液相色谱-质谱同位素稀释法同时测定水产品中氯霉素、氟苯尼考、甲砜氯霉素3 种残留药物的方法。然而，液-质谱联用法的样品前处理复杂，需将样品进行提取、固相萃取净化、过膜去除大颗粒等步骤，存在操作步骤繁琐、耗时长这一弊端[16]。
本研究采用新型固相滤膜萃取 （Solid-phase and membrane based extraction，SPME），通过兼容性研究和条件优化，整合通过式固相萃取（PRiME）和微孔滤膜，具有快速、省时等特点。以固相滤膜萃取液相色谱-串联质谱法快速测定鱼肉中盐酸氯苯胍和盐酸小檗碱残留，旨在为研究盐酸小檗碱、盐酸氯苯胍在鱼肉体内的残留监测提供一种快速、有效的分析方法。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
市售鲫鱼、鲤鱼、草鱼，杭州城西物美超市。
盐酸氯苯胍，纯度≥98%，百灵威科技有限公司；盐酸小檗碱，纯度≥98%，阿拉丁试剂有限公司；甲醇、乙腈、甲酸（色谱纯级），美国TEDIA 公司；实验用水为电阻率18.2 MΩ·cm 的Milli-Q 高纯水，其余试剂均为分析纯级；固相滤膜萃取柱（500 mg，6 mL），实验室自制，向针头滤膜腔体填入PRiME 填料，并用筛板（或棉花）固定。
1.2 仪器与设备
液相色谱仪（Agilent 1200），美国Agilent 公司；三重四极杆质谱仪（4000 QTrap），美国AB Sciex 公司；高速离心机 （Allegra X-12），美国Beckman 公司；数控式恒温循环水浴槽（HD120-T8），英国Prima 公司；涡旋振荡器（Multi Reax），德国Heidolph 公司；Waters XSelect HSS T3 色谱柱（2.1 mm×150 mm，3.5 μm），美国Waters 公司。
1.3 标准溶液的配制
以甲醇为溶剂配制质量浓度为1 mg/mL 的盐酸氯苯胍和盐酸小檗碱混合标准储备液，临用时以空白鱼肉基质提取液将上述标准溶液稀释为混合标准工作液。
1.4 方法
1.4.1 样品的采集与制备 对活样品 （鲫鱼、鲤鱼、草鱼）通过放血、去鳞片去皮等步骤处理后，分别取鱼腹部和背部肌肉组织，用清水清洗并去除血污与泥沙后，吸除多余水分，分别将肌肉组织放入搅拌机中捣成匀浆状，置于-20 ℃冻藏保存备用。
1.4.2 样品前处理 准确称取鱼肉样品2.0 g（精确到0.1 g） 于50 mL 离心管中，加入5 mL 90%（体积分数）甲醇水溶液后将螺旋盖盖上，高速旋涡振荡5 min，并放置于80 ℃水浴加热20 min。取出离心管，于5 000 r/min 转速下离心5 min，转移全部上层清液于10 mL 容量瓶中。向离心管中继续加入4 mL 90%甲醇水溶液，重复上述提取步骤。合并2 次提取液，用90%甲醇水溶液定容到10 mL 备用。
使用一次性注射器将提取液上样至固相滤膜萃取柱，通过手动活塞加压，使样品以1 滴/s 的速度通过固相滤膜萃取柱，将流出液全部收集，在40 ℃下氮气吹干，以1 mL 甲醇复溶，上机检测。
1.4.3 液相色谱-质谱条件 液相条件：流动相为0.1%甲酸水溶液（A）和0.1%甲酸乙腈溶液（B）；梯度洗脱条件：初始5%B；0～3 min，5%～20%B；3～6 min，20%～80%B；6 ～8 min，80%～100%B；8 ～9 min，100%B；9～10 min，100%～5%B；流速：0.6 mL/min；进样量：5 μL；柱温保持30 ℃。
质谱条件：电喷雾离子源（ESI），正离子扫描，多反应离子检测模式（MRM），喷雾电压5.5 kV，干燥温度500 ℃，源内碰撞诱导解离气为氮气，气帘气25 psi，GS1 为40 psi，GS2 为50 psi。
2 结果与分析
2.1 固相滤膜萃取优化
传统的固相萃取和过膜整个试验步骤分为上样、淋洗、洗脱、过膜4 个步骤，耗时长，溶剂使用量大[17]。本研究将通过型PRiME 固相萃取和针头滤膜有效结合，实现萃取、净化、除杂一步到位，大大缩短了常规操作耗时由10 min 至2 min，减少实验人员工作量，同时减少了常规SPE 淋洗和洗脱溶剂6～10 mL，免去了用于收集洗脱液的离心管的使用。经试验检测分析，传统方法的化合物回收率为92.8%～96.4%，新型固相萃取膜化合物回收率为91.3%～93.2%（表1），两种方法对盐酸氯苯胍和盐酸小檗碱的回收率差异不显著，均可满足实验室分析测试需求。
表1 传统固相萃取和过膜与新型固相萃取膜试验数据对比
Table 1 Performance comparison of traditional solid-phase extraction and membrane filtration with SPM
?传统固相萃取过膜 新型固相萃取试验步骤 上样、淋洗、洗脱、过膜 一步通过综合耗时/min 10 2溶剂使用量/mL 6～10 无耗材使用 移液器上样，离心管收集，样品瓶保存 移液器上样，样品瓶保存化合物回收率/% 92.8～96.4 91.3～93.2
2.2 质谱条件的优化
以流动注射将质量浓度为1 μg/mL 的盐酸小檗碱和盐酸氯苯胍标准溶液进行正离子模式下MS 全扫描，分别得到两种药物的准分子离子。其中离子峰m/z 336.40 与脱水和Cl-的盐酸小檗碱离子质量（m/z 336.37）相符，而离子峰m/z 334.23与脱Cl-后的盐酸氯苯胍离子质量（m/z 334.21）相符，故确定m/z 336 和m/z 334 为盐酸小檗碱和盐酸氯苯胍的母离子。通过MS/MS 碰撞解离获取其碎片信息，其中盐酸小檗碱的主要子离子为m/z 319.8 和m/z 291.7，盐酸氯苯胍的子离子为m/z 177.8 和m/z 137.9。使用爬坡（Ramp）调试功能优化去簇电压（DP）和碰撞能量（CE），使母离子和子离子组成的离子对信号强度达到最大，并分别以最强和次强离子对作为定量和定性离子对，具体参数见表1。本试验离子对信息与汤菊芬等[18]所建立的HPLC-MS/MS 法相符，而锥孔电压和碰撞能有所出入，原因可能是不同的质谱设备在离子化和解离设计方面有所不同。
2.3 色谱条件的优化
本研究以水、甲醇和乙腈为流动相，其中水相中加入了甲酸来改善化合物的色谱峰型和保留行为。试验结果显示，甲醇和乙腈二者的分离效果相当，而当以水和乙腈为流动相时，盐酸小檗碱和盐酸氯苯胍的峰对称度好，拖尾现象少，因此采用水和乙腈为流动相。向水相中加入甲酸提高了目标化合物的保留能力和响应值。通过提高甲酸浓度观察信号响应时发现，以纯水为水相时盐酸小檗碱和盐酸氯苯胍的响应值较低，0.1%甲酸水-乙腈作为流动相体系时，化合物响应值最高。进一步逐级升高甲酸体积分数至0.5%时，盐酸小檗碱和盐酸氯苯胍的信号强度呈逐渐降低的趋势。甲酸的体积分数对目标化合物在色谱柱上的保留行为影响不大。因此，本研究以0.1%甲酸水-乙腈为流动相，使得目标化合物得到有效分离。优化后的色谱条件，峰形良好、灵敏度极高，5 min 之内，盐酸小檗碱和盐酸氯苯胍得到良好的分离（图1）。
图1 固相滤膜萃取液相色谱-串联质谱法快速测定盐酸氯苯胍和盐酸小檗碱残留色谱图
Fig.1 The chromatogram of berberine hydrochloride and robenidine hydrochloride acquired by SPM HPLC-MS/MS
2.4 固相萃取填料的选择与洗脱液体积的确定
本研究选用了C18、HLB、Slica、Florisil 4 种萃取填料进行试验。如图2a 所示，盐酸氯苯胍和盐酸小檗碱的吸附洗脱行为相似，使用不同填料萃取下两者回收率十分相近。然而不同填料性质对目标化合物的回收率影响较大，常规C18 对盐酸氯苯胍和盐酸小檗碱的回收率分别为65.7%和66.9%。当使用HLB 填料时，目标化合物的回收率均在90%以上。Silica 和Florisil 对盐酸氯苯胍和盐酸小檗碱的吸附洗脱影响较小，分别仅为38.9%，42.5%和33.6%，33.4%。甲醇是一种良好的萃取溶剂，不同体积的甲醇溶液对于目标物的回收率有一定程度的影响。本研究选用甲醇作为萃取液，分别选用1～5 mL 的甲醇进行试验。结果如图2b 所示，盐酸氯苯胍和盐酸小檗碱的回收率随着甲醇体积的增加而上升，当甲醇体积在3～5 mL时，目标物的回收率在90%以上，能取得较为满意的提取效果，故确定3 mL 为洗脱液最佳体积量。
图2 固相滤膜萃取填料（a）和洗脱液体积（b）对盐酸氯苯胍和盐酸小檗碱回收率的影响
Fig.2 The effect of sorbent of SPM （a） and volume of eluting solution （b） on the recovery of berberine hydrochloride and robenidine hydrochloride
2.5 标准曲线、线性范围和检出限、定量限
选用预检无残留的空白鲫鱼样品为空白基质。分别选取质量浓度为0.5，1，5，10，100 μg/L 的盐酸氯苯胍和盐酸小檗碱混合标准工作溶液进行加标检测试验。以峰面积（y）为纵坐标，对应的标准溶液质量浓度为横坐标绘制标准曲线，得出线性回归方程、线性范围和相关系数（r）。分别以3倍和10 倍信噪比（S/N）确定被测物的检出限（LOD）和定量限（LOQ）。由表2可知，试验结果表明，盐酸小檗碱和盐酸氯苯胍在0.5～100 μg/L 的质量浓度范围内线性关系良好，相关系数r＞0.999。该方法对化合物检出的灵敏度高，其中盐酸小檗碱的LOD 和LOQ 分别为0.51 μg/kg 和1.67 μg/kg，盐酸氯苯胍的LOD 和LOQ 为0.53 μg/kg和1.68 μg/kg。本研究建立的固相滤膜萃取液相色谱串联质谱法相较于常规方法在灵敏度方面有显著提高，如刘永涛等[19]用超高效液相色谱所建立的同时测定水产品中盐酸氯苯胍及其代谢物方法的LOD 为25 μg/kg。
表2 盐酸小檗碱和盐酸氯苯胍线性范围、标准曲线、检出限和定量限
Table 2 The linearity range，calibration curve，LOD and LOQ of berberine hydrochloride and robenidine hydrochloride
定量限（LOQ）/μg·kg-1盐酸小檗碱 0.5～100 y=2538x+132 0.999 5 0.51 1.67盐酸氯苯胍 0.5～100 y=1749x-52 0.999 2 0.53 1.68化合物 线性范围/μg·L-1 标准曲线 相关系数（r） 检出限（LOD）/μg·kg-1
2.6 回收率与精密度
在空白鲫鱼样品基质中加入盐酸氯苯胍和盐酸小檗碱混合标准溶液，制备质量浓度分别为5，10，50 μg/kg 的加标样品。根据前述的处理方法和测定条件进行精密度和回收率试验。每个添加水平平行测定6 次，结果如表3所示，在质量浓度分别为5，10，50 μg/kg 的情况下，盐酸小檗碱的日内和日间精密度RSD 为4.09%～5.73%，盐酸氯苯胍的日内和日间精密度RSD 为3.84%～5.29%。3 种质量浓度水平下，盐酸小檗碱和盐酸氯苯胍的回收率≥91.2%～93.2%，RSD≤5.2%。结果表明，该检测方法结果稳定、可靠、精密度和回收率高，可以满足在鱼肉中同时检测盐酸小檗碱和盐酸氯苯胍残留量的要求。
表3 空白鲫鱼肉中盐酸小檗碱和盐酸氯苯胍不同质量浓度下的日内精密度和日间精密度
Table 3 The intra-day and inter-day precisions of berberine hydrochloride and robenidine hydrochloride
at different mass concentrations in fish meat
日内精密度日间精密度均值±标准偏差 RSD/%盐酸小檗碱 5.0 4.91±0.22 4.48 5.73 10.0 9.85±0.41 4.16 5.25 50.0 48.4±1.98 4.09 5.17盐酸氯苯胍 5.0 4.87±0.19 3.90 5.29 10.0 9.72±0.38 3.91 4.66 50.0 48.5±1.86 3.84 4.23化合物 质量加标浓度/μg·kg-1
2.7 实际样品检测
表4 空白鲫鱼肉中盐酸小檗碱和盐酸氯苯胍加标回收率及相对标准偏差
Table 4 The standard spiked recovery and RSD of berberine hydrochloride and robenidine hydrochloride in blank fish meat sample
加标质量浓度/μg·kg-1 5 10 50回收率/% RSD/% 回收率/% RSD/% 回收率/% RSD/%盐酸小檗碱 92.6 4.6 93.2 4.5 91.2 4.6盐酸氯苯胍 91.3 1.8 92.4 5.2 92.1 5.1化合物
采用本研究方法对市售商品鲫鱼、草鱼、鲤鱼各12 批次进行检测，结果未出现阳性样品，分析原因可能：（1）盐酸小檗碱和盐酸氯苯胍作为抗菌抗虫药在水产养殖业中使用并不十分普及；（2）目前职能部门对兽药在养殖业中的使用规范监管惩治力度较严，兽药滥用情况较以前有明显改善。后期将进一步对不同品种和来源的水产品进行检测，扩大抽检样本量。
3 结论
将通过型PEiME 固相萃取和针式滤膜结合，实现鱼肉样品前处理过程中，萃取、净化、除杂的步骤一体化，在保证盐酸小檗碱和盐酸氯苯胍萃取效率的前提下，极大地节约了操作时间，节省了试剂和耗材使用。结合液相色谱串联质谱法实现了鱼肉中盐酸小檗碱和盐酸氯苯胍的高效、稳定和可靠检测。此方法操作步骤简单、耗时较少，可作为鱼肉中盐酸氯苯胍和盐酸小檗碱残留的检测方法，为水产品质量安全风险管理提供技术支撑。
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