花生籽粒是重要的油料种子之一，在世界范围内广泛种植。花生还是重要的经济作物，中国是世界主要的花生生产国和出口国之一，2019年中国花生产量占全球产量的38.5%[1]。花生籽粒含有丰富的油脂，在保障食用油脂安全方面发挥重要作用，可提供蛋白质、脂肪、维生素和不饱和脂肪酸等物质补充人类饮食[2-5]。
由于传统的农业生产过于追求产量和效益，花生产区土壤和花生容易遭受重金属污染，致花生品质下降，花生中重金属含量超标情况时有发生[6]。花生是地下结果作物，除了根系具有吸收重金属能力外，荚果也能吸收重金属，导致花生对重金属的富集更为明显，对作物生长发育和人类健康具有重要影响[7-8]。花生安全生产越来越受到人们的关注。
我国农田最常见的重金属污染为镉、铬、铅、砷、汞和铜，其中镉污染较为严重[9]。有研究表明，一些地区土壤重金属含量达到中等污染水平以上[10-11]。一般来说，花生重金属污染现象与土壤重金属密切相关[12]。目前，国内关于花生中重金属污染情况的研究主要集中在不同花生品种对重金属的吸收差异，以及重金属胁迫下对花生生理特性、产量和品质的影响[13-17]。国外报道，有利用真菌共生和植物螯合素减少花生籽粒中重金属镉积累的研究[18-19]；有研究长期施肥对花生产量和土壤重金属积累的影响[20]；还有研究表明花生籽粒中重金属的生物有效性较高，对重金属的吸收和积累能力较强[21]。目前，国内外综合分析产地和品种对花生中重金属含量的影响鲜有报道。另外，花生中重金属含量与产地土壤和降水间的关系尚不清楚。
花生中重金属含量可能受生长环境的影响，不同产地的土壤和降水中重金属含量不同，可能会导致花生中重金属含量不同。另外，不同品种的花生由于代谢的差异，重金属含量也可能不同[22-23]。本文分析产地、品种及其交互作用对花生中重金属含量的影响，及花生中重金属与土壤和降水之间的关系，为花生中重金属含量研究提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
2019年4月，分别在山东省即墨市、沂水县和莱州市各选1 个试验点，每个试验点种植海花1 号、鲁花11 号和大白沙3 个品种的花生，各品种随机排列，每个品种种植面积约10 m2。9月从各试验点采集花生、土壤和降水样品。
硝酸（含量70%）、双氧水（含量40%）、高氯酸（含量70%）、氢氟酸（40%）（均为BVⅢ级），北京化学试剂研究所；内标72Ge、115In、209Bi 和外标，中国标准物质采购中心。
1.2 仪器与设备
Mars 240/50 微波消解仪，美国CEM 公司；7700 电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）仪，美国安捷伦公司；Milli-Q 超纯水机，美国Millipore 公司；DV4000 精确控温电热消解器，北京安南科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 样品采集
1.3.1.1 花生采集 2019年9月，在即墨市、沂水县和莱州市的试验田，每个花生品种的种植区域内，随机采集1 m2 区域的花生植株，每个品种采集3 份，共采集样品27 份。每墩花生植株去除根和茎叶，只保留果壳。去除果壳上的泥土，挑选无破损、果壳较大的装入网袋中，标注产地和品种。
1.3.1.2 土壤采集 以花生采样点为中心，画一边长约40 cm 的正方形，在正方形的4 个顶点上用土铲向下挖，于0～20 cm 处取土壤样品，每个采样点采集200 g 土壤样品置塑封袋中，标记产地。
1.3.1.3 降水采集 为了保证收集到的雨水具有代表性，在降雨开始时，每隔5 min 收集1 次雨水，每次持续10 min，0.5 h 后每隔10 min 收集1次，直到降雨结束。各地区降水时，将100 mL 塑料瓶置2 m 高的采样台上，避开污染源，四周无遮挡的高大树木或建筑物，收集后记录降水时间，拧紧瓶盖置阴凉干燥处保存，在采集花生时一同带回实验室。
1.3.2 样品预处理
1.3.2.1 花生样品预处理 首先将带壳花生在阳光下暴晒3 d，除去花生中大部分水分，然后挑出损坏的花生丢弃。将筛选出的花生样品剥壳，保留外部红衣，将完整无破损的花生籽粒用去离子水清洗干净。清洗时佩戴一次性手套，避免用手直接接触花生仁，按四分法取30 g 花生籽粒样品，然后将花生籽粒置于平板中，在烘箱内烘至恒重，用研钵研磨粉碎，做好标记装入塑封袋，置干燥器内备用，避免返潮现象。
准确称取预处理后的花生粉末样品0.25 g，放入25 mL 聚四氯乙烯微波消解管中，加入6 mL 硝酸，盖上盖子反应2 h，再加入2 mL 双氧水反应30 min，放入微波消解仪中，按设定程序进行升温消解。
微波消解仪工作条件：功率1 600 W，消解温度180 ℃。样品消解完成后冷却，从密闭微波消解仪中取出消解管，置于精确控温电热消解器中180 ℃加热60 min 进行赶酸，至剩余（0.75±0.25）mL，用超纯水定容至100 mL，待测。
1.3.2.2 土壤样品预处理
1） 种源土壤样品自然风干，除去肉眼可见的植物根茎等杂质和大于5 mm 的沙砾，然后，用研钵研磨粉碎，过100 目筛，置干燥器内备用。
2） 对种源土壤粉末样品进行消解 准确称取预处理后的土壤样品0.05 g，放入25 mL 聚四氯乙烯微波消解管中，加入8 mL 硝酸和2 mL 氢氟酸后放入微波消解仪中消解，按照设定的步骤进行升温消解。
微波消解仪工作条件：功率1 600 W，消解温度185 ℃，样品消解完并冷却后，从密闭微波消解仪中取出消解管，置于精确控温电热消解器中180 ℃加热60 min 进行赶酸，至剩余（0.75±0.25）mL，用超纯水定容至100 mL，待测。
1.3.2.3 降水样品预处理 参考王珊珊等[24]处理降水的方法：取适量雨水样品，用0.45 μm 过滤器过滤后置于50 mL 聚四氟乙烯坩埚中，加入0.8 mL 硝酸和50 μL 氢氟酸，拧紧盖子，于130 ℃加热5 h 后取出坩埚，打开盖子，让挥发性有机物挥发后再次拧紧盖子，于180 ℃烘箱内加热12 h。取出坩埚，冷却后向其中加入0.5 mL 硝酸继续蒸干，向坩埚内加入0.2 mL 50 μg/L 铑内标液，同时加入稀硝酸（体积比为3∶1），再次将坩埚置于140 ℃烘箱内加热5 h。
1.3.3 样品分析 利用ICP-MS 测定花生、土壤和降水中Cr、Ni、As、Cd、Sb、Tl 和Pb 7 种重金属元素含量。ICP-MS 的工作参数为：射频功率1 200 W，冷却器流速1.47 L/min，载气及辅助气流速1 L/min，等离子体气体流速15 L/min，雾化室温度2 ℃。以元素72Ge、115In 和209Bi 作为内标，每个样品或标准物质重复测定3 次，当内标的相对标准偏差大于5%时，重新测定样品。
1.4 数据处理
使用IBM SPSS 25.0 软件对花生籽粒、土壤及降水中重金属含量数据进行单因素方差分析（P＜0.05 和P ＜0.01）、Duncan 多重比较分析（P ＜0.05）、多因素方差分析和Pearson 相关分析。采用单因素方差分析检验不同产地、品种花生样品中重金属元素含量间是否存在显著性差异；采用Duncan 多重比较分析探究存在显著性差异的元素在不同产地、不同品种中含量的特征；利用多因素方差分析探究产地、品种及其交互作用对花生籽粒中重金属元素含量变化的贡献；采用Pearson 相关分析研究花生中重金属元素与种源土壤、降水中相应元素含量是否存在显著线性关系。
2 结果与分析
2.1 花生籽粒中重金属含量的影响因素分析
2.1.1 不同产地花生籽粒重金属含量 不同地区花生籽粒样品中7 种重金属浓度的平均值和标准偏差见表1。单因素方差分析结果表明：重金属元素Ni、As、Cd 和Tl 含量在3 个地区间差异极显著（P ＜0.01）；Cr 含量在3 个地区间差异显著 （P ＜0.05）；Sb 和Pb 含量在不同地区间差异不显著。当元素浓度在统计学上有显著差异时，使用Duncan多重比较来比较平均数。Duncan 多重比较分析表明，不同地区花生籽粒中的重金属含量各有特点。与其它两个地区相比，即墨市花生籽粒中重金属Cr 含量最高，Ni 含量最低；沂水县的花生籽粒样品中Tl 含量最高，而As 含量明显低于其它两个地区；莱州的样品中Cd 含量最高。吕伟[25]检测不同产区花生样品矿质元素含量时发现重金属Pb和Sb 含量存在显著差异。
表1 不同产地花生籽粒样品重金属含量（μg/kg）
Table 1 The heavy metal concentrations of peanut samples from different regions （μg/kg）
注：表格中数据用“平均值±标准偏差”表示；* 和** 分别表示元素含量在P ＜0.05 和P ＜0.01 水平；不同字母a、b 是Duncan 多重比较的结果，表示具有显著性差异（P ＜0.05）。
?元素 即墨 沂水 莱州Cr* 50.79±9.03b 43.55±6.87a 40.05±5.34a Ni** 3 388±2 185a 9 621±2 486b 9 736±1 772b As** 13.14±8.72b 5.52±0.57a 12.66±1.22b Cd** 68.78±16.08a 54.94±20.94a 288.14±17.25b Sb 1.96±1.30 1.52±0.60 1.14±0.74 Tl** 0.32±0.14a 0.67±0.30b 0.35±0.13a Pb 10.04±5.52 18.19±15.49 19.31±8.53
2.1.2 不同品种花生籽粒重金属含量 对海花1号、鲁花11 号和大白沙3 个品种的重金属含量进行单因素方差分析，从表2可看出，元素As 在3个品种间存在显著性差异（P ＜0.05），其它重金属元素没有显著性差异。通过对存在显著性差异的元素进行Duncan 多重比较可知，大白沙品种中As 含量最高，鲁花11 号中As 含量最低。不同品种花生对不同重金属元素的吸收程度差异不明显。赵明等[22]的研究中也发现，不同品种的花生籽粒中重金属Pb、Cd 和Cr 的含量差异不明显。
表2 不同品种花生籽粒样品重金属含量（μg/kg）
Table 2 The heavy metal concentrations of peanut samples of different varieties （μg/kg）
注：表格中数据用“平均值±标准偏差”表示；* 表示元素含量在P ＜0.05 水平；不同字母a、b 是Duncan 多重比较的结果，表示具有显著性
差异（P ＜0.05）。
?
2.1.3 产地、品种及其交互作用对花生籽粒中重金属含量变化的贡献 通过计算分析各因素对重金属含量变化的贡献率，如表3所示。重金属Cr、Sb 和Pb 含量主要受误差影响，可能是因为这些重金属在花生籽粒中含量不高或受肥料、农药等因素的影响。Takeda 等[26]比较日本西部区域14 种重金属含量与来源时指出，重金属含量受季节因素的影响；重金属Ni、Cd 和Tl 的含量主要受产地影响；重金属As 含量主要受产地×品种交互作用的影响；花生中重金属含量受品种影响较小。
表3 各影响因素对重金属含量变化的方差贡献率（%）
Table 3 The contribution rate of each factor to the heavy metal content variability（%）
?
通过上述分析可知，花生中重金属含量主要受产地的影响，受品种影响较小。与产地密切相关的来源主要有种源土壤和产地降水。花生中重金属主要来源于产地的土壤还是降水待查。
2.2 花生籽粒中重金属来源分析
2.2.1 土壤中重金属含量分析 表4分别表示3个地区土壤样品中7 种重金属含量的平均值和标准差。可以看出，7 种元素在3 个地区之间均存在极显著差异（P ＜0.01）。通过Duncan 多重比较分析得出以下结论：在即墨的土壤样品中，Ni、Cd 和Pb 平均浓度在3 个地区中较高；沂水的土壤样品与其它两个地区相比，Cr 的含量较高，而Ni、Sb、Tl 和Pb 含量较低；莱州的土壤样品中，As、Sb 和Tl 含量较高。这些结果表明，不同地区的重金属组成存在差异，沂水地区土壤中的重金属含量较少。Yang 等[27]和Jing 等[28]研究均发现，土壤中重金属含量与母质土壤、土壤类型和土壤成分等因素有密切关系。因本研究中3 个地区的土壤类型等因素各不相同，故土壤中重金属含量存在较大差异。
表4 不同产地土壤样品重金属含量（μg/kg）
Table 4 The heavy metal concentrations of soil samples from different regions（μg/kg）
注：表格中数据用“平均值±标准偏差”表示；** 表示元素含量在P ＜0.01 水平；不同字母a、b、c 是Duncan 多重比较的结果，表示具有显著性差异（P ＜0.05）。
?
2.2.2 降水中重金属含量分析 如表5所示，不同地区的降水样品中7 种重金属含量均存在显著性差异（P ＜0.01），对存在差异的元素通过Duncan多重比较分析得出结论：即墨地区的降水样品中，Tl 和Pb 的含量高于其它两个地区，Ni 和As 的含量较低；莱州的降水样品中Ni、As 和Sb 含量最高，Tl 含量最少；沂水的样品中Cr 和Cd 的含量最高。降水样品中重金属含量差异可能与种植区域的地理位置和人为环境有关，种植区域周边的大气污染物不同，也会导致降水样品中重金属含量的差异。此外，赵文杰等[29]研究发现降水中重金属含量不仅受元素本身性质（亲水性、疏水性）的影响，也会受降水pH 以及气象条件风速风向、湿度等的影响。Sakata 等[30]研究日本3 个地区雨水中金属元素来源时指出，受西北季风的影响，As、Cd 和Pb 在春季和冬季含量较高，Ni 的季节差异不明显，也说明降水中重金属含量受到季节和风向因素的影响。即使是同一省份的3 个地区的降水样品也存在显著性差异。
表5 不同产地降水样品重金属含量（μg/kg）
Table 5 The heavy metal concentrations of precipitation samples from different regions （μg/kg）
注：表格中数据用“平均值±标准偏差”表示；** 表示元素含量在P ＜0.01 水平；不同字母a、b、c 是Duncan 多重比较的结果，表示具有显著性差异（P ＜0.05）。
?
2.2.3 花生籽粒与土壤及降水中重金属含量关系 为进一步分析花生中各种重金属与土壤、降水中相关元素含量之间的关系，对花生与土壤或降水中的相应元素含量进行Pearson 相关性分析。结果表明，花生与土壤中Cd（r=0.469，P＜0.01）含量呈极显著正相关，Cr （r=-0.319，P＜0.01）、Ni（r=-0.712，P＜0.01）和Tl（r=-0.491，P＜0.01）含量呈极显著负相关，As、Sb 和Pb 元素含量相关性不显著。说明花生中Cd 随土壤中Cd 浓度的增加而增加，元素Cr、Ni 和Tl 随土壤中元素Cr、Ni 和Tl含量的增加而降低。由此可见花生植株在重金属浓度较高的土壤中对3 种重金属的吸收程度较低。吕伟[25]发现花生中Cd 与土壤中Cd 的相关系数高达0.625，呈极显著正相关。蔡葵等[31]也发现花生对土壤中Cd 的富集系数较高，花生中的Cd主要来自土壤。这些发现与本试验结果一致。Xiong 等[32]通过研究莲藕中重金属与土壤的相关性，发现莲藕中的重金属主要独立于土壤或与土壤呈负相关积累，这一发现与本试验结果相似。本试验中，土壤中重金属As 和Pb 含量较高，而花生中As 和Pb 含量与土壤并没有显著的相关性，说明花生中As 和Pb 的积累机制复杂。
花生与降水中Ni（r=0.241，P＜0.05）含量呈显著正相关，Cd（r=-0.328，P＜0.01）含量呈极显著负相关，其它元素含量相关性不显著。说明花生植株主要从降水中吸收Ni，花生中Cd 元素主要来源于土壤。花生中As、Sb、Pb 的含量与土壤和降水中相关元素的含量都没有显著相关性，说明花生中的重金属元素来源除了土壤和降水，还可能来源于其它途径，如植株叶片从空气中吸收喷洒其它农作物的农药肥料，大气中悬浮的重金属颗粒等。也可能花生与种源土壤和降水中的重金属的含量不是简单的线性关系，需进一步探究。另外，为深入了解花生中重金属的来源，土壤和降水中重金属被花生吸收的方式和运输富集途径等还需进一步探究。
3 结论
花生中重金属元素Ni、Cd 和Tl 的含量主要受产地的影响；As 的含量受产地×品种交互作用的影响，Cr、Sb 和Pb 的含量变化受其它因素影响较大。花生中As、Sb 和Pb 的含量与土壤和降水中相关元素的含量没有显著相关性，Cd 和Ni 含量与土壤和降水均呈现显著相关性，Cr 和Tl 含量与土壤中元素含量显著相关。表明花生中重金属含量受产地、品种的影响，其来源不仅包括土壤和降水，还可能有农药和肥料等其它来源。
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