荔枝（Litchi chinensis Sonn.）属无患子科木本植物，广泛种植于热带和亚热带地区，其果实因色泽红艳、滋味甘甜、营养丰富而具有较高的商业价值[1]。荔枝是典型的非呼吸跃变型果实，需完熟后采收，然而，采后果实在常温贮运过程中极易发生衰老和腐烂，极大地限制了产品流通与市场贸易[1]。冷藏是推迟果蔬采后衰老并维持其品质的主要技术手段之一[2]。荔枝属冷敏型果实，在冷藏过程中易发生冷害，且遭受冷害的果实由低温转入常温贮藏后，其症状迅速加剧，使产品货架寿命缩短至24 h 以内[2]。探寻高效、环保的抗冷保鲜方法，对于减轻果实冷害具有重要意义。果皮褐变是荔枝果实冷害最为明显的特征，主要与花色素苷降解、多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）和过氧化物酶（peroxidase，POD）引发的酶促氧化反应、细胞膜脂过氧化、细胞能量亏缺以及细胞氧化-还原稳态失衡等因素有关[3]。近年来，一些学者相继提出用于减轻荔枝果实冷害的采后技术，并取得较好的效果。例如：Xiao 等[4]使用干雾增湿技术处理采后“淮枝”荔枝果实，可显著降低果实在4°C冷藏过程中的失重率，抑制膜透性增大及色泽损失，从而较好地保持了冷藏期间荔枝果实的品质。Siddiqui 等[5]报道，2 mmol/L H2S 真空（0.01 MPa）渗透处理，通过抑制PPO 和POD 活性，促进酚类物质的积累，增强ROS 清除能力等作用使冷藏“Purbi”荔枝果实的抗冷能力提高。Ali 等[6]使用0.25%半胱氨酸预处理并结合1%O2+5%CO2 气调冷藏（4°C）技术对“Gola”荔枝进行保鲜，结果显示果实细胞膜透性、膜脂过氧化水平及PPO 和POD 活性均显著降低，而果实总酚含量和抗氧化能力有所提高，致果实冷害症状明显缓解。然而，上述方法存在处理方式复杂且成本较高等问题。在荔枝采后生产中仍需不断开发安全可靠且易操作的冷害控制技术，以改善产品的贮藏品质。
褪黑素（melatonin，MT），化学名为N-乙酰基-5-甲氧基色胺，是一种吲哚杂环类化合物，于1958 年首次在牛松果体中发现，现已证实其广泛存在于自然界生命有机体中[7]。在高等植物中，MT合成于线粒体和叶绿体，分布于多个组织和器官中，是重要的氧化-还原信号分子，其在调节种子萌发、组织分化、昼夜节律、光合效率、成熟衰老以及逆境胁迫应答等多种生理活动中发挥着显著作用[8]。此外，因MT 独特的天然属性和生物活性，而被开发为保健药品，具有改善睡眠，调节生理失调，提高免疫力、抗衰老和抗炎等功效[9]。近年来，随着人们对MT 功能认识的不断深入，对果蔬采后生理与品质的调控作用也日益受到关注。外源褪黑素浸泡处理可有效延迟采后桃[10]、香蕉[11]、猕猴桃[12]和梨[13]等果实常温贮藏期间的成熟和衰老，并维持较好的贮藏品质。在控制采后果实冷害方面，外源褪黑素处理可促进1 ℃和4 ℃冷藏期间桃果实γ-氨基丁酸代谢和脯氨酸代谢，增加ATP供应，抑制细胞壁多糖解聚，减轻膜脂过氧化，以及提高不饱和脂肪酸比例，从而改善果实抗冷性并使冷害减轻[14-16]。
先前的研究结果显示，MT 处理通过调节果实细胞能量和脯氨酸代谢来减轻“白糖罂”荔枝果实经冷藏转入常温贮藏后的冷害症状[2]，表明MT 可提高受冷荔枝果实在常温货架期间的适应能力，然而，目前尚不清楚MT 对冷藏期间荔枝果实抗冷性的调节作用及其机制。本研究以“紫娘喜”荔枝为试材，调查外源MT 处理对采后荔枝果实冷藏期间冷害发生的影响，通过分析膜脂过氧化、酚类物质代谢、活性氧（reactive oxygen species，ROS）代谢及蛋白质氧化损伤修复能力的变化，探讨MT 对荔枝果实抗冷性的诱导作用，以期为MT应用于荔枝冷藏保鲜提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
供试“紫娘喜”荔枝果实采摘于海口市永兴镇一商业果园。选取外观、大小均一，且无机械伤和病虫害的果实，于采收当日运送至海南大学食品科学与工程学院采后生物学实验室。
MT、愈创木酚、邻苯二酚、柠檬酸，上海源叶生物科技有限公司；氢氧化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠，西陇科学股份有限公司；红菲咯啉、二硫代硝基苯甲酸，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；TritonX-100，北京索莱宝科技有限公司；植物多糖多酚总RNA 提取试剂盒，天根生化科技有限公司；AE301 cDNA 合成试剂盒，北京全式金生物技术有限公司；SuperReal 荧光定量预混试剂盒，天根生化科技有限公司；H2O2 含量可见分光光度法检测试剂盒、O2·-含量可见分光光度法检测试剂盒，北京索莱宝科技有限公司；MDHAR 活性测定试剂盒、DHAR 活性测定试剂盒，苏州科铭生物技术有限公司。以上化学试剂均为分析纯级。
1.2 仪器与设备
色差仪（型号CR-400），日本大阪美能达公司；紫外分光光度计（型号UV-5500PC），上海元析仪器有限公司；电导率仪（型号FE30），瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司；荧光定量PCR 仪（型号CFX ConnectTM Optics Module），美国Bio-Rad公司；高速万能粉碎机（型号FW100），北京永光明医疗仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 采后处理 用0.5%次氯酸钠对荔枝果实进行浸泡消毒处理30 s，果实沥水后置于通风处自然晾干。将果实随机分成2 组，分别置于蒸馏水（对照组）和0.5 mmol/L（该浓度经前期预实验筛选获得）MT 溶液浸泡处理10 min，自然晾干。将晾干后的荔枝果实装入带孔聚乙烯自封袋，15 果/袋，置于（4±1）°C、（85±5）%相对湿度的冷库中贮藏30 d。冷藏期间每隔5 d 测定果实冷害指数、果皮色泽和相对电导率，同时对果皮进行取样，将样品用液氮速冻并捣成碎片，置于-80°C 下冻存，待测。每处理在各测定时间点设3 次重复，30 果/重复用于冷害指数调查，其它指标分析设定为15果/重复。待测冻样使用时先用FW100 粉碎机将其在低温下粉碎成果皮粉末，然后测定。
1.3.2 冷害指数和色度a*值测定 冷害指数：根据冷藏果实褐变严重程度将其分为5 个级别（0～4级），评判标准按照Zhang 等[3]的方法。冷害指数即褐变指数，计算公式：∑（褐变等级×对应等级果实数量）/4×调查果实总数。
色度a*值：使用CR-400 色差仪在果实赤道轴中心对应两点各测1 次色度值。a*值由低到高代表颜色由绿至红，正值越高红色越深，将a*值作为本研究中果皮色泽的特征参数。
1.3.3 相对电导率和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量测定 相对电导率测定采用Zhang 等[3]的方法。相对电导率（%）=初始电导值/总电导值×100。
取0.5 g 冷冻荔枝果皮粉末，按照Zhang 等[3]描述的硫代巴比妥酸法测定MDA 含量，单位以每千克鲜重（fresh weight，FW）果皮含有的物质的量（mmol/L）表示，即mmol/kg FW。
1.3.4 O2·-生成率和H2O2 含量测定 分别取0.15 g 果皮粉末，使用可见分光光度法检测试剂盒测定超氧阴离子（superoxide anion，O2·-）生成率和过氧化氢（hydrogen peroxide，H2O2）含量，具体操作流程参照试剂盒说明书。O2·-生成率和H2O2 含量分别以每千克鲜重果皮每秒生成O2·-的物质的量（μmol）和每千克鲜重果皮所含H2O2 的物质的量（mmol）表示，即分别为μmol/（kg FW·s）和mmol/kg FW。
1.3.5 总酚、类黄酮总花色素苷含量测定 取1 g荔枝果皮粉末溶于10 mL 预冷的80%甲醇溶液，匀浆后在4°C 条件静置20 min，然后于10 000 ×g、4°C 条件下离心15 min，上清液即总酚和类黄酮提取液。
使用福林酚法测定总酚[17]，以没食子酸为参照物计算总酚含量，单位表示为g/kg FW。
使用AlCl3 比色法测定类黄酮[18]，以芦丁为参照物计算类黄酮含量，单位表示为g/kg FW。
取1 g 冷冻荔枝果皮，参照Zhang 等[19]描述的pH 差示法测定并计算花色素苷含量，单位表示为g/kg FW。
1.3.6 PPO 和POD 活性测定 PPO 和POD 粗酶液提取：称取0.15 g 果皮粉末，加入1.5 mL 预冷乙酸-乙酸钠缓冲液（0.1 mol/L，pH 5.5，含1 mmol/L PEG、4% PVP 和1% Triton X-100），混匀后在4°C 条件静置20 min，随后于10 000×g、4°C 条件下离心30 min，收集上清液，即粗酶提取液。
PPO 活性测定参照Kumar 等[20]的方法，以邻苯二酚溶液作为反应底物，加入粗酶液后记录反应液体吸光值在波长420 nm 处的变化，以每分钟吸光值变化0.01 定义为1 个酶活力单位（U），PPO活性表示为U/kg FW。
POD 测定参照Zhang 等[21]的方法，以愈创木酚溶液作为反应底物，依次向其中加入粗酶液和H2O2，反应启动后记录溶液在470 nm 处的吸光值变化，以每分钟吸光值变化0.01 定义为1 个酶活力单位（U），POD 活性表示为U/kg FW。
1.3.7 抗氧化酶活性测定 参照Zhang 等[3]的方法，分别取0.1 g 果皮粉末溶解于不同的预冷缓冲液并匀浆，将各匀浆液在12 000×g 离心力、4°C下离心20 min，各上清液分别作为超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）和谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase，GR）粗酶液，进行下述酶活性测定。
1）SOD 活性测定 参照Toivonen 等[22]的方法。依据SOD 抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原能力来衡量酶活性强、弱，将抑制50%的NBT 光还原反应所需酶量定义为1 个酶活力单位（U）。
2）CAT 活性测定参照Chance 等[23]的方法，以20 mmol/L H2O2 溶液为反应底物，加入粗酶液后检测混合液在波长290 nm 处的吸光值变化。以每分钟降解1 μmol H2O2 所需酶量定义为1 个酶活力单位（U）。
3）APX 活性测定 参照Liu 等[24]的方法，以抗坏血酸（ascorbic acid，AsA）作为反应底物，依次加入粗酶液和H2O2，记录反应混合液在290 nm处的吸光值变化，以每分钟氧化1 μmol AsA 所需酶量定义为1 个酶活力单位（U）。
4）GR 活性测定 参照Smith 等[25]的方法，反应体系包括0.2 mL 氧化型谷胱甘肽（oxidizided glutathione，GSSG）（5 mmol/L）、0.1 mL 粗酶液、0.1 mL NADPH 溶液（4 mmol/L）、2.6 mL 磷酸缓冲液（pH 7.5，含1 mmol/L EDTA）。记录反应液在340 nm 处的吸光值变化，以每分钟吸光值降低0.01 定义为1 个酶活力单位（U）。
5）单脱氢抗坏血酸还原酶（monodehydroascorbate reductase，MDHAR）和脱氢抗坏血酸还原酶（dehydroascorbate reductase，DHAR）的 提取及活性测定 分别使用MDHAR 和DHAR 测试试剂盒，具体操作参照试剂盒说明书。以每秒氧化1 μmol NADPH 定义为1 个MDHAR 活力单位（U）；以每秒生成1 μmol AsA 定义为1 个DHAR活力单位（U）。
以上酶活性均用U/kg FW 表示。
1.3.8 抗坏血酸-谷胱甘肽循环代谢产物含量测定 取0.15 g 果皮粉末加入预冷的1.5 mL 三氯乙酸（50 g/L）中混匀，提取20 min 后，于10 000 ×g、4 ℃条件下离心20 min，收集上清液于低温保存，待测AsA、脱氢抗坏血酸（dehydroascorbic acid，DHA）、还原型谷胱甘 肽（reduced glutathione，GSH）和GSSG 含量。
1）AsA 含量 按照Zhang 等[26]描述的红菲咯啉比色法测定，单位表示为g/kg FW。
2）DHA 含量 参考Chumyam 等[27]的方法测定，将0.2 mL 上清液加入0.8 mL DTT（10 mmol/L）中，42 °C 孵育15 min，然后加入0.2 mL N-乙基马来酰亚胺（0.5%）终止反应。按上述AsA 含量分析方法测定总AsA。DHA 含量=总AsA 含量-还原型AsA 含量。DHA 含量单位表示为g/kg FW。
3）GSH 含量 使用5，5-二硫代双-2-硝基苯甲酸法测定[11]，含量单位表示为g/kg FW。
4）GSSG 含量 采用Chotikakham 等[28]的方法测定，首先测定总谷胱甘肽（GSH+GSSG）含量，其减去GSH 含量即得到GSSG 含量，单位表示为g/kg FW。
1.3.9 氧化蛋白修复系统相关基因表达分析 使用RNAprep pure DP441 植物多糖多酚总RNA提取试剂盒提取荔枝果皮总RNA，具体操作参照说明书。使用AE301 cDNA 合成试剂盒，按其说明书描述进行反转录，合成第1 链cDNA。使用FP205 SuperReal 荧光定量预混试剂盒进行实时定量PCR 操作，并使用Bio-Rad CFX96 实时定量PCR 仪分析。实时定量PCR 操作中使用20 μL 体系：10 μL SuperReal 预混液、2 μL 模板DNA，上、下游引物各0.6 μL、6.8 μL ddH2O），反应程序：1）95 ℃持续10 s；2）55 ℃持续30 s；3）72 ℃延伸30 s，40 次循环。各基因的相对表达量按照2-ΔΔCT 方法[29]计算。
LcMsrA1（KY475577.1）、LcMsrA2（KY475578.1）、LcMsrB1（KY475579.1）和LcMsrB2（MH396620.1）序列信息获取自美国国立生物信息中心（NCBI）。利用Primer 6.0 软件设计实时定量PCR 引物，所有引物委托上海铂尚生物技术有限公司合成。以LcACT1 基因[30]作为内参基因，所有相关引物序列见表1。
表1 引物序列
Table 1 Primer sequences
1.3.10 数据统计分析 使用SPSS 22.0 软件进行数据分析。采用独立样本t 检验法分析处理组与对照差异组在相同时间点的显著差异（*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001）。
2 结果与分析
2.1 外源MT 处理对冷藏荔枝果实冷害指数、果皮色泽的影响
荔枝果实在冷藏期间的冷害症状及冷害指数变化如图1a 和1b 所示，对照果实在第10 天时开始出现冷害症状，其冷害指数在10～15 d 略微增长，随后快速升高，第30 天时冷害指数达到0.71±0.02。外源MT 处理有效延缓了果实冷害的发生，其处理果实在冷藏10～30 d 的冷害指数显著低于对照果实；第30 天时，MT 处理果实冷害指数较对照果实低49.4%。
如图1c 所示，荔枝果皮色度a* 值在冷藏期间持续下降，其初始值为25.41 ± 0.46，冷藏30 d后，对照果实色度a*降至10.74±0.44。MT 处理果实在冷藏10～30 d 的色度a*值平均高于对照果实37.2%。上述结果表明MT 处理可有效降低冷藏荔枝果实冷害发生并维持其外观品质。
图1 MT 处理对冷藏期间荔枝果实外观（a）、冷害指数（b）和色度a＊ 值（c）的影响
Fig.1 Effect of MT treatment on appearance（a），chilling injury index（b）and chromaticity a*（c）in litchi fruit during refrigeration
注：*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001。
2.2 MT 处理对荔枝果实膜透性、膜脂过氧化和ROS 生成的影响
相对电导率和MDA 含量分别是评价膜透性和膜脂过氧化程度的重要生理指标。由图2a 和2b可知，荔枝果皮相对电导率和MDA 含量在冷藏期间均呈总体升高趋势，对照组相对电导率和MDA含量在冷藏期间的增幅分别为186.5%和73.9%。MT 处理果实相对电导率和MDA 含量增速较慢，二者值均在第15～30 天期间显著低于对照果实，且在第30 天较对照组分别降低29.6%和16.9%（图2a 和2b）。
如图2c 所示，对照组果实O2·-生成率初始值为（0.84±0.01）×10-2 μmol/（kg·s），冷藏至25 d时达到（1.33±0.04）×10-2 μmol/（kg·s），最后5 d中略有降低。MT 处理果实O2·-生成率增长缓慢，其在5～25 d 期间显著低于对照果实（图2c）。
荔枝果实H2O2 含量在冷藏0 d 时为（11.27±0.21）mmol/kg（图2d）。对照果实H2O2 含量在冷藏期间总体呈不断增加趋势，冷藏第30 天时达到（14.94±0.19）mmol/kg（图2d）。MT 处理组果实H2O2 含量除冷藏25 d 外，其余时间均显著低于对照果实（图2d）。
图2 MT 处理对冷藏期间荔枝果实相对电导率（a）、MDA 含量（b）、O2·-生成率（c）和H2O2 含量（d）的影响
Fig.2 Effect of MT treatment on relative conductivity（a），MDA content（b），O2·- production rate（c）and H2O2 content（d）in litchi fruit during refrigeration
注：*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001。
上述结果表明MT 处理可抑制冷藏期间荔枝果实ROS 生成，从而减轻氧化胁迫并使膜完整性得到维持。
2.3 MT 处理对荔枝果实总酚、类黄酮和花色素苷的影响
荔枝果实冷藏期间总酚、类黄酮和花色素苷含量变化如图3 所示。果实中总酚和类黄酮含量均在冷藏前5 d 迅速升高，分别从（6.72±0.10）g/kg 和（1.17±0.02）g/kg 升至（8.35±0.09）g/kg 和（1.27±0.01）g/kg，随后持续下降（图3a 和3b）。MT 处理果实的总酚和类黄酮含量变化趋势与对照果实相似，然而，分别在第5，10，20，30 天和第5，10，15，20 天显著高于对照果实（图3a 和3b）。
对照果实花色素苷含量在整个冷藏过程中持续下降，从（0.33 ± 0.01）g/kg（0 d）降至（0.18 ±0.01）g/kg（30 d），降幅达45.2%（图3c）。MT 处理延缓了果实花色素苷含量的下降，贮藏15～30 d其含量平均值显著高于对照16.4%（图3c）。
图3 MT 处理对冷藏期间荔枝果实总酚（a）、类黄酮（b）和花色素苷（c）含量的影响
Fig.3 Effect of MT treatment on contents of total phenolics（a），flavonoids（b）and anthocyanins（c）in litchi fruit during refrigeration
注：*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001。
上述结果表明褪黑素处理可有效减缓冷藏荔枝果实酚类物质氧化和降解。
2.4 MT 处理对荔枝果实PPO 和POD 活性的影响
荔枝果实冷藏期间PPO 和POD 活性变化如图4 所示，对照果实二者的酶活性变化均呈先上升后下降的趋势，分别于冷藏第15 天和20 天达到峰值。MT 处理果实的PPO 与POD 活性变化规律和对照类似，然而其在冷藏大部分时间显著低于对照（图4a 和4b）。结果表明MT 处理能够显著抑制冷藏期间荔枝果实氧化酶活性，从而减轻果实酶促褐变。
图4 MT 处理对冷藏期间荔枝果实PPO（a）和POD（b）活性的影响
Fig.4 Effect of MT treatment on PPO（a）and POD（b）activities in litchi fruit during refrigeration
注：*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001。
2.5 MT 对荔枝果实抗氧化酶活性的影响
如图5a 所示，对照果实SOD 活性在冷藏的前10 d 中稳步上升，随后10 d 内保持不变，冷藏20～30 d 期间呈下降趋势。MT 处理诱导果实SOD活性增加，其活性在冷藏5～20 d 期间显著高于对照（图5a）。
总体而言，对照和MT 处理果实的CAT 活性在整个冷藏期间均呈先上升后下降的趋势，且均在第10 天达到最大值（图5b）。比较而言，MT 处理果实的CAT 活性在冷藏10-25 d 期间显著高于对照。
图5 MT 处理对冷藏期间荔枝果实SOD（a）、CAT（b）、APX（c）、MDHAR（d）、DHAR（e）和GR（f）活性的影响
Fig.5 Effect of MT treatment on SOD（a），CAT（b），APX（c），MDHAR（d），DHAR（e）and GR（f）activities in litchi fruit during refrigeration
注：*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001。
如图5c 所示，对照组果实APX 活性在冷藏的前20 d 呈线性升高趋势，随后有所降低。MT 处理使果实APX 活性迅速提升，其活性在冷藏期间（除第30 天外）显著高于对照果实（图5c）。
对照果实MDHAR、DHAR 和GR 活性均在冷藏前期逐渐升高，MDHAR 活性在15 d 时达到最大值，DHAR 和GR 活性在10 d 时达到最大值，随后逐渐下降（图5d-5f）。MT 处理使果实MDHAR、DHAR 和GR 活性提高（图5d-5f），三者活性值分别在10～25，5～25 d 和5～20 d 显著高于对照。
上述结果表明，MT 处理显著提高了冷藏期间荔枝果实抗氧化酶活性，从而提高了果实细胞ROS 清除能力。
2.6 MT 对荔枝果实AsA-GSH 循环代谢产物含量的影响
冷藏期间荔枝果实AsA、DHA、GSH 和GSSG含量以及AsA/DHA 和GSH/GSSG 比值变化情况如图6a-6f 所示。荔枝果实AsA 含量在第0 天时为（0.70 ± 0.001）g/kg，冷藏期间对照果实AsA 含量先升高后降低，于第15 天达到峰值（0.97±0.02）g/kg（图6a）。与对照果实相比，MT 处理显著提高了冷藏10～30 d 果实AsA 含量，此期间处理组含量的平均增幅达18.2%（图6a）。
对照组和MT 处理组果实DHA 含量在冷藏的前10 d 中并无差异，随后2 组果实DHA 含量显示快速升高趋势，然而，后者变化滞后于前者（图6b）。对照果实DHA 含量在冷藏后期（20～30 d）无明显变化，而MT 处理果实的DHA 含量在冷藏最后5 d 又明显下降（图6b）。比较而言，MT 处理果实的DHA 含量在第15，20 天和30 天时显著低于对照果实，降幅分别为39.5%，36.2%和58.8%（图6b）。
荔枝果实GSH 在冷藏0 d 时的含量为（0.072±0.003）g/kg，对照果实GSH 含量在冷藏的前10 d轻微提高，增至（0.085 ± 0.003）g/kg，随后呈线性下降趋势，第30 天时降至（0.064±0.003）g/kg（图6c）。MT 处理果实的GSH 含量在冷藏开始后稳步上升，在第20 天时达到最大值（0.096 ± 0.004）g/kg，随后呈直线下滑，直至贮藏结束（图6c）。相比之下，MT 处理果实GSH 含量在冷藏15～25 d 显著高于对照果实，此期间处理组较对照组的平均增幅达33.1%（图6c）。
荔枝果实在冷藏初始时的GSSG 含量为（0.079±0.002）g/kg，对照果实GSSG 含量在冷藏前期略微降低，第10 天时降至（0.071 ± 0.008）g/kg，随后稳步升高，并在第25 天到最大值（0.103±0.011）g/kg，最后5 d 略有回落（图6d）。MT 处理抑制了果实GSSG 积累，其处理果实在第15，20 天和25 天的GSSG 含量分别显著低于对照39.8%，46.9%和43.7%（图6d）。
荔枝果实的AsA/DHA 和GSH/GSSG 初始比值分别为2.66±0.26 和0.91±0.02，对照果实二者的比值均在冷藏第10 天达到最大值，分别为3.62±0.12 和1.27±0.17，随后逐渐降低（图6e 和6f）。相较于对照组，MT 处理极大地提升了果实AsA/DHA 和GSH/GSSG 比值，其处理果实的二者比值分别在第10，15，20，30 天和第15～25 天显著高于对照，整个冷藏期间较对照组分别平均提高80.4%和64.6%（图6e 和6f）。
图6 MT 处理对冷藏期间荔枝果实AsA（a）、DHA（b）、GSH（c）、GSSG（d）含量和AsA/DHA（e）、GSH/GSSG（f）比值的影响
Fig.6 Effect of MT treatment on AsA（a），DHA（b），GSH（c），GSSG（d）contents and AsA/DHA（e），GSH/GSSG（f）ratio litchi fruit during refrigeration
注：*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001。
上述结果表明，褪黑素处理可促进AsA-GSH循环中还原性产物的积累，维持果实细胞的氧化-还原平衡。
2.7 MT 处理对荔枝果实LcMsr 表达的影响
对照荔枝果实LcMsrA1 表达量在冷藏初期迅速升高，第10 天达到高峰，峰值是0 d 的2.7 倍，随后持续降低（图7a）。与对照果实相比，MT 处理诱导了果实LcMsrA1 表达量上调，其在第5，10，15，25 天时显著高于对照，其中在第10 天时较对照高85.3%（图7a）。
对照组果实LcMsrA2 表达量在冷藏开始后升高，5 d 后增到初始表达量的1.99 倍，随后的10 d保持不变，15 d 后有所下降（图7b）。除冷藏第15天，MT 处理果实LcMsrA2 表达量均显著高于对照，其中在冷藏第5 天和第10 天较为典型，分别是对照的2.47 倍和1.88 倍（图7b）。
对照果实LcMsrB1 表达量在冷藏的前5 d 迅速增加并达到最大值，之后持续下降，直至冷藏结束（图7c）。MT 处理显著促进了果实LcMsrB1 转录，其表达量在冷藏10～25 d 显著高于对照组（图7c）。
冷藏过程中荔枝果实LcMsrB2 表达量呈先升高后降低的变化趋势，对照组和MT 处理组果实分别在第15 天和第20 天达到最大值（图7d）。相比较，MT 处理果实的LcMsrB2 表达水平在第5，10，15 天和第20 天显著高于对照。
图7 MT 处理对冷藏期间荔枝果实LcMsrA1（a）、LcMsrA2（b）、LcMsrB1（c）和LcMsrB2（d）表达的影响
Fig.7 Effect of MT treatment on LcMsrA1（a），LcMsrA2（b），LcMsrB1（c）and LcMsrB2（d）expressions in litchi fruit during refrigeration
注：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
上述结果表明，MT 处理可通过显著上调冷藏期间荔枝果实Msr 基因表达而使蛋白质氧化损伤修复能力提高。
3 讨论
作者先前的研究表明，外源MT 处理可以调节“白糖罂”荔枝果实从低温贮藏转入货架期的能量代谢和脯氨酸代谢，提高其能荷水平和脯氨酸含量，以及维持细胞膜的功能与完整性，从而减轻果实冷藏出库后的冷害症状[2]。本研究发现，0.5 mmol/L MT 浸泡处理可显著降低冷藏期间“紫娘喜”荔枝果实冷害指数并减缓果皮失色，表明MT能够诱导荔枝果实耐冷性提高并维持荔枝果实的冷藏品质，这与在“妃子笑”荔枝[31]果实上获得的结果一致。
细胞膜是分隔细胞内部与外界环境的屏障，也是细胞响应外界环境胁迫的关键部位[32]。低温胁迫可引发ROS 过量积累，继而攻击细胞膜并引发膜脂过氧化，使膜透性增大及膜完整性被破坏，最终引发果实冷害[32-33]。膜相对电导率、MDA 积累水平和ROS 生成量等是衡量膜完整性和氧化破坏程度的重要生理、生化指标[32]。本研究中，MT 处理可显著抑制冷藏荔枝果实ROS 生成量、MDA 积累量和膜相对电导率升高，表明MT 可缓解冷藏荔枝果实氧化胁迫并维持膜完整性，从而减轻果实冷害，这与Jannatizadeh[34]对石榴果实的研究结果一致。
植物细胞膜系统损伤可引起细胞区室化结构丧失，促使酚类物质与PPO 和POD 接触，进而引发酶促褐变反应[3]。Sun 等[35]对荔枝果皮PPO 酶促动力学的研究表明，PPO 可催化酚单体（表儿茶素和原花青素A2）生成邻醌，其进一步缩合成棕色不溶性物质，从而导致果皮褐变。此外，花色素苷也是一类酚类化合物，是使荔枝果皮呈现红色的主要物质，可被花色素苷酶催化降解，导致荔枝果皮红色损失，且其降解产物可作为POD 的催化底物而引起果皮褐变[3]。本研究中，荔枝果实总酚和类黄酮含量在冷藏初期呈上升趋势，表明低温胁迫诱导酚类物质合成，其可能作为抗氧化物质参与果实抗冷响应。随着冷藏时间的不断延长，果实遭受氧化胁迫的程度加剧，导致总酚、类黄酮及花色素苷发生氧化反应而使其含量降低。MT 处理增加了果实在冷藏初期的总酚和类黄酮含量，表明MT 可激活酚物质合成途径，增强果实抗冷能力。该结论与MT 应用在桃果实上的结果相一致[10]。进一步研究发现，MT 处理延缓了冷藏中、后期荔枝果实总酚、类黄酮与花色素苷含量下降，并抑制了PPO 和POD 活性，表明MT 可维持细胞区室化功能，从而减轻冷藏荔枝果实酶促褐变，这与作者先前使用MT 控制“紫娘喜”荔枝果实常温褐变所得结论相似[36]。
植物抗氧化系统在维持细胞氧化-还原稳态中发挥着重要作用[32，37]。SOD、CAT、APX、MDHAR、DHAR 和GR 是植物抗氧化系统中重要的抗氧化酶，直接或间接催化清除细胞内ROS 并参与调节低温胁迫响应[38]。这些抗氧化酶中，SOD 可以催化O2·-发生歧化反应，生成H2O2 和O2，而H2O2 进一步在CAT 催化下分解成H2O 和O2[33，38-39]。APX、MDHAR、DHAR 和GR 是植物AsA-GSH 循环中的关键酶，可确保细胞内H2O2 被有效清除[38]。AsA和GSH 均具有较强的还原性，是构成植物非酶抗氧化系统的重要物质，提高AsA 和GSH 含量水平对于增强植物抗冷性有着重要意义[40-41]。
外源MT 已被证实可以通过激活抗氧化系统及抑制ROS 生成来提高小麦、番茄等作物的抗冷性[42-43]。本研究中，外源MT 处理诱导了荔枝果皮抗氧化酶（SOD、CAT、APX、MDHAR、DHAR 和GR）和非酶抗氧化物（AsA 和GSH）水平的提升，能够有效猝灭过量生成的ROS，进而延缓荔枝果实低温贮藏期间冷害的发生。值得注意的是，上述抗氧化酶在荔枝冷藏中、后期呈降低趋势，这意味着果实受冷胁迫影响而使细胞逐渐丧失蛋白质合成功能，而此过程可被MT 处理所延缓。
在生物体中，含巯基的氨基酸（如甲硫氨酸和半胱氨酸）极易被ROS 氧化修饰，导致蛋白质损伤[44]。甲硫氨酸氧化后形成甲硫氨酸亚砜（Methionine sulfoxide，MetO），其以S 型和R 型2 种非对映异构体（S-MetO 和R-MetO）形式存在[30]。然而，S-MetO 和R-MetO 可分别被甲硫氨酸亚砜还原酶（Methionine sulfoxide reductase，Msr）A 和B（MsrA 和MsrB）催化还原[30]。在植物中，Msr 系统可以通过氧化蛋白修复机制参与细胞对氧化胁迫的应答[45]。有研究表明，编码MsrA 和MsrB 的基因在调控采后荔枝和龙眼果实的抗冷性和抗衰老方面具有积极作用[30，36，45]。本研究中，对照荔枝果实LcMsrA1、LcMsrA2、LcMsrB1 和LcMsrB2 在冷藏前期和中期的表达水平呈上调趋势，这可能与低温胁迫下ROS 及少量蛋白氧化产物的诱导有关。随着冷藏时间的延长，ROS 过量积累引发的蛋白质氧化损伤与自身修复能力发生失衡，导致这些基因表达量下调，从而使果实冷害加剧。外源MT显著上调了冷藏荔枝果实LcMsrA1、LcMsrA2、LcMsrB1 和LcMsrB2 表达，表明MT 可通过调节氧化蛋白修复系统来减轻蛋白质氧化损伤，进而降低了果实冷害发生。
4 结论
MT 浸泡处理有效减轻了“紫娘喜”荔枝果实在低温贮藏期间的冷害。相关机制研究表明，MT能够抑制冷藏荔枝果实ROS 生成，减轻膜脂过氧化，从而维持细胞膜完整性并使酶促褐变反应减弱。此外，MT 处理可提高冷藏荔枝果实的抗氧化活性及蛋白质氧化损伤修复能力，导致ROS 生成水平及蛋白质氧化损伤程度减轻。由于MT 属天然有机化合物，具有安全、环保的优点，因此其在荔枝冷藏保鲜中具有良好的应用前景。
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