牛油，又称为牛脂，是用牛的表皮下、肌肉间、腹腔内等部位脂肪组织进行加工、提炼后得到的可食用的油脂。牛油通常为类白色、淡黄色或深黄色，其口感细腻，风味醇厚，精制后熔点一般为43～49 ℃[1]。牛油按照脂肪的来源部位可分为牛腰肚油（Beef kidney tallow，BKT）和牛分割油（Beef split tallow，BST）。牛腰肚油是用牛腰肚部位取得的较为纯净单一的牛脂肪提炼所得的牛油；牛分割油是用牛肢体上分割取得的较为零碎的牛脂肪（通常带有瘦肉组织和血液）提炼所得的牛油[2]。牛油具有特殊且不可替代的风味[3]。前期研究发现，从油脂味、牛膻味、奶香味、焦香味、汗酸味和甜味等6 种典型香型对牛油进行感官评价，牛腰肚油以油脂味、牛膻味较为明显，而牛分割油以汗酸味和牛膻味更为明显[4]。因色泽鲜亮、口感香醇、加工特性稳定，牛油常被用在烘焙制品、乳制品、火锅底料等食品中，赋予焙烤类食品酥脆的口感，为制得的火锅底料增香、增色[5-6]。特别是在川渝地区，牛油作为火锅底料的重要原料之一，其风味直接决定麻辣牛油火锅的风味[7]。目前，在牛油供应市场上，存在向牛油中掺入羊油（即用羊脂肪加工提炼的油脂）假冒纯正牛油的现象，一方面是因为羊油价格比牛油低，部分生产商通过这种方式降低成本；另一方面是因为与牛油比，羊油具有明显的奶香味[4]，羊油的掺入可在一定程度上为后续火锅底料的制作增加香气层次。针对是否能在牛油中掺入羊油，以及在火锅底料制作中羊油能否替代牛油目前尚无相关标准和规定，如何规范化牛油和羊油的生产标准是亟待解决的问题。牛油和羊油的脂肪酸构成相似，目前如何区分二者尚无有效方法。基于牛油和羊油的呈香差异，能否通过香气成分对牛油和羊油加以区分，是值得研究的问题。
目前关于牛油和羊油的研究主要集中在工艺上，对其香气的研究较少，且主要针对其挥发性成分。黄玉坤等[8]利用电子鼻结合顶空固相微萃取/气-质谱联用技术（Headspace solid-phase microextraction/gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME/GC-MS）测定3 种香型（无香、淡香、浓香）牛油中的挥发性成分，结果发现电子鼻能够灵敏检出不同香型牛油气味的差异，醛类化合物是造成其香气差异的关键成分。齐安安等[9]通过应用MassworksTM 质谱解析软件结合NIST11谱库的方法，对羊油中的42 种香气成分实现了定性分析。为开发肉味香精，林喆等[10]采用SPME/GC-MS 分析食用牛油的挥发性成分，发现己醛、庚醛、辛醛、壬醛、癸醛、己酸、癸酸、肉豆蔻酸、（E）-2-戊烯醛、（E）-2-己烯醛、（E）-2-庚烯醛、（E）-2-辛烯醛、（E）-2-壬烯醛、（E）-2-癸烯醛、（E，E）-2，4-庚二烯醛、（E，E）-2，4-癸二烯醛、（E）-2-十一烯醛、1-己醇、1-庚醇、1-辛醇为牛肉风味形成的前体物质。吴肖等[11]向牛肉酶解液中添加不同过氧化值（Peroxide value，POV）的氧化牛油，并进行美拉德热反应，发现氧化牛油会影响含硫氨基酸和鲜味氨基酸的反应活性，以及肽分子量的分布，从而影响牛肉风味的形成。张杰等[12]采用SPME/GC-MS 技术对牛油、鱼油两种动物油制成的火锅底料的香味物质进行比较，分别从鱼油和牛油火锅底料中鉴定出香味物质36 种和59 种，与牛油火锅底料相比，鱼油火锅底料香味较差、滋味较好。目前尚无牛油和羊油香气差异的对比研究。
针对香气成分分析的主要手段有气相色谱-嗅闻-质谱联用技术（GC-O-MS）及电子鼻的聚类分析等。电子鼻是通过模拟哺乳动物的多种嗅觉感受器细胞，并根据自身已存储的气味指纹数据来快速识别样品中对应的气味特点[13-14]。目前电子鼻已应用在肉类新鲜程度识别[15-17]、挥发性物质的分析[18]和鉴别掺假情况[19-20]中。气相色谱-嗅闻-质谱联用技术（Gas chromatograph-olfactometry-mass spectrometer，GC-O-MS）是将气相色谱-质谱技术与嗅闻技术联合使用，可将气相色谱的高效分离能力与人类的嗅觉能力结合，从而将食品中挥发性物质的呈香特性的成分进行鉴别，成为研究食品香气成分的有力工具[21-22]，目前已广泛用于各种食品的香气和异味分析中。例如，利用GC-O-MS，杨帆等[23]明确了顺（Z）-6-壬烯醛是导致热处理前、后西瓜汁香气差异的主要成分；通过GC-OMS 分析，白酒所呈现的糠味被发现是由8 种物质所致，包括2-糠酸乙酯4-乙烯基苯酚、4-乙烯基愈创木酚、1，4-二甲氧基苯、1，2-二甲氧基苯、笏、嗅素，[3.3.1]壬二烯-3，7-二酮[24]。
将电子鼻与气相色谱-嗅闻-质谱联用技术相结合，既可客观评价气味特点，又可对呈香物质进行鉴别，两者相互验证和补充，从而实现更加全面的香气研究[25]。本研究采用电子鼻和GC-O-MS 相结合，分析牛油和羊油的香气成分，明确其香气差异，为牛油的风味品质控制和应用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
9 个牛分割油F1-F9、6 个牛腰肚油Y1-Y6、5个羊油YYD1-YYD5（见表1，脂肪原料来自于不同的产地，生产工艺相同），广汉市迈德乐食品有限公司；2，4，5-三甲基噻唑、正构烷烃（C7-C30）（均为色谱纯级），美国Sigma公司；氦气（99.9990%）、氮气（99.9992%），北京氦普北分气体工业有限公司。
表1 试验样品信息
Table 1 The information of samples
1.2 仪器与设备
JA5003 型数字电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；PEN3 型电子鼻，德国AIRSENSE公司；CAR/PDMS/DVB 萃取头，美国Supelco 公司；固相微萃取手动进样手柄，美国Supelco 公司；7890A/7000B 气相色谱-质谱联用仪，美国Agilent公司；Sniffer 9000 嗅闻仪，瑞士Brechbuhler 公司；DB-WAX（30 m×0.25 mm×0.25 μm）色谱柱，美国J &W 公司；HH-1 电子恒温水浴锅，国华电器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 电子鼻检测条件 PEN3 型电子鼻传感器由10 种金属氧化物传导列构成，传感器性能描述如表2 所示。对20 个样品进行电子鼻分析。准确称取3 g（±0.001 g）样品于顶空瓶内，于水浴锅上加热（60 ℃）至融化，恒温密封顶空20 min，使样品气体能充分挥发在顶空瓶内，至气体达到饱和平衡状态后，正式插入电子鼻探头，吸取顶端空气进行测定。电子鼻测试条件：样品测试时间350 s，采样间隔1 s，清洗时间100 s，归零时间8 s，载气流速300 mL/min，进样流量300 mL/min。选取传感器在第320 秒时获得的稳定信号进行分析。每个样品检测重复3 次。
表2 电子鼻传感器类型
Table 2 Standard sensor arrays and performance of Electronic nose
1.3.2 SPME 条件 准确称取6.0 g（±0.001 g）样品于顶空瓶内，向瓶中加入1 μL 1.013 μg/μL 2，4，5-三甲基噻唑作为内标物，旋紧瓶盖后置于60 ℃水浴锅中平衡30 min，插入固相微萃取装置，在60 ℃下吸附30 min。随后将吸附针插入GC-MS的进样口中，在250 ℃条件下解析5 min。每个样品检测重复3 次。
1.3.3 GC 条件 设定初始温度为40 ℃，保持温度恒定3 min，随后按以下方式升温：以3.5 ℃/min的速度升温至142 ℃，以2 ℃/min 的速度升温至150 ℃，以3.5 ℃/min 的速度升温至177 ℃，以6 ℃/min 的速度升温至200 ℃，以10 ℃/min 升温至230 ℃，保持温度恒定3 min。使用高纯度氦气（99.9990%）作为载气，以1.2 mL/min 的速度作为载气的恒定流速，进样口温度250 ℃，设置为不分流状态。
1.3.4 MS 条件 MS 条件：电子轰击（Electron impact，EI）离子源，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，传输线温度28 ℃，质量扫描范围m/z 40～250。
1.3.5 嗅闻方法 由3 名感官评价人员（2 女1男）嗅闻，记录嗅闻时间、嗅闻气味特征和嗅闻强度。每个样品分析3 次。感官评价人员是经过培训的专业人员，具有超过1 年的嗅闻实践经验，并提前2 周熟悉牛油样品的香气。具体嗅闻条件：嗅觉检测器接口温度为200 ℃，在嗅闻时通过惰性气体——氮气吹扫超纯水产生水汽润湿嗅闻管道，防止嗅闻人员鼻腔干燥可能导致的鼻黏膜出血。
1.3.6 定性方法 牛油和羊油中香气成分的定性方法如下：
1）将目标化合物的检测质谱图与NIST 库中记载的质谱图作比对，选择匹配度高的检索结果。
2）利用目标化合物的出峰时间及系列正构烷烃（C7～C30）的出峰时间，按（1）式计算目标化合物的实际RI 值。比对实际RI 值和理论RI 值，判断定性结果。
式中：n——系列正构烷烃的碳原子数量；Tn——具有n 个碳原子数的正构烷烃Cn 的保留时间；T（n+1）——具有（n+1）个碳原子数的正构烷烃C（n+1）的保留时间；Ta——样品中目标未知化合物的保留时间位于Tn 与T（n+1）之间。
3）对化合物气味的实际嗅闻结果进行比对，辅助定性。
4）对每个化合物对应的标准品的保留时间以及质谱数据进行比对，完成最终准确定性分析。
1.3.7 定量方法 采用内标法对样品定量，以1.013 μg/μL 2，4，5-三甲基噻唑作为内标化 合物，待测化合物与内标化合物的相应峰面积与浓度的关系按（2）式计算，得到待测化合物的浓度。
式中，Cx 和Ci——分别表示未知物的浓度和内标的浓度（μg/μL）；Sx 和Si——分别表示未知物的出峰面积和内标的出峰面积（mAu·s）。
1.4 数据分析
电子鼻数据的主成分分析（Principal component analysis.PCA）和线性判别分析（Linear discriminant analysis，LDA）由电子鼻PEN3软件Winnmuster 自带程序完成，正交偏最小二乘判别分析（Orthogonal Partial Least-Squares Discrimination Analysis，OPLS-DA）通过SPSS 22.0 软件实施，其它数据由Microsoft Excel 2010 统计处理并绘图。
2 结果与分析
2.1 电子鼻分析牛油和羊油的香气成分
对9 个牛分割油、6 个牛腰肚油和5 个羊油进行电子鼻分析，得到10 个感应器的数据结果，见表3。根据牛分割油、牛腰肚油和羊油的感受器响应值制成雷达图（图1）。从表3 及图1 可以看出，所有牛油和羊油样品中的W5S 信号响应值显著高于其它感应器，且对烷烃、芳香族化合物灵敏。其次是W2S、W1S、W2W 的信号响应值较高，其余感应器检测到的响应值较小，W1W 感应器在所有样品中均未感应到数据。这表明牛油和羊油样品的香气构成具有一定的相似性，其差异体现在传感器的响应强度上。
图1 牛油、羊油香气电子鼻响应信号雷达图
Fig.1 Radar graph for odor intensity of beef tallow and mutton tallow samples measured by electronic nose
表3 9 个牛分割油、6 个牛腰肚油和5 个羊油样品的电子鼻响应值
Table 3 Response values of electronic nose for 9 beef split tallow，6 beef kidney tallow and 5 mutton tallow samples
牛分割油在W5S 传感器上响应信号最强，其次为W6S 和W1S 传感器。牛分割油中F5 在所有样品中响应信号最强，在W5S 和W2S 传感器上的响应信号值高于其它样品，而F6 的响应信号值最弱。
牛腰肚油在W1C 传感器上的响应信号值明显大于牛分割油及羊油，该传感器对芳香型化合物敏感；在W5S、W1S、W2S、W2W 传感器上的响应信号值明显小于牛分割油及羊油，其余传感器上的响应值较为接近。牛腰肚油中Y4 整体响应值最强，尤其是在W5S 和W2S 传感器上显著高于其它样品。Y6 响应信号值最弱，也体现在W5S 和W2S 传感器上。
羊油在W5S 传感器上响应值最强，其次是W2S，样品YYD5 的各传感器响应均最强，然而羊油样品间差异较大。YYD2 和YYD4 为羊肚油，电子鼻检测结果较为接近。其余羊油样品均为羊腰肚油。YYD3 与YYD5 结果较为接近，YYD1 响应值偏差较大。造成以上差异的原因推测可能与产地及部位不同有关[26]。
牛分割油、牛腰肚油和羊油3 类样品香气成分的差别主要体现在W5S 和W2S 两个传感器上，其响应信号值强、弱与烷烃、醇类和芳香族化合物含量相关。
2.2 电子鼻结合PCA 分析
对9 个牛分割油、6 个牛腰肚油和5 个羊油样品所获电子鼻响应数值进行主成分分析（Principal component analysis，PCA），结果如图2 所示。第1 主成分的贡献率为91.108%，第2 主成分的贡献率为5.7387%，第1 主成分和第2 主成分的总贡献率为96.847%。PCA 分析结果显示，牛腰肚油整体分布在坐标轴区域的下方，牛分割油分布在上方，表明二者在香气上存在差异，电子鼻结合PCA 分析可以区分。羊油分布在中间，与牛分割油存在重叠，表明其香气存在一定的相似性。
图2 牛分割油、牛腰肚油和羊油样品的电子鼻主成分分析图
Fig.2 Principal component analysis of beef split tallow，beef kidney tallow and mutton tallow based on electronic nose
2.3 电子鼻结合LDA 分析
对9 个牛分割油、6 个牛腰肚油和5 个羊油样品所获电子鼻响应数值进行线性判别分析（Linear discriminant analysis，LDA），结果如图3所示。LDA 分析可以明显区分牛腰肚油、牛分割油和羊油。牛分割油整体分布在左侧，牛腰肚油分布在右下角，羊油分布于中间，与牛分割油、牛腰肚油均实现了明显区分，然而，其与牛分割油距离更近，这与PCA 结果一致。以上结果表明电子鼻结合LDA 分析可以表征牛分割油、牛腰肚油和羊油的香气差异。
图3 牛分割油、牛腰肚油和羊油的电子鼻线性判别分析图
Fig.3 Linear discriminant analysis of beef split tallow，beef kidney tallow and mutton tallow samples based on electronic nose
2.4 GC-O-MS 分析牛油和羊油的香气物质
采用GC-O-MS 方法从20 个牛油、羊油样品中共检测到47 种挥发性成分，其中39 种可被嗅闻。这39 种香气物质见表4～6，包含19 种醛类、6种醇类、2 种酯类、2 种酸类、2 种酮类、4 种杂环类和4 种其它类香气物质。
牛分割油、牛腰肚油和羊油所含香气物质种类存在差异。牛油中香气物质的种类较为丰富，羊油中香气物质种类较少。牛分割油所含可被嗅闻的香气物质39 种，数量最多。牛腰肚油其次，所含香气物质32 种。羊油所含香气种类最少，29 种。其中24 种在3 种油脂中均有，构成牛油和羊油的基本香气轮廓，这是牛油和羊油香气存在相似性的原因。从香气物质种类的差异来看，仅在牛分割油样品中检出的香气物质有清新味的丁醛、脂肪味的十二烷醇；仅在牛腰肚油检出的香气物质有鱼腥味的1-戊烯-3-酮和甜味的2-乙基呋喃；仅在羊油中检出的香气物质有脂肪味的（E，E）-2，4-壬二烯醛、清新味的十一酮和甜味的二氢-5-辛基-2（3H）-呋喃酮。在牛油中检出而未在羊油中检出的香气物质有：清新黄瓜味的（E）-2-壬烯醛、甜味的2-十一碳烯醛、焦糖味的γ-丁内酯、肥皂味的2-庚酮和青豆味的2-戊基呋喃；在牛分割油和羊油中检出而未在牛腰肚油中检出的有：黄油味的1-戊烯-3-醇、清新味的壬酸、蘑菇味的戊基吡啶、爆米花味的戊基吡嗪和香脂味的苯乙烯。以上这些香气物质的差异形成3 种油脂各自的香气特点。
从香气物质含量上看，在牛油和羊油的所有样品中，己醛（青草味）、庚醛（脂肪味）、壬醛（脂肪味）、辛醛（脂肪味）、（E）-2-壬烯醛（黄瓜味）、1-辛烯-3-醇（蘑菇味）和乙酸（酸味）等化合物的含量普遍较高。各样品中，具有动物油脂、青草味以及坚果等香味的醛类物质种类最为丰富，其次是酸类、酮类和醇类。牛分割油、牛腰肚油和羊油中不同类型香气物质的含量和占比如图4 所示。由图4a 可知，羊油的香气物质总含量大于牛油，与电子鼻分析中羊油整体信号响应值最大一致；醛类化合物、醇类化合物、酸类化合物和其它化合物的含量均高于牛腰肚油和牛分割油；牛腰肚油和牛分割油相比，牛腰肚油香气物质总量更高，醛类、醇类和其它化合物都较牛分割油高。牛分割油的酸类化合物含量比牛腰肚油高。由图4b 可知，醛类化合物在牛油和羊油所含香气物质中占比均高于其它各类化合物的占比，其中，牛腰肚油的醛类化合物占比最高；醇类化合物在牛腰肚油中相对占比更高；酸类化合物在羊油香气中占比高于牛油；其它化合物在羊油中占比稍高，与牛分割油相差无几，在牛腰肚油中含量较低。
图4 9 个牛分割油、6 个牛腰肚油和5 个羊油香气成分含量（a）和香气物质占比（b）
Fig.4 Contents（a）and proportion（b）of aroma components among 9 beef split tallow，6 beef kidney tallow and 5 mutton tallow
2.5 基于GC-MS 数据的OPLS-DA 分析
对20 个牛、羊油样品的GC-MS 数据进行正交偏最小二乘判别分析（Orthogonal partial least-squares discrimination analysis，OPLSDA），结果如图5 所示。通过OPLS-DA，牛分割油、牛腰肚油和羊油各自聚成一类。牛分割油大部分集中在第1 象限，牛腰肚油全部分布在第4 象限，羊油大部分分布在第3 象限。牛腰肚油分布较为集中，而其它两种油分布分散，推测其原因为：牛分割油是肥肉、肥膘，皮下脂肪，带有血水和未剔除干净瘦肉等混合在一起得到的牛油，其构成复杂多样，风味差异较大。羊油样品的部位不像牛油有严格的区分，因此风味差异也较大[3]。牛腰肚油脂肪构成单一，由牛腰肚部位的整块脂肪提炼而成，因此风味特点较为集中。
图5 基于牛油、羊油的GC-MS 香气物质分析结果的OPLS-DA 分析
Fig.5 Orthogonal partial least-squares discrimination analysis of beef tallow and mutton tallow samples based on gas chromatograph-mass spectrometer
结合表4～6 可知，牛分割油中，F5 样品中的庚醛（清新味）含量最高，达377.2 ng/g，F2 和F7 样品中香气化合物含量最少，许多种类香气化合物未被检出。牛腰肚油中，Y4 样品中的壬醛（清新味）含量最高，为557.5 ng/g。羊油中，YYD5 样品中的壬醛含量最高，为482.5 ng/g。在YYD3 与YYD5 样品中，酸味化合物乙酸含量高于其它样品。只有YYD1 样品中含有壬酸，而其它样品中均只包含乙酸（酸味）。在F4、F5、F6、F8、F9，Y1、Y2、Y3、Y4、Y5，YYD3 和YYD5 12 个样品中，脂肪味的庚醛、辛醛、（E）-2-庚烯醛、（E）-2-辛烯醛、（E，E）-2，4-庚二烯醛和（E）-2-癸烯醛等6 个醛的含量高于其它样品。
3 结论
经电子鼻和GC-O-MS 法分析，发现牛腰肚油、牛分割油和羊油样品中香气成分存在差异。电子鼻结合LDA 分析和GC-MS 结合OPLS 分析是区分牛分割油、牛腰肚油和羊油中香气成分差异的两种快速检测方法。采用GC-O-MS 技术从牛分割油、牛腰肚油和羊油中共检出39 种可被嗅闻的香气物质。其中，24 种香气物质在3 种油脂中共有，构成其香气的基本构成。牛分割油特有的香气成分为：清新味的丁醛和脂肪味的十二烷醇；牛腰肚油被检出独有的香气成分有：鱼腥味的1-戊烯-3-酮和甜味的2-乙基呋喃；羊油中特有的香气成分有脂肪味的（E，E）-2，4-壬二烯醛、清新味的十一酮和甜味的二氢-5-辛基-2（3H）-呋喃酮。
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