非酶糖基化 （Non-enzymatic gluco-sylation，NEG）是一系列复杂的非酶促反应，是蛋白质-还原糖发生美拉德反应的第1 步，形成席夫碱和Amadori 等可逆的产物，经过氧化、重排、交联等过程， 最终形成不可逆的晚期糖基化终末产物（Advanced glycation end products， AGEs）。 AGEs 不仅在加工食品中广泛存在， 在人体内由于还原糖类羰基化合物和蛋白类氨基化合物的存在也进行非酶糖基化反应。 国内外研究证实AGEs 对人体有影响，能导致糖尿病并发症视网膜病变（DR）[1]、动脉糊样硬化[2]、组织老化[3]。 AGEs 形成机制的复杂性给AGEs 抑制剂的研究带来很多困难。 AGEs在形成过程中经历氧化过程， 提示抗氧化剂可能对AGEs 的形成有抑制作用。 目前， 对食源性AGEs 抑制剂的研究尚处于起步阶段。有研究证实天然酚类物质具有显著的抗糖基化能力， 能有效抑制AGEs 的生成，对许多AGEs 有关疾病起到一定预防和治疗功效[4]。Ferchichi 等[5]研究证实：从金丝桃科和叶绿素科分级分离的多酚对AGEs 有抑制作用， 对预防微血管疾病及其并发症有一定潜力。
近年来， 抗氧化肽成为国内外研究最多的生物活性肽之一。 目前有大豆、玉米、乳清、鱼、贻贝和虾等多种抗氧化肽[6]。本研究在建立体外非酶糖基化模拟体系的基础上， 在反应体系中添加抗氧化肽，探究抗氧化肽对AGEs 的影响作用，为为拓展抗氧化肽的新用途提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
甲鱼，市售；D-葡萄糖、肌肽，上海沪试实验室器材股份有限公司；标准牛血清白蛋白（BSA）、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）、硝基四氮唑蓝（NBT）（100 mg 溶 于0.1 mol/L pH=10.8 的碳酸盐缓冲液），SIGMA 公司； 注射用青霉素钠、 硫酸链霉素（双抗），Solarbio 公司；其它试剂均为分析纯级；试验用水均为超纯水。
1.2 仪器与设备
UV-124 型紫外-可见分光光度计， 岛津有限公司；F-7000 荧光分光光度计，日立高新技术公司；TENSOR27 型傅里叶变换红外光谱仪，德国布鲁克公司；PHS-3C pH 计， 杭州奥立龙仪器有限公司；Biofuge Prino R 型台式高速冷冻离心机，德国贺利氏公司；FD-1D-50 型冷冻干燥机，北京医康实验仪器有限公司；恒温培养箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；超净台，苏州净化设备有限公司；水浴锅，上海亚荣生化仪器厂。
1.3 试验方法
1.3.1 甲鱼抗氧化肽的制备 甲鱼抗氧化肽按以下流程制备： 甲鱼宰杀→去脂→脱壳→蛋白酶酶解→灭酶（90 ℃，15 min）→离心过滤（4 000 r/min，10 min）→保存、备用。
1.3.2 甲鱼抗氧化肽分子质量的测定 参考国家标准GB/T 22492-2008《大豆肽粉》的方法测定肽的相对分子质量分布[7]。
1.3.3 DPPH·清除能力的测定 DPPH·清除率测定参考Umayaparvathi 等[8]的研究方法，取0.1 mL蛋白酶解液， 加入2.8 mL 1×10-4 mol/L DPPH·无水乙醇溶液，混匀后在室温下避光反应20 min，并在4 000 r/min 下离心10 min， 取上清液在波长517 nm 处测定吸光度，空白组以等体积无水乙醇溶液代替DPPH·溶液，对照组以等体积蒸馏水代替样品溶液， 并以等体积蒸馏水和无水乙醇混合液空白调零。 清除率（I）按下式计算：
式中，A0——对照组吸光度；Ai——样品组吸光度；A——空白组吸光度。
1.3.4 体外蛋白质-还原糖糖基化体系建立 参考张丽娜等[9]、李军等[10]和吴光杰等[11]的研究方法建立蛋白质-还原糖体系。 无菌条件下，在稀释后的PBS 溶液中加入BSA、D-葡萄糖、EDTA、 青霉素钠、 硫酸链霉素， 使各组分终含量为EDTA 8 μmol/L、双抗100 U/mL、BSA 20 mg/mL、D-葡萄糖80 μmol/L。 在上述配置好的溶液中加入甲鱼抗氧化肽，配置成质量浓度为0.25，0.50，0.75，1.00 mg/mL 的溶液。 同时以肌肽作为阳性对照。 保鲜膜覆盖，在37 ℃生化培养箱中避光温孵，温孵时间分别为3，7，14，21，28 d。 分别设不加样品组a；不加D-葡萄糖、不加样品组b；不加BSA、不加样品组c； 不加BSA 组d； 不加D-葡萄糖组e，5 组对照组。 试验设3 个平行。
分别取NEG 反应体系反应的第3，7，14，21，28 天时各组的反应液0.1 mL，加入4 mL NBT，37℃温孵15 min 后， 立即加入15%乙酸0.1 mL，并于冰水浴中终止反应，于波长530 nm 处测定其吸光值A， 甲鱼抗氧化肽对NEG 反应的抑制率（IRNEG）按式（2）计算：
分别取AGEs 生成反应体系反应的第3，7，14，21，28 天时各组的反应液1 mL，检测其荧光值F，检测条件为：激发波长370 nm、发射波长440 nm、狭缝5 mm。 甲鱼抗氧化肽对AGEs 生成的抑制率（IRAGEs）按式（3）计算：
1.3.5 红外光谱分析 样品冷冻干燥后将样品与干燥的KBr（质量比1∶100）混合置于玛瑙研钵中，研磨均匀后的粉末压制成片，光谱范围4 000～400 cm-1，扫描次数32 次。
1.3.6 数据统计分析 本试验数据以平均数±标准差表示（
±s），用SPSS 16.0 统计软件分析。 单因素方差分析检验，以P＜0.05 为差异显著，P＜0.01为差异极显著。
2 结果与分析
2.1 不同蛋白酶制备甲鱼抗氧化肽的DPPH·清除率
由表1 可知，4 种蛋白酶分别以最佳的酶解条件酶解甲鱼蛋白4 h 时， 中性蛋白酶酶解后的酶解液DPPH·清除率最高，达（76.45±3.16）%，明显优于其它3 种酶， 故选用中性蛋白酶酶解甲鱼蛋白制备甲鱼抗氧化肽。
表1 不同蛋白酶制备甲鱼抗氧化肽的DPPH·清除率
Table 1 DPPH·clearance of turtle antioxidant peptides prepared by different proteases
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2.2 甲鱼抗氧化肽分子质量分布
由图1 可知， 甲鱼抗氧化肽的相对分子质量在1 000 u 以上的占总组分的30.32%； 相对分子质量在1 000～200 u 范围占总组分的63.23%；相对分子质量在200～128 u 范围占总组分的4.24%；相对分子质量在128 u 以下的占总组分的2.21%，甲鱼抗氧化肽分子质量主要分布在1 000～200 u。Zhong 等[12]报道分子质量＜1 ku 的鲢鱼加工副产品蛋白质肽SCPH-V 具有较高的DPPH·清除率。 张东杰等[13]的研究表明，分子质量在156～1 439 u 范围的小分子肽具有较高的抗氧化活性。 李桂峰等[14]的研究表明，用木瓜蛋白酶水解双孢菇蛋白质制得的600～2 600 u 之间的肽具有很好的·OH清除率以及较好的O2-·清除率。 Mendis 等[15]和庄永亮等[16]认为肽类物质的相对分子质量低于3 000 u 时具有良好的抗氧化性。 Alemán 等[17]的研究表明分子质量在500～1 400 u 范围的鱿鱼胶原蛋白酶解物具有较好的抗氧化活性。 本试验研究结果与以上文献报道结果一致， 即具有较高抗氧化活性的肽的相对分子质量相对较小。
图1 甲鱼抗氧化肽高效液相色谱图
Fig.1 High performance liquid chromatography of turtle antioxidant peptides
2.3 甲鱼抗氧化肽对蛋白质-还原糖糖基化体系的影响
2.3.1 甲鱼抗氧化肽对NEG 反应的影响 如图2所示，在糖基化的开始阶段，随着甲鱼抗氧化肽和肌肽质量浓度的增加，NEG 的抑制率也增加，并呈正相关。随着处理时间的延长，相同质量浓度的肌肽和甲鱼抗氧化肽对NEG 反应的抑制率呈先升高后降低的趋势，说明当反应到28 d 时底物可能已基本消耗完。当肌肽质量浓度为1.00 mg/mL、温孵7 d 时，对NEG 反应的抑制率达76.17%，然而从第7 天开始， 肌肽对糖基化反应体系产生的NEG 反应的抑制率明显降低，波动较大。
图2 甲鱼抗氧化肽和肌肽对NEG 反应的抑制作用
Fig.2 Inhibitory effects of turtle antioxidant peptides and carnosines on NEG
注： 不同大写字母代表相同质量浓度甲鱼抗氧化肽处理糖基化反应体系不同时间对NEG 反应的抑制作用具有显著差异（P＜0.05），不同小写字母代表相同质量浓度肌肽处理糖基化反应体系不同时间对NEG 反应的抑制作用具有显著差异（P＜0.05）。
各质量浓度的甲鱼抗氧化肽对糖基化反应的各个阶段的NEG 反应抑制率都维持在较高水平，波动较小。甲鱼抗氧化肽质量浓度为1.00 mg/mL、温孵时间为21 d 时， 对NEG 反应的抑制率达到68.79%。
2.3.2 甲鱼抗氧化肽对蛋白质-还原糖糖基化终产物AGEs 的影响 如图3 所示， 随着甲鱼抗氧化肽和阳性对照肌肽质量浓度的增加， 二者对蛋白质-还原糖糖基化终产物AGEs 生成的抑制率逐渐增加。随着处理时间的延长，相同质量浓度的甲鱼抗氧化肽和肌肽对AGEs 的抑制率逐渐增加，说明甲鱼抗氧化肽和肌肽对蛋白质-还原糖糖基化终产物AGEs 的抑制率均具有时间和剂量依赖性，且均呈正相关。
图3 甲鱼抗氧化肽和肌肽对AGEs 生成的抑制率
Fig.3 Turtle antioxidative peptides and carnosine inhibit the production of AGEs
注： 不同大写字母代表相同质量浓度甲鱼抗氧化肽处理糖基化反应体系不同时间对AGEs 的抑制作用具有显著差异（P＜0.05），不同小写字母代表相同质量浓度肌肽处理糖基化反应体系不同时间对AGEs 的抑制作用具有显著差异（P＜0.05）。
在相同质量浓度条件下， 甲鱼抗氧化肽对AGEs 的抑制作用强于肌肽。 当温孵28 d 时，1.00 mg/mL 的甲鱼抗氧化肽， 对AGEs 的抑制率达89.35%。
2.3.3 抗氧化肽对蛋白质-还原糖体系的影响为进一步探究甲鱼抗氧化肽对AGEs 抑制的作用机理，采用红外光谱分析甲鱼抗氧化肽对蛋白质-还原糖体系的影响。
如图4 所示，535 cm-1 左右的不饱和键的震动峰发生了蓝移， 说明反应体系生成了新的不饱和键，即产生了美拉德反应初期产物——Amadori 产物。 1 000 cm-1 处的峰是由糖的O-H 和C-C 键的伸缩振动产生的[18]，随着反应时间的延长，蛋白质发生糖基化作用越发明显。 3 500～3 100 cm-1 范围的吸收峰强度的改变，是由O-H 伸缩振动和游离N-H 的伸缩振动所引起的，随着反应时间延长，峰的宽度明显增强， 可能与糖基化反应过程中席夫碱的形成有关。随着反应时间的进一步延长，峰值也有相应减弱，说明美拉德反应进入中后期。
红外光谱中酰胺Ⅰ区、 酰胺Ⅱ区和酰胺Ⅲ区可以用于分析蛋白质的特殊结构， 酰胺Ⅰ区与蛋白质的二级结构密切相关。1 650 cm-1 左右是酰胺Ⅰ区的特征吸收峰， 主要是由α-螺旋中肽链的C=O 伸缩振动所引起；1 550 cm-1 左右是酰胺Ⅱ区，1 400～1 200 cm-1 范围是酰胺Ⅲ区， 由C-N 的伸缩振动和N-H 的弯曲振动产生[14]。 图4 可以看出，随着糖基化反应时间的增强，酰胺Ⅰ区、酰胺Ⅱ区和酰胺Ⅲ区的峰有先变大再变小再变大的趋势，表明周围的基团聚合数量的改变。 蛋白质-还原糖发生美拉德反应的反应初期， 氨基与羟基发生脱水缩合、分子重排生成果糖胺，导致酰胺吸收峰增强；反应中期，糖胺烯醇化生成醛酮类物质，酰胺吸收峰值减小；反应后期，蛋白质氨基酸与羰基化合物发生脱羧、脱氨，酰胺吸收带峰值增强。
图4 空白组糖基化反应体系反应不同时间的红外光谱图
Fig.4 Infrared spectral diagram of glycosylation reaction system of blank group at different reaction times
图5 为0.50 mg/mL 肌肽处理组不同反应时间的糖基化产物红外光谱图，与空白对照组相比，相同温孵时间的肌肽处理组1 000 cm-1 处的峰有所减弱。 图6 为0.50 mg/mL 甲鱼抗氧化肽处理组不同反应时间的糖基化产物红外光谱图， 与对空白照组和肌肽组相比， 相同温孵时间的甲鱼抗氧化肽处理组1 000 cm-1 处的峰明显减弱。图6 中甲鱼抗氧化肽处理28 d 的糖基化产物红外光谱图中，红外光谱中酰胺Ⅰ区、酰胺Ⅱ区和酰胺Ⅲ区的振动产生明显降低，进一步证明，甲鱼抗氧化肽通过降低糖基化反应程度，来抑制非酶糖基化反应。
图5 反应不同时间肌肽处理组糖基化产物的红外光谱图
Fig.5 Infrared spectrum of glycosylation products in the group treated with carnosine at different reaction times
图6 反应不同时间甲鱼抗氧化肽处理组糖基化产物的红外光谱图
Fig.6 Infrared spectra of the glycosylation products in the turtle antioxidant peptide treatment group at different reaction times
3 结论
本试验研究了甲鱼抗氧化肽对蛋白质-还原糖体系NEG 和AGEs 产生的抑制作用。 研究结果表明，随着甲鱼抗氧化肽质量浓度的增加，对非酶糖基化反应各个阶段的抑制作用均呈正相关。 蛋白质-还原糖体系反应21 d 时，1.00 mg/mL 甲鱼抗氧化肽对NEG 的抑制率达68.79%。 甲鱼抗氧化肽对AGEs 的抑制作用， 与甲鱼抗氧化肽的质量浓度和体系反应时间均呈正相关。 甲鱼抗氧化肽对AGEs 的抑制作用优于阳性对照肌肽。 当甲鱼抗氧化肽质量浓度为1.00 mg/mL 时， 对AGEs的抑制率达89.35%。 红外光谱结果表明，甲鱼抗氧化肽通过降低糖基化反应程度来抑制非酶糖基化反应。 本研究为降低AGEs 的形成提供了理论依据和新思路， 研究结果为拓展甲鱼抗氧化肽在食品加工领域的新用途提供了数据支持， 为控制AGEs 产生， 提高食品的安全品质提供了科学依据。
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