我国是果蔬生产大国， 蔬菜年产量8 亿多t，果品年产量近3 亿t。 然而，由于采后流通保鲜及加工技术发展相对滞后，果蔬在运输、储藏和销售过程中未经过深加工处理， 只做简单的保鲜处理即上架销售，很容易引起表面破损汁液流出，易受到微生物的污染。研究显示，我国每年因腐败损失的果蔬数量约占总产量20%以上[1]，不仅造成严重的经济损失，还带来严重的环境污染。随着社会生活水平的提高，人们对果蔬品质更加关注，探索一种安全、快捷的杀菌方式，提供更高品质的生鲜果蔬，延长其货架期十分必要。
新鲜果蔬表面存在多种微生物，如细菌、酵母菌和霉菌， 植物表面的细菌大多为革兰氏阴性菌[2]。 假单胞菌属隶属于革兰氏阴性菌，该菌属与环境、医学、生态以及动植物等都密切相关，是自然界微生物分布广泛的细菌之一， 部分假单胞菌属于植物病原菌，侵染范围很广，可以危害多种农作物，导致果蔬腐烂[3]。研究表明[4-5]，多种食源性致病菌和腐败菌容易在食品表面和加工环境形成生物被膜。生物被膜是微生物黏附于物体表面，通过分泌多糖、蛋白质、核酸等而形成的具有三维结构的胞外聚合物， 细菌被膜菌是微生物为适应生存环境黏附并包被于自体产生的黏性聚合基质中，形成的一种与浮游细胞生长方式不同的群体[6]。假单胞菌能够在果蔬表面及其加工、 运输和储藏过程中， 通过分泌胞外复合物在其附着表面形成菌膜。 菌膜的形成能够显著增强其对外部环境应激和抑菌剂的抵抗力。
二甲基二碳酸盐 （Dimethyl dicarbonate，DMDC）常被用作果蔬饮料中的防腐剂，又名维果灵，它与微生物体内的酶系基团发生反应，通过改变酶的活性，有效抑制微生物的生长。DMDC 在我国食品饮料中规定添加的最大质量浓度为250 mg/L[7]，由于其能够快速杀灭细菌、酵母等微生物，无不良气味， 并且能在短时间内分解成二氧化碳和甲醇，因此DMDC 是一种绿色高效的抑菌剂[8]。目前DMDC 多应用在果酒饮料中，如在茶枝柑果酒发酵中添加DMDC 和巴氏杀菌均能有效杀灭污染的杂菌，提高乙醇得率和糖的有效利用率[9]。 巨峰冰葡萄酒发酵过程中，DMDC 能够有效抑制发酵过程中微生物的生长，减少还原糖、总糖的无效消耗和总酸的生成与积累， 提高葡萄酒发酵的酒精度[10]。 DMDC 杀菌效果好，安全、快速，然而目前其对果蔬腐败菌及生物被膜的清除鲜有研究报道。 本研究将比较DMDC 对食源性致腐、致病微生物的杀菌作用，重点分析DMDC 对假单胞菌的浮游菌和被膜菌的杀菌效果， 并将其应用于生菜和番茄中，评价DMDC 的杀菌效果，以期探索一种简便、快捷的清洗方式，延长蔬菜货架期。
1 材料与方法
1.1 菌种与试剂
1.1.1 菌株 荧光假单胞菌 （Pseudomonas fluorescens）PF07 和隆德假单胞菌（Pseudomonas lundensis）PL28 分别是从生鲜腐败食品中分离得到，细菌经过纯化和鉴定之后保存于本实验室，其16S rDNA 的NCBI 登录号分别为KU173832 和MK041549；单增李斯特菌ATCC19115、鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028、金黄色葡萄球菌ATCC 6538购于中国微生物菌种保存中心。
1.1.2 试剂 二甲基二碳酸盐（DMDC），SIGMA公司；胰酪大豆胨脂培养基（TSA）、胰酪大豆胨液体培养基TSB、孟加拉红（虎红）培养基，杭州微生物试剂有限公司； 假单胞菌CFC 选择性培养基，青岛海博生物技术有限公司；API ZYM 酶活性试剂条，法国生物梅里埃公司；XTT 细胞活性测定试剂盒，凯基生物。
1.2 主要仪器设备
LRH-250A 生化培养箱， 上海一恒科技有限公司；SIGMA3-30K 台式高速冷冻离心机，SIGMA公司；Infinite 200 酶标仪， 瑞士Tecan 公司；Zeiss LSM 710 共聚焦扫描显微镜， 德国蔡氏公司；CR400 色差仪，杭州柯盛行仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 菌株活化 将保存在-80 ℃冰箱的假单胞菌PF07 和PL28、 单增李斯特菌、 鼠伤寒沙门氏菌、 金黄色葡萄球菌标准菌株接种于TSB 培养基中，30 ℃过夜活化两次，备用。
1.3.2 DMDC 对5 种腐败菌和致病菌的体外杀菌效果测定 将过夜活化的单增李斯特菌、 鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、荧光假单胞菌和隆德假单胞菌震荡均匀后， 取100 μL 菌液加入PBS中，使菌体浓度达到107 CFU/mL，添加DMDC 的质量浓度为250 mg/L， 在30 ℃下分别处理0，3，5 min，取样、稀释，平板计数。 进一步向活化和稀释的荧光和隆德假单胞菌中分别添加50，100，150，200，250 mg/L DMDC，处理0，1，3 min 后，平板计数。
1.3.3 胞内酶活性测定 取5 mL 过夜培养的菌液于10 mL 离心管中，8 000 r/min 离心10 min，去上清液， 用无菌生理盐水洗涤1 次， 重悬稀释至108 CFU/mL，处理组用250 mg/L 的DMDC 处理20 min，未处理组为对照。采用API ZYM 培养条检测酶活，具体步骤参照试剂盒使用说明书。加入菌体后置于28 ℃培养箱中静置4 h 后取出， 加入表面活性剂ZYM A 和显色剂ZYM B， 观察每孔的颜色变化。
1.3.4 被膜菌的活菌计数 将过夜活化的荧光假单胞菌和隆德假单胞菌以1‰接种量分别接种于TSB 培养基中，为，放入灭菌的不锈钢片（1 cm×1 cm），在28 ℃静置培养，使菌体在不锈钢片表面形成被膜菌。 培养24 h 时间后取出不锈钢片，用无菌PBS 中冲洗3 次后除去表面浮游菌。 向含有被膜菌的不锈钢片上加入250 mg/L DMDC，处理0，5，10，15 min 后，加入无菌玻璃珠震荡，稀释，平板计数。
1.3.5 XTT 法检测被膜菌的细胞活性 将使用TSB 稀释后的过夜活化菌液（约104 CFU/mL）加入96 孔板中，每孔100 μL，在28 ℃培养24 h。 到达培养时间后，除去菌液，用无菌生理盐水轻轻洗去表面浮游菌，处理组每孔加入100 μL 质量浓度为50 mg/L 的DMDC， 分别处理5，10，15 min， 除去DMDC， 每孔加入100 μL 无菌生理盐水和50 μL配制好的XTT 检测工作液。37 ℃下培养1～4 h，用酶标仪在波长450 nm 处测每孔的OD 值。1.3.6 CLSM 显微镜观察生物被膜 将过夜活化的荧光假单胞菌和隆德假单胞菌分别接种于3 mL TSB 液体培养基中，接种量为1‰，在28 ℃培养箱中静置培养24 h。到达培养时间后，去除液体培养基， 用无菌生理盐水轻轻洗去表面液体培养基，然后用250 mg/L 的DMDC 分别处理0，5，10，15 min，除去DMDC，在平皿底部均匀滴加syto9 染料和PI 染料，室温条件下避光处理15 min，使用CLSM 观察生物被膜。
1.3.7 DMDC 对生菜和西红柿中的杀菌效果及色泽影响 取若干新鲜完好的生菜叶和小西红柿（大小均匀、质量相等）。 以灭菌水浸泡为对照组，处理组分别在含有250 mg/L DMDC 中浸泡5，10，15 min，取样，自然晾干10 min 后无菌取样25 g，拍打均质、稀释，分别用TSB、CFC 选择性培养基和孟加拉红平板培养菌落总数、 假单胞菌和霉菌酵母，置于28 ℃下培养2～5 d 计数。色差采用色差仪直接测量， 每组样品在相同处理条件下测3次。
1.3.8 数据处理 所有试验均设计3 或5 个平行试验， 采用Microsoft Excel 2010 和Origin 9.0 软件进行数据处理和作图， 并利用SPSS 19.0 软件的AVOVA 进行方差分析，P＜0.05 表示有统计学显著性差异，结果为平均值±标准差（
±s）。
2 结果与讨论
2.1 DMDC 对5 种食源性腐败菌和致病菌的杀菌效果
DMDC 对单增李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、 荧光假单胞菌和隆德假单胞菌5种菌在PBS 中的杀菌效果如图1 所示。 250 mg/L的DMDC 对5 种菌都表现出杀菌作用，不同细菌对DMDC 的敏感性具有差异性。 单增李斯特菌对DMDC 的耐受性最强， 当处理5 min 时仅减少了0.66 lg（CFU/mL），而鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌在5 min 时分别减少了2.96 lg（CFU/mL）和2.48 lg（CFU/mL），荧光假单胞菌和隆德假单胞菌对DMDC 的敏感性最高， 处理3 min 就未检测到活菌生长。在相同的处理条件下，DMDC 对假单胞菌的杀菌效果高于其它3 种细菌。相似地，刘红艳等[11]使用250 mg/L DMDC 处理葡萄醪，使总菌、霉菌、酵母、乳酸菌和大肠菌活菌数分别减少1.89，0.18，1.47，0.20，1.89 lg（CFU/mL）。 韩波[12]报道DMDC 在极低浓度下对酵母菌、霉菌和细菌具有高效广谱的杀菌效果。
图1 DMDC 对5 种食源性细菌在PBS 中的杀菌效果
Fig.1 Bactericidal effect of DMDC in PBS on five foodborne bacteria
注：不同小写字母表示处理后活菌数存在显著性差异（P＜0.05）。
2.2 DMDC 对假单胞菌的体外杀菌作用
不同质量浓度DMDC 对荧光假单胞菌和隆德假单胞菌的杀菌作用如表1 所示。 荧光假单胞菌和隆德假单胞菌在50 mg/L DMDC 作用下，细菌减少缓慢；高于100 mg/L DMDC 时，两种假单胞菌活菌数显著降低； 两种假单胞菌在200 mg/L DMDC 处理10 min 后都未检测到活菌，250 mg/L作用5 min 即可将两种菌全部杀灭。 可见， 随着DMDC 质量浓度增加，DMDC 对两种假单胞菌的杀菌能力显著增加，呈现出质量浓度依赖性。相似地，章亚东等[13]报道称，随着DMDC 在溶液中的处理浓度增加，杀菌效果显著增加，而增幅并非完全呈正比例关系。 王威利[14]采用不同浓度DMDC 处理荔枝汁，随着DMDC 浓度增加，杀菌效率显著增强。 Gouma 等[15]报道称，UV-C 处理前添加75 mg/L DMDC，短时间内即可有效杀灭大肠杆菌。
表1 不同质量浓度DMDC 对两种假单胞菌在PBS 中的杀菌作用
Table 1 Bactericidal effect of DMDC at the different mass concentration on two Pseudomonas strains in PBS
注：ND 表示未检出，同一行中的不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
菌株 质量浓度/mg·L-1 细菌数量/lg（CFU·mL-1）0 min 5 min 10 min 15 min PF07 50 6.13 ± 0.03a 5.84 ± 0.02b 5.69 ± 0.03c 5.63 ± 0.01d 100 6.12 ± 0.06a 3.40 ± 0.02b 2.63 ± 0.01c 2.14 ± 0.09d 150 6.15 ± 0.05a 2.11 ± 0. 05b 1.48 ± 0.07c 0.81 ± 0.05d 200 6.10 ± 0.10a 1.89 ± 0.05b ND ND 250 6.16 ± 0.07a ND ND ND PL28 50 6.14 ± 0.02a 5.89 ± 0.05b 5.84 ± 0.02b 5.61 ± 0.02c 100 6.10 ± 0.05a 3.23 ± 0.04b 2.11 ± 0.05c 1.87 ± 0.04d 150 6.11 ± 0.04a 1.65 ± 0.07b 0.95 ± 0.07c ND 200 6.14 ± 0.12a 1.59 ± 0.13b ND ND 250 6.13 ± 0.07a ND ND ND
2.3 DMDC 对假单胞菌胞内酶活性的影响
经DMDC 处理后，荧光假单胞菌两种胞内酶出现明显变化，其中白氨酸芳氨酶（6）失去酶活性，萘酚-AS-BI-磷酸水解酶（12）活性显著降低。相似地，隆德假单胞菌处理前、后白氨酸芳氨酶活性（6）丧失，萘酚-AS-BI-磷酸水解酶（12）活性下降。结果表明，DMDC 主要通过抑制假单胞菌两种胞内酶活性， 扰乱细胞内正常代谢， 影响细菌活性。 类似地，DMDC 处理大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、 酿酒酵母和明串珠菌后也可以看出多种酶活性发生变化，从而导致微生物的失活[12，16]。 研究表明，DMDC 能够杀灭微生物与其细胞内的酶被焦碳酸基团修饰失活有很大关系，酶蛋白内的胺基、咪唑基、 羟基等极易和焦碳酸基团发生亲核反应[17]。Davidson 等[18]通过焦碳酸基团与部分氨基酸进行反应， 证实了细胞中的关键酶蛋白（如甘油醛-3-磷酸脱氢酶、乙醇脱氢酶）的组氨酸咪唑基部位甲氧基发生羧化反应， 产生甲氧甲酰咪唑基团，酶的构象发生改变，活性消失，从而导致微生物的死亡。
图2 DMDC 对荧光假单胞菌和隆德假单胞菌胞内酶活的影响
Fig.2 Effect of DMDC on intracellular enzyme activities of P. fluorescein and P. lund
2.4 DMDC 对假单胞菌成熟生物被膜的清除作用
假单胞菌为强的被膜形成菌株，DMDC 对两种假单胞菌被膜菌的清除作用如图3 所示。 荧光和隆德假单胞菌经24 h 培养后形成生物被膜，其活菌数分别为7.37 lg（CFU/cm2）和7.04 lg（CFU/cm2）。当250 mg/L DMDC 处理5 min 时，荧光和隆德假单胞菌被膜菌分别减少3.23 lg（CFU/cm2）和2.64 lg（CFU/cm2），而10 min 后两种被膜菌分别继续减少1.04 lg（CFU/cm2）和0.99 lg（CFU/cm2），处理至15 min 两种被膜菌减少缓慢（图3a）。 进一步采用XTT 法分析250 mg/L DMDC 处理下荧光和隆德假单胞菌被膜菌细胞活力的变化（图3b）。当DMDC 处理5 min 时， 两种假单胞菌细胞活力迅速降低，OD 值分别下降了0.92 和0.55，处理10 min 后OD 值分别继续下降0.10 和0.21。 可见，DMDC 处理显著降低假单胞菌被膜菌的数量和细胞活性，然而随着DMDC 处理的时间延长，杀菌速率减慢，生物被膜活菌计数和XTT 法结果较一致。
图3 DMDC 对假单胞菌的成熟生物被膜菌体活菌数（a）和活性(b)的影响
Fig.3 Effect of DMDC on the bacterial number （a） and activity （b） in matured biofilm of Pseudomonas
吴晓晓等[19]通过XTT 法测得大蒜素的浓度与OD450nm 值呈反比， 低浓度大蒜素处理老化菌株也可以明显抑制其生物被膜的生长。 XTT 仅反应活菌的代谢，如XTT 法检测茶多酚和葡萄籽提取物能够降低铜绿假单胞菌的活力，且随着时间延长，抑制生物被膜菌的活力逐步增强[20]。 结果显示，250 mg/L DMDC 对荧光假单胞菌和隆德假单胞菌的被膜菌有较好的清除作用， 并且相对于浮游菌， 假单胞菌被膜菌对DMDC 具有较强的耐受性。 张丽蓉等[21]用含800 mg/L 的过氧乙酸消毒剂和150 mg/L 的二氧化氯消毒剂处理鲍曼不动杆菌、 金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌游离菌时发现， 形成生物被膜的细菌对消毒剂抗性都比游离菌强。
2.5 DMDC 对假单胞菌成熟被膜结构的影响
D MDC 处理后， 两种假单胞菌生物被膜的结构明显破坏，处理5 min 后被膜中的活细菌明显降低，死细胞增加， 被膜厚度分别降低到40 μm 和30 μm。 当样品处理10 min 时生物被膜厚度降低到16 μm，而处理15 min 后样品中存在大量死菌，被膜厚度显著降低。 可见，随着DMDC 处理时间的延长，两种假单胞菌生物被膜结构被破坏，被膜厚
采用CLSM 观察两种假单胞菌在DMDC 处理前、后的生物被膜三维结构的变化，如图4 和图5所示。 荧光假单胞菌和隆德假单胞菌经24 h 培养后形成致密的生物被膜， 在三维和二维结构中布满强烈的绿色荧光信号，两种细菌菌体分布密集，被膜厚度分别为80 μm 和75 μm。 经250 mg/L度降低，表现良好地清除效果。Liu 等[22]通过CLSM也观察到磺化壳聚糖和壳聚糖盐酸盐对铜绿假单胞菌的生物被膜有明显的抑制作用， 且呈现浓度依赖性。
图4 CLSM 观察DMDC（250 mg/L）处理对荧光假单胞菌和隆德假单胞菌生物被膜结构的影响
Fig.4 Effect of DMDC （250 mg/L） on the biofilm structures of P. fluorescens and P. lund observed by CLSM
注：左图为三维结构图，右图为二维结构图；x 和y 代表生物被膜宽度；z 代表生物被膜厚度。
图5 DMDC（250 mg/L）处理对两种假单胞菌生物被膜厚度的影响
Fig.5 Effects of DMDC （250 mg/L） treatment on biofilm thickness of the two Pseudomonas
2.6 DMDC 对两种生鲜蔬菜品质的影响
鲜切果蔬表面微生物多为腐败菌， 如欧文氏菌、假单胞菌属于优势菌群。当果蔬表面微环境改变时，还会导致梭状芽孢杆菌、李斯特菌、耶尔森氏菌等致病菌的加速生长，并产生毒素，危及人们的身体健康甚至生命[23]。 DMDC 对西红柿和生菜两种蔬菜表面杀菌效果如表2 所示，DMDC 对两种蔬菜表面的菌落总数、假单胞菌数、霉菌酵母总数表现相似的杀菌作用， 随质量浓度的增加杀菌效果增强。 在250 mg/L DMDC 处理15 min 时，西红柿菌落总数降低2.6 lg（CFU/g），假单胞菌降低1.98 lg（CFU/g）；生菜表面的菌落总数和假单胞菌总数分别降低2.59 lg（CFU/g）和1.73 lg（CFU/g）。相对于细菌，DMDC 对蔬菜中真菌的杀菌效果显著，经150 mg/L DMDC 处理5 min 后西红柿和生菜中均未检测出霉菌和酵母。另外，在相同质量浓度的处理条件下，生菜的杀菌速率低于西红柿，可能是西红柿表面较光滑，更容易杀灭细菌。陈梦曦等[24]通过臭氧消毒柜对不同载体表面的消毒效果， 也发现消毒柜对光滑硬质表面的细菌更容易杀灭。 Chen 等[25]也报道DMDC 对大白菜不同组织的灭菌效果有差异，DMDC 处理白菜茎和叶时菌落总数分别降低4.49 lg（CFU/g）和4.45 lg（CFU/g），而在处理花和花蕾时，菌落总数仅降低2.74 lg（CFU/g）。 研究还发现， 果蔬表面的假单胞菌对DMDC 比体外PBS 中的假单胞菌具有更强耐受性， 在250 mg/L DMDC 处理15 min 后两种蔬菜表面仍能检测少量的假单胞菌， 可能是果蔬表面的细菌多为被膜菌有关。 Marlies 等[26]和Tamara等[27]报道细菌主要以生物膜的形式在非生物接触面生长，其比浮游细胞或菌落更具抵抗力。
表2 不同质量浓度DMDC 处理对西红柿和生菜中微生物总数的影响
Table 2 Effects of DMDC at different mass concentrations on total number of microorganisms in tomato and lettuce
注：ND 表示未检测出，同一列中的不同字母表示与对照组相比差异显著（P＜0.05）。
质量浓度/mg·L-1 时间/min 西红柿/lg（CFU·g-1） 生菜/lg（CFU·g-1）菌落总数 假单胞菌 霉菌酵母 菌落总数 假单胞菌 霉菌酵母对照 0 5.87±0.05a 4.84±0.07a 4.47±0.01 6.27±0.07a 4.81±0.06a 4.04 ± 0.06 150 5 4.68±0.01b 3.99±0.12b ND 5.93±0.03b 4.77±0.06a ND 10 4.18±0.05c 3.67±0.04c ND 5.86±0.12b 4.26±0.10b ND 15 4.13±0.07c 3.35±0.07c ND 5.40±0.07c 3.90±0.04c ND 200 5 4.46±0.02b 3.65±0.09b ND 4.90±0.06b 4.13±0.07b ND 10 4.17±0.05c 3.35±0.10c ND 4.88±0.08b 3.73±0.05c ND 15 4.03±0.09d 3.01±0.15d ND 4.31±0.08c 3.46±0.10d ND 250 5 3.85±0.02b 3.09±0.07b ND 4.22±0.20b 3.69±0.12b ND 10 3.38±0.03c 2.90±0.08c ND 3.93±0.04c 3.25±0.03c ND 15 3.27±0.10d 2.86±0.05d ND 3.68±0.06d 3.08±0.05d ND
DMDC 对西红柿和生菜色泽的影响如图6 所示。 西红柿和生菜在15 min 内样品色泽无显著性变化，ΔE 值在15 min 内均无显著性差异，表明经DMDC 短时间处理，对蔬菜的色泽无显著性影响。DMDC 有效地抑制菜心中微生物的生长繁殖，延缓鲜切菜心的衰老和腐败变质， 保持了鲜切菜心的外观品质[28]。
图6 DMDC（250 mg/L）对西红柿和生菜色泽的影响
Fig.6 Effects of DMDC （250 mg/L） on color of tomato and lettuce
3 结论
DMDC 是一种绿色高效的果汁饮料防腐剂。研究发现，DMDC 对生鲜食品中的优势腐败菌荧光假单胞菌和隆德假单胞菌具有良好的杀菌作用，其显著降低胞内的白氨酸芳胺酶和萘酚-ASBI-磷酸水解酶的活性，有效地杀灭两种假单胞菌的浮游菌， 杀菌效果呈现质量浓度和时间的依赖性。 并且高质量浓度的DMDC 还能够显著清除两种假单胞菌的被膜菌，降低细胞活性、增加死细胞数量，破坏被膜结构。DMDC 处理在不影响蔬菜色泽条件下，能有效的降低菌落总数、假单胞菌数，杀灭霉菌酵母。 DMDC 有望成为一种新型的果蔬清洗剂， 降低果蔬表面的初始菌落和腐败假单胞菌，提高生鲜蔬菜的品质。
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