鱿鱼是我国十分重要的海洋经济产物， 具有繁殖周期短、繁殖量大等特性，其营养丰富，口感鲜美，深受广大消费者喜爱。鱿鱼捕捞后立即在船上快速冻结， 进入市场流通时一般以冷藏或冰温储藏方式进行保鲜。然而，鱿鱼类水产品蛋白质含量丰富， 传统的低温贮藏方式不利于鱿鱼的运输或储藏， 其肌肉组织在嗜冷微生物的作用下很容易发生腐败变质。涂膜保鲜法具有防止水分损失，阻止氧气进入，抑制微生物生长等优点[1-2]，是一种可有效延长水产品货架期的方法， 已成为目前水产品贮藏保鲜的研究热点。
蛋白涂膜可有效保持水产品储藏过程中的新鲜度。樊世芳等[3]制备的鱼鳞蛋白肽涂膜剂对鲫鱼冷藏过程中挥发性盐基氮（TVB-N）的产生有一定的抑制作用，能延长鱼片的保质期。 徐萌[4]制备的鮰鱼皮明胶-壳聚糖可食膜有效抑制梭子蟹TVBN 的产生和微生物的生长，保持其感官品质。徐永霞等[5]分析发现丁香酚-明胶复配涂膜能有效抑制草鱼片冷藏过程中细菌的生长繁殖、TVB-N 的产生，延缓质构特性及感官品质的下降，其货架期比对照组延长4～8 d。
胶原蛋白具有可降解、易成膜等特点，被广泛应用于可食性包装领域。 鱼鳔、鱼鳞、鱼骨等水产品加工副产物是胶原蛋白的良好来源。研究发现，自组装是天然胶原蛋白的重要分子行为特征，胶原分子单体通过大量非共价键弱相互作用力的协同效应进行有序排列， 形成具有交错条纹结构的胶原纤维和高度有序的网状结构[6]，提高了其热稳定性、生物可降解性和力学性能等特性[7]。目前，自组装已成为深入开发胶原蛋白资源的重要技术手段。 目前有关草鱼鱼鳔胶原蛋白自组装行为及其复合涂膜对水产品保鲜品质的影响未见研究报道。
本研究以草鱼鱼鳔为原料， 提取草鱼鱼鳔胶原蛋白后进行体外自组装反应， 通过与壳聚糖等具有抑菌、成膜性好的生物涂膜材料复合，制备自组装胶原蛋白复合膜， 分析该复合膜对鱿鱼冷藏过程中品质的影响， 评价自组装胶原蛋白在水产品涂膜保鲜领域的应用价值。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
草鱼鱼鳔购于德胜菜市场。 秘鲁鱿鱼（Dosidicus gigas）由宁波飞润有限公司提供。
氢氧化钠、盐酸、乙酸、甲醇、正丁醇、氯化钠，国药集团化学试剂有限公司；考马斯亮蓝G-250、胃蛋白酶、壳聚糖、甘油，生工生物工程（上海）股份有限公司。
1.2 仪器与设备
SYKAM433D 氨基酸自动分析仪，德国卡姆公司；UV759 型紫外分光光度仪，上海奥谱勒仪器有限公司；Nicolet 6700 傅里叶红外光谱分析仪，美国Thermo 公司；K9840 自动凯氏定氮仪， 济南海能仪器股份有限公司；YXQ-LS-SⅡ立式压力蒸汽灭菌锅、SW-CT-4D 洁净工作台，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；DHP-9162 型电热恒温培养箱，上海恒科学仪器有限公司；CR21GⅡ高速离心机，日本Hitachi 公司。
1.3 试验方法
1.3.1 草鱼鳔胶原蛋白提取 将草鱼鱼鳔清洗后切成小块，用0.1 mol/L NaOH 去除杂蛋白，料液比1∶10，冷水洗至中性。用体积分数10%正丁醇脱脂，冷水冲洗。 加入质量分数0.1% 3 000 U/mg 胃蛋白酶，在0.5 mol/L 乙酸中酶解48 h。用2.0 mol/L NaCl 盐析2 h，0.5 mol/L 乙酸复溶沉淀， 用10 ku 透析袋透析，冻干后备用。
1.3.2 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） 采 用SDS-PAGE垂直电泳，在7.5%分离胶和4%浓缩胶组成的凝胶上进行分离测定。 加样量为10 μL，起始电压为80 V，进入分离胶后电压调至120 V。 经0.1%考马斯亮蓝R-250-甲醇水染色2 h， 乙酸-甲醇水脱色液脱色后拍照记录。
1.3.3 胶原蛋白紫外吸收特性 取10 mg 胶原蛋白冻干品溶于10 mL 0.5 mol/L 乙酸溶液，另取0.5 mol/L 乙酸溶液做空白对照，蒸馏水做参比，于紫外光谱区全波长扫描。
1.3.4 胶原蛋白氨基酸组成的测定 取胶原蛋白样品（10～20 mg）置于6 mol/L 盐酸溶液中，于110℃真空条件下酸水解24 h， 然后采用氨基酸分析仪测定水解液中氨基酸组成。
1.3.5 胶原蛋白傅里叶红外吸收特性 取微量胶原蛋白冻干品，经溴化钾压片，全反射光谱测定法（ATR）进行测定。光谱测定范围为4 000～400 cm-1，仪器分辨率为0.5 cm-1，扫描次数为64 次。
1.3.6 胶原蛋白自组装 配制4.0 mg/mL 胶原蛋白醋酸溶液，在40 ℃、pH 7.0 下，加入100 mmol/mL 氯化钠溶液，进行草鱼鱼鳔胶原蛋白自组装反应， 采用分光光度计实时监测胶原蛋白自组装体系在波长313 nm 处的吸光度值。
1.3.7 复合涂膜液制备 配制质量分数4%的自组装胶原蛋白溶液，50 ℃水浴溶解30 min， 添加1.0%壳聚糖、0.5%甘油，混合后搅拌20 min，于60℃下交联30 min，冷却至室温，真空脱气5 min，在室温下自然晾干后揭膜，得到所述可食性涂膜。参照顾赛麒等[8]的方法测定涂膜的机械性能及水蒸气透过率。
1.3.8 鱿鱼品质分析 将鱿鱼低温解冻后， 置于涂膜液中浸泡5 min，取出后低温晾干，置于4 ℃冰箱中冷藏。 间隔2 d 取样， 测定鱿鱼的菌落总数、挥发性盐基氮（TVB-N）、K 值和三甲胺含量。其中细菌菌落总数参照GB 4789.2-2016《食品微生物学检验 菌落总数测定》；TVB-N 值的测定参照GB 5009.228-2016《食品中挥发性盐基氮的测定》；K 值参照SC/T 3048-2014 《鱼类鲜度指标K值的测定》； 三甲胺含量测定参照GB 5009.179-2016《食品安全国家标准 食品中三甲胺的测定》。
1.3.9 数据统计分析 运用SPSS 21.0 软件和Origin 8.5 软件进行数据分析。 测定结果以均值±标准差（n ≥3）表示，采用最小显著差异法（LSD）进行显著性差异分析，显著性水平为5%。
2 结果与分析
2.1 草鱼鱼鳔胶原蛋白基本特性
2.1.1 草鱼鱼鳔胶原蛋白SDS-PAGE 电泳图谱采用SDS-PAGE 凝胶电泳对草鱼鱼鳔胶原蛋白进行分析，其结果如图1 所示。SDS-PAGE 凝胶电泳图显示草鱼鱼鳔胶原蛋白由α 链、β 链以及少量的γ 链组成， 且两种胶原蛋白至少含有两种不同的α 链（α1 和α2），其中α1 链的浓度高于α2 链，这些图谱特征说明草鱼鱼鳔胶原蛋白属于I 型胶原蛋白。 这与Wu 等[9]的研究结果一致。
图1 草鱼鱼鳔胶原蛋白SDS-PAGE 电泳图谱
Fig.1 SDS-PAGE of collagen from grass carp swim bladder
注：条带M 为标准蛋白；1 为草鱼鱼鳔胶原蛋白。
2.1.2 草鱼鱼鳔胶原蛋白氨基酸组成 草鱼鱼鳔胶原蛋白的氨基酸组成如表1 所示。 甘氨酸是草鱼鱼鳔胶原蛋白中含量最多的氨基酸，脯氨酸、谷氨酸、丙氨酸含量也相对较高，酪氨酸、组氨酸等芳香族氨基酸相对含量较低， 符合胶原蛋白的氨基酸组成特点[10]。 脯氨酸和赖氨酸的羟基化程度与胶原蛋白的三螺旋结构相关， 羟基化程度越高则三螺旋结构越复杂[11]。
表1 草鱼鱼鳔胶原蛋白氨基酸组成
Table 1 Amino acids composition of collagen from grass carp swim bladder
氨基酸 残基/1 000 残基天冬氨酸（ASP） 82.77苏氨酸（THR） 40.19丝氨酸（SER） 42.58谷氨酸（GLU） 122.16脯氨酸（PRO） 130.01甘氨酸（GLY） 185.23丙氨酸（ALA） 111.24胱氨酸（CYS） 0.00缬氨酸（VAL） 25.02蛋氨酸（MET） 16.37异亮氨酸（ILE） 19.43亮氨酸（LEU） 35.66酪氨酸（TYR） 6.12苯丙氨酸（PHE） 26.08组氨酸（HIS） 20.23赖氨酸（LYS） 46.31精氨酸（ARG） 90.62羟脯氨酸（HYP） 88.50亚氨基酸（PRO+HYP） 218.51总计 1 000
2.1.3 草鱼鱼鳔胶原蛋白紫外吸收特性 草鱼鱼鳔胶原蛋白紫外扫描光谱如图2 所示。 结果显示鱼鳔胶原蛋白特征吸收波长位于236 nm 处，这与I 型胶原蛋白的普遍吸收特性相符合[12]。
图2 草鱼鱼鳔胶原蛋白紫外吸收特性
Fig.2 UV spectra of collagen from grass carp swim bladder
2.1.4 草鱼鱼鳔胶原蛋白红外光谱吸收特性 通过红外光谱分析可以确定胶原蛋白的二级结构[13]。草鱼鱼鳔胶原蛋白的傅里叶红外光谱吸收特性如图3 所示。 由图可知，胶原蛋白酰胺A 出现于3 286.36 cm-1 处， 是N-H 伸缩振动的吸收峰，表明了氢键的存在。 酰胺B 出现于3 074.21 cm-1处，表示CH2 的不对称伸缩振动，出现在2 956.56 cm-1 附近的吸收峰表示CH2 的对称伸缩振动[12]。胶原蛋白的酰胺I 出现在1 633.54 cm-1 处， 与多肽主链上的C=O 伸缩振动相关，是肽二级结构的特征标记；酰胺II 和酰胺III 分别出现在1 546.75 cm-1 处和1 452.25 cm-1 处， 确定了胶原蛋白三螺旋结构的存在。
图3 鱼鳔胶原蛋白的傅里叶红外光谱
Fig.3 Fourier transform infrared spectrum of collagen from grass carp swim bladder
2.2 草鱼鱼鳔胶原蛋白的自组装
I 型胶原蛋白分子在中性溶液中和室温下可以在体外自发聚集成原纤维，即发生自组装反应。通过自组装，胶原基材料比表面积增加，其热稳定性、 耐酶降解性和生物力学性能等方面均显著提高。 利用分光光度计实时监测草鱼鱼鳔胶原蛋白自组装体系在波长313 nm 处的吸光度值，绘制自组装曲线，见图4。 胶原蛋白自组装过程中存在3个阶段：延滞期、快速上升期和平衡期[14]。 延滞期为胶原蛋白分子的成核阶段， 快速上升期为胶原蛋白自聚集形成纤维状结构阶段， 平衡期为胶原纤维的三维网状结构形成阶段[15]。 由图4 所示，草鱼鱼鳔胶原蛋白分子大约在60 min 处进入平衡期，其吸光度达到最大值且保持恒定，揭示胶原纤维的三维网状形成。 研究表明，NaCl 浓度、pH 值和胶原蛋白浓度对胶原蛋白分子的自组装行为有显著影响[16]，且胶原蛋白分子中的端肽在能促进其自组装进程[17]。
图4 草鱼鱼鳔胶原蛋白的自组装反应
Fig.4 Self-assembly reaction of collagen from grass carp swim bladder
2.3 自组装胶原蛋白复合膜性能
研究发现， 以胶原蛋白和壳聚糖为原料制备的复合膜具有较好的机械性能和保鲜效果[18-19]。不同胶原蛋白分子结构和肽的组成不同， 其形成胶原纤维的速度和成膜性能也不同[20-21]。将自组装的草鱼鱼鳔胶原蛋白分子溶液与壳聚糖、甘油复配，制备胶原蛋白复合膜， 分析自组装对其机械性能和阻水性能的影响，结果见表2。 由表可知，胶原蛋白自组装后制备的复合膜的拉伸强度由1.78 MPa 增加至2.69 MPa，断裂伸长率由40.12%降低至33.15%， 水蒸气透过率由1.53 g·mm/（kPa·h·m2）降低至1.08 g·mm/（kPa·h·m2），说明胶原蛋白自组装后制备的复合涂膜具有更强的机械性能和阻水性，促进胶原蛋白自组装可提高其成膜性能。
表2 胶原蛋白自组装后复合膜的机械性能和阻水性能变化
Table 2 Changes in mechanical proerties and waterblocking performance of the composite film made from self-assembled collagen
抗拉强度/MPa 断裂伸长率/% 水蒸气透过率/g·mm·kPa-1·h-1·m-2未组装胶原蛋白复合膜 1.78±0.05 40.12±1.25 1.53±0.19自组装胶原蛋白复合膜 2.69±0.04 33.15±1.07 1.08±0.14
2.4 自组装胶原蛋白复合膜处理对鱿鱼保鲜品质的影响
2.4.1 自组装胶原蛋白复合膜对鱿鱼产TVB-N值的影响 该试验分析了自组装胶原蛋白复合涂膜处理对鱿鱼在4 ℃贮藏过程中TVB-N 值变化的影响。 水产品在储藏过程中在微生物酶或内源酶的作用下， 因蛋白质降解产生一系列碱性挥发性含氮物质，统称TVB-N。 不同涂膜处理的鱿鱼胴体在4 ℃储藏条件下TVB-N 值的变化见图5。由图可知，处理前鱿鱼TVB-N 值为12.55 mg/100 g，未经处理的鱿鱼在4 ℃储藏6 d 时TVB-N 值达28.02 mg/100 g，已处于新鲜临界值。新鲜海水产品的TVB-N 值一般≤30 mg/100 g。 经胶原蛋白复合膜处理后鱿鱼的TVB-N 值增加幅度减缓，其中未组装胶原蛋白复合膜处理的鱿鱼在第8 天时TVB-N 值为27.92 mg/100 g；组装胶原蛋白复合膜处理组在第12 天时TVB-N 值为29.87 mg/100 g，仍小于30 mg/100 g。由此可见，胶原蛋白自组装后制备的复合膜可有效抑制鱿鱼TVB-N 的产生，延缓腐败。
图5 鱿鱼涂膜后在4 ℃储藏过程中TVB-N 值变化
Fig.5 Changes of TVB-N value of coated squid during storage at 4 ℃
2.4.2 自组装胶原蛋白复合膜对鱿鱼菌落总数的影响 自组装胶原蛋白复合涂膜处理对鱿鱼在4℃贮藏过程中菌落总数变化的影响见图6。由图可知， 不同条件处理下鱿鱼在4 ℃条件下的细菌菌落总数随储藏时间延长而不断增加， 而胶原蛋白复合膜处理能延缓鱿鱼肌肉组织中的细菌生长。未经涂膜处理的鱿鱼初始菌落总数为2.45 lg（CFU/g）， 在第6 天临近腐败时达7.11 lg（CFU/g）。 经过组装或未组装胶原蛋白复合膜处理的鱿鱼在第6 天时仅为4～6 lg（CFU/g），显著低于未经涂膜处理组的菌落总数，胶原蛋白-壳聚糖复合涂膜具有良好的抗菌性，这与Emna 等[22]的研究结果一致。此外，胶原蛋白经过自组装后制备的复合涂膜能更有效抑制鱿鱼细菌总数增加，第12 天时该处理条件下鱿鱼细菌菌落总数为7.54 lg（CFU/g）。
图6 鱿鱼涂膜后在4 ℃储藏过程中细菌菌落总数变化
Fig.6 Changes of bacterial colonies of coated squid during storage at 4 ℃
2.4.3 自组装胶原蛋白复合膜对鱿鱼K 值的影响自组装胶原蛋白复合涂膜处理对鱿鱼在4 ℃贮藏过程中K 值变化的影响见图7。 K 值是ATP 分解产物次黄嘌呤核苷（HxR）和次黄嘌呤（Hx）总量与ATP 所有关联均总量的比值，是代表水产品新鲜度的重要指标之一[23]。 随着贮存时间延长，水产品肌肉组织中的ATP 快速分解，HxR 和Hx 含量逐渐增多，K 值增加， 水产品新鲜度下降， 当K值≤20%时新鲜度较高。 如图所示，鱿鱼在储藏期初始值为8.4%。 随着冷藏时间延长，未涂膜处理组、 未组装胶原蛋白复合膜处理组和组装胶原蛋白复合膜处理组的K 值分别在第8 天、 第10 天、第14 天时大于20%， 说明此时的鱿鱼开始腐败。由此可见， 自组装胶原蛋白复合膜处理能有效延缓鱿鱼冷藏过程中ATP 分解。
图7 鱿鱼涂膜后在4 ℃储藏过程中K 值变化
Fig.7 Changes of K value of coated squid during storage at 4 ℃
2.4.4 自组装胶原蛋白复合膜对鱿鱼产三甲胺的影响 三甲胺是由氧化三甲胺经兼性厌氧酶还原产生的挥发性含氮物质， 随着水产品鲜度下降升高。鱿鱼在4 ℃下三甲胺的变化见图8。如图所示，鱿鱼在储藏期初始值为12.54 μg/g，随着储藏时间的延长， 鱿鱼中三甲胺含量不断增加。 在第6 天时， 未处理的鱿鱼中三甲胺增加至32.24 μg/g，未组装胶原蛋白复合膜处理组鱿鱼三甲胺为19.45 μg/g， 组装胶原蛋白复合膜处理组为21.11 μg/g。新鲜海产品三甲胺＜30～40 μg/g， 由此可知未涂膜处理的鱿鱼在第6 天时三甲胺含量已达到临界值， 而组装胶原蛋白复合膜处理可有效延缓鱿鱼中三甲胺含量的增加， 将鱿鱼货架期延长至12 d，此时鱿鱼三甲胺含量为40.31 μg/g。
图8 鱿鱼涂膜后在4 ℃储藏过程中三甲胺含量的变化
Fig.8 Changes of trimethylamine content of coated squid during storage at 4 ℃
3 结论
利用酶法从草鱼鱼鳔中提取的胶原蛋白具有稳定的三螺旋结构， 经过自组装后形成的网状结构更为致密，与壳聚糖、甘油等涂膜材料制备的复合涂膜机械性能更强。 将经过自组装的草鱼鱼鳔胶原蛋白制备复合涂膜液，对鱿鱼进行涂膜处理，并在4 ℃下进行贮藏分析其新鲜度指标变化，发现与未涂膜处理组、 未自组装的胶原蛋白复合膜处理组相比， 自组装胶原蛋白复合膜能有效延缓鱿鱼腐败，延长其货架期。
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