新生儿（neonate，newborn）是指从出生断脐到生后28 d 内的婴儿，是胎儿出生后生理功能调节并适应宫外环境的一个特殊阶段，具有生长发育速度快，消化能力弱，免疫力低的特点[1-4]。世界卫生组织（Word Health Organization，WHO）报道母乳喂养是新生儿最理想的喂养方式。而当母乳不足或无法进行母乳喂养时，配方食品显得至关重要。
配方液态乳是一种无需冲调、健康卫生、可直接食用的新型配方食品，是新生儿的最佳选择[5]。目前，我国配方液态乳处于起步阶段，主要是超高温灭菌（Ultra-high temperature，UHT） 的12～24个月龄的婴儿配方乳[6]。新生儿免疫力较低，对配方食品的安全性要求高，UHT 之后仍有一些热稳定性细菌和酶存活，容易导致配方乳品质劣变，影响新生儿的生长发育[7]。瓶内灭菌（Retort），工艺条件一般为118～122 ℃、15～20 min[8]，是一种医院用于早产儿配方乳灭菌的方式，在日本已广泛用于生活无法自理的老年人肠内配方液态乳的灭菌。Retort 是一个比UHT 更安全的杀菌过程，然而Retort 较高的温度和较长的时间会导致较多营养物质的损失[9-10]。近年来，Hope 等[11]用121 ℃、5 min 的Retort 对捐赠母乳灭菌，与保持巴氏灭菌（holder pasteurization）相比，其宏量营养素的损失小，然而赖氨酸和维生素B1 的含量有所减少。Yasuhiro 等[12]将121 ℃、10 min 的Retort 肠内配方液态乳与UHT 肠内配方液态乳进行对比，两种肠内配方液态乳对小鼠增重效果相同，说明Retort工艺营养物质损失较小。上述两个文献的Retort的灭菌时间虽然都低于通常的时间范围，但是均达到货架期内稳定的效果。适当降低Retort 的灭菌温度，既可减少营养物质损失，又可满足微生物安全的要求，具有实用价值。
本研究在低于一般的Retort 工艺参数条件下，通过单因素实验和正交试验优化Retort 工艺，使产品体系更加稳定，在确保新生儿配方液态乳安全性的同时，最大程度地降低营养物质损失。通过体系的优化确定最优的Retort 工艺，以提升产品稳定性，使其微生物安全性更高，体系微观结构更好。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
生牛乳，购自东北农业大学附近超市；脱脂乳，使用脱脂机制备；乳清蛋白粉，恒天然商贸（上海）有限公司；乳糖，山东萍聚科技有限公司；脱盐乳清粉，法国EUROSERUM 公司；低聚果糖，阳湖生物技术有限公司；低聚半乳糖，量子高科集团有限公司；复配植物油，秦皇岛金海特种食用油工业有限公司；DHA 和ARA，湖北福星生物科技有限公司；复配维生素和复配矿物质，北京金康普食品科技有限公司；尼罗红，上海源叶生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
容量250 mL 玻璃瓶，徐州宏华玻璃科技有限公司；菌落总数测试片，广东达元绿洲食品安全科技股份有限公司；Mastersizer 2000 激光粒度仪，英国马尔文仪器有限公司；RST-CC 流变仪，美国博勒飞公司；PRODUCT-YS3010 色差仪，深圳三恩时科技有限公司；激光扫描共聚焦显微镜，德国Leica 公司；EVO MA 25/LS 25 扫描电子显微镜，德国卡尔蔡司公司；Scientz-150 高压均质机，宁波新芝生物科技股份有限公司；GF54DA 高压灭菌器，致微（厦门）仪器有限公司；超高温灭菌设备，上海沃迪科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 Retort 工艺流程 工艺流程为：生牛乳→过滤净化→与粉状原料（乳糖、浓缩乳清蛋白WPC 80 粉）和水溶性配料（食品添加剂）混合→预热溶解（至80～85 ℃）→加入脂溶性配料（需要先将脂溶性维生素、油和长链多不饱和脂肪酸溶于乳化剂）→充分混合定容→均质 （10～50 MPa）→包装（每个玻璃瓶装200 mL 配方液态乳）→瓶内灭菌（105～125 ℃，6～14 min）→冷却→检验→成品。
1.3.2 单因素实验 Chiewchan 等[13]研究了均质压力和灭菌条件对高脂椰子奶稳定性的影响，并用黏度来表征高脂椰子奶的稳定性，结果表明高脂椰子奶的黏度越大稳定性越好。因此，本研究以黏度作为Retort 液态乳稳定性的指标。
1.3.2.1 均质压力的选取 均质压力选取10，20，30，40，50 MPa，灭菌温度110 ℃，灭菌时间10 min，测定新生儿配方液态乳的黏度，选取单因素最优均质压力。
1.3.2.2 灭菌温度的选取 灭菌温度选取105，110，115，120，125 ℃，均质压力30 MPa，灭菌时间10 min，测定新生儿配方液态乳的黏度，选取单因素最优灭菌温度。
1.3.2.3 灭菌时间的选取 灭菌时间选取6，8，10，12，14 min，均质压力30 MPa，灭菌温度110℃，测定新生儿配方液态乳的黏度，选取单因素最优灭菌时间。
1.3.3 正交试验 以均质压力、灭菌温度和灭菌时间为正交试验因素，根据单因素实验，确定因素水平的取值范围。采用三因素三水平正交试验优化Retort 工艺。正交试验因素水平见表1。
表1 正交试验因素水平表
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment
编码因素A（均质压力/MPa）C（灭菌时间/min）-1 20 110 8 0 30 115 10 1 40 120 12 B（灭菌温度/℃）
1.3.4 单因素与正交优化工艺生产的配方液态乳稳定性的比较
1.3.4.1 黏度 黏度是牛乳流变特性中最具代表
性的指标，与产品稳定性有关，可用来评价产品的品质，黏度越大体系越稳定，黏度越小体系越不稳定。采用RST-CC 流变仪，恒温25 ℃，剪切速率从0/s 上升到2 000/s，然后从2 000/s 下降到0/s，剪切速率上升和下降所需时间都是3 min（总时间为6 min）。ηa=τ/γ=kγn-1 其中ηa 是表观黏度（Pa·s），τ 是剪切应力（Pa），γ 是剪切速率（s-1），k 是稠度系数（Pa·sn），n 是流变指数[14]。
1.3.4.2 粒径 粒径是评价乳状液最重要的指标之一，产品的稳定性与粒径大小成反比，粒径越小体系越稳定，反之，粒径越大产品稳定性越差。使用Mastersizer 2000 激光粒度仪进行样品颗粒的平均粒径测定，参照Nobuhara 等[15]的方法进行调整，取175 μL 的样品用蒸馏水稀释200 倍进行测量，所有测量均在25 °C 下进行3 次。样品使用1.450 的折射率，蒸馏水使用1.331 的折射率。
1.3.4.3 ΔE 美拉德反应是热处理过程中最常见的化学反应，影响产品的感官品质与安全性，ΔE是美拉德反应的重要衡量指标，ΔE 越大，美拉德反应越强烈，ΔE 越小，美拉德反应越不剧烈。参照宋铮等[16]的方法进行ΔE 测定，使用色差计在室温下进行ΔE 测量，首先将色差计预热30 min，打开颜色管理软件，采用CIELAB 系统进行颜色校准，先进行黑板校准，再进行白板校准。将样品倒入玻璃比色杯中，把玻璃比色杯插入黑室中并连接至色差计，确定样品ΔE 的变化。L*值是亮度的度量，范围从黑度（0）到白度（100）；a*值的范围从绿色（-60）到红色（+60），b*值的范围从蓝色（-60）到黄色（+60）[17]。对每个样品一式3 份进行ΔE 测量，并使用平均值。
1.3.5 生牛乳、UHT 纯牛乳和Retort 液态乳微生物安全性 本研究比较了生牛乳、UHT 新生儿配方液态乳和优化后的Retort 新生儿配方液态乳的菌落总数和嗜热需氧芽孢数，以对比优化后的瓶内灭菌工艺与UHT 工艺的微生物安全性。
1.3.5.1 菌落总数
1）样品处理 取25 mL 的样品放入225 mL的灭菌磷酸缓冲稀释液中，制成1∶10 的样品稀释液。用无菌吸管吸取1 mL 的1∶10 样品稀释液，加入9 mL 的灭菌磷酸缓冲稀释液中，制成1∶100 的样品稀释液。再用无菌吸管吸取1 mL 的1∶100 样品稀释液，加入9 mL 的灭菌磷酸缓冲稀释液中，制成1∶1 000 的样品稀释液。注意每次稀释都需要换一只无菌吸管。
2）接种 将菌落总数测试片（BB202）置于平坦的试验台面上，揭开上层膜，用无菌吸管吸取1 mL 的样品稀释液缓慢滴加到菌落总数测试片上，然后再将上层膜缓慢盖下，静置10 s。每个稀释度接种两片菌落总数测试片，同时用磷酸缓冲液做两片空白对照。
3）培养 将菌落总数测试片堆叠在一起（堆叠片数不超过12 片）放到自封袋中并封口，将透明面朝上，水平放置在恒温培养箱中。培养温度为（36±1）℃，培养时间为15～24 h。
4）计数 若只有一个稀释度的菌落总数在适宜计数范围内，计算此稀释度的两个菌落总数测试片上菌落数的平均值，再将平均值乘以相应的稀释倍数，作为每毫升样品中菌落总数；若有两个连续稀释度的菌落总数测试片的菌落数在适宜计数范围内，按（1）计算：
式中：N——样品中菌落数；Σc——测试片上菌落总数之和；n1——第1 个适宜稀释度测试片数；n2——第2 个适宜稀释度测试片数；d——稀释因子（第一稀释度）。
1.3.5.2 嗜热需氧芽孢数 嗜热需氧芽孢数可以反映乳制品的卫生指标，大量嗜热需氧芽孢会导致乳产品变质，影响新生儿的生长发育。根据中华人民共和国农业行业标准NY/T 1331-2007《乳与乳制品中嗜冷菌、需氧芽孢及嗜热需氧芽孢数的测定》进行嗜热需氧芽孢总数测定。
1.3.6 生牛乳、Retort 液态乳和UHT 液态乳的蛋白质和脂肪微观结构 为了探究Retort 和UHT对新生儿配方液态乳蛋白质和脂肪球的影响，使用SEM 和CLSM 分别观察蛋白质的交联程度和脂肪的数量和尺寸。
1.3.6.1 蛋白质微观结构 将Retort 液态乳冷冻干燥为粉末，将冻干的乳粉末用金铂碳溅射仪喷金，使用扫描电镜观察蛋白质微观结构。调节最佳视野，分别在200 倍、800 倍、1 500 倍和3 000 倍数下进行观察[18]。
1.3.6.2 脂肪微观结构 使用激光扫描共聚焦显微镜观察液态乳的脂肪球，试验方法参考Okada等[19]的方法，取1 mL 样品加入40 μL 尼罗红染色液，混合均匀后染色30 min，取5 μL 染色的乳液样品于载玻片上，盖上盖玻片并用甘油密封，在激发光波长488 nm 处，放大倍数400 倍下进行扫描观察。
1.3.7 统计分析 每组试验重复3 次，采用SPSS对试验数据进行方差分析和显著性分析；采用Origin 软件制图。
2 结果与分析
2.1 单因素实验结果与分析
2.1.1 均质压力 如图1所示（图中同曲线上不同字母表示差异显著，下同），随着均质压力的增加，新生儿配方液态乳的黏度先增加后减小，均质压力在30 MPa 时，黏度达到最大为0.00708 Pa·s。黏度越大，说明新生儿配方液态乳的体系越稳定。因此，选取30 MPa 作为单因素最适均质压力，选取20，30，40 MPa 作为正交试验因素水平。
图1 均质压力对新生儿配方液态乳黏度的影响
Fig.1 Effect of homogeneous pressure on viscosity of liquid newborn formula
2.1.2 灭菌温度 如图2所示，随着灭菌温度的升高，新生儿配方液态乳的黏度呈先上升后下降的趋势。灭菌温度从105 ℃到115 ℃时，黏度缓慢上升，当灭菌温度在115 ℃时，黏度达到最大为0.07101 Pa·s，当灭菌温度达到120 ℃之后，黏度快速下降。这可能是由于灭菌温度过高，蛋白质变性程度增加，变性的蛋白质吸附在乳脂肪球膜表面，导致脂肪球带电量减小，黏度下降。因此，选取115 ℃作为单因素最适灭菌温度，选取110，115，120 ℃作为正交试验因素水平。
图2 灭菌温度对新生儿配方液态乳黏度的影响
Fig.2 Effect of sterilization temperature on viscosity of liquid newborn formula
2.1.3 灭菌时间 如图3所示，随着灭菌时间增加，新生儿配方液态乳的黏度呈先上升后减小的趋势。灭菌时间在6 min 到8 min 时，黏度缓慢增加，8 min 后黏度显著增加（P＜0.05），当灭菌时间在10 min 时，黏度最大为0.00702 Pa·s，灭菌时间在10 min 后，黏度下降，这可能是由于灭菌时间较长，导致变性的蛋白质吸附到脂肪球膜表面，使表面的电荷量减小，黏度降低。因此，选取10 min为单因素最适灭菌时间，选取8，10，12 min 作为正交试验因素水平。
图3 灭菌时间对新生儿配方液态乳黏度的影响
Fig.3 Effect of sterilization time on viscosity of liquid newborn formula
2.2 正交试验结果与分析
由表2可知，影响新生儿配方液态乳黏度的因素主次顺序为B＞C＞A，即灭菌温度＞灭菌时间＞均质压力。优化后的条件组合为A1B2C1，即均质压力为20 MPa，灭菌温度115 ℃，灭菌时间8 min。
表2 正交试验结果
Table 2 Orthogonal test results
试验号 均质压力/MPa 灭菌温度/℃ 灭菌时间/min 黏度/Pa·s 1-1-1-1 0.00747 2-1 0 0 0.00728 3-1 1 1 0.00698 4 0-1 0 0.00702 5 0.00720 6 0 1-1 0.00708 0 0 1
2.3 单因素与正交优化工艺生产的配方液态乳稳定性比较
（续表2）
试验号 均质压力/MPa 灭菌温度/℃ 灭菌时间/min 黏度/Pa·s 7 1-1 1 0.00708 8-1 0.00717 9 1 1 0 0.00707 1 0 k1 0.00724 0.00721 0.00724 k2 0.00712 0.00722 0.00714 k3 0.00711 0.00704 0.00709 R 0.00013 0.00018 0.0015因素主次顺序 B＞C＞A优组合 A1B2C3
表3为单因素和正交优化工艺生产的配方液态乳的粒径、ΔE 和黏度结果。单因素工艺下的配方乳粒径为0.731 μm，ΔE 为12.65，黏 度为0.00716 Pa·s。正交优化工艺条件下的配方乳粒径为0.701 μm，ΔE 为7.43，黏度为0.00972 Pa·s，正交优化完成的瓶内灭菌新生儿配方液态乳稳定性更好，故最优工艺条件为均质压力为20 MPa，灭菌温度115 ℃，灭菌时间8 min。
表3 单因素和正交优化的产品稳定性比较
Table 3 Comparison of product stability between single factor and orthogonal optimization
?
2.4 生牛乳、Retort 液态乳和UHT 液态乳的微生物安全性分析
2.4.1 菌落总数 表4为Retort 液态乳和UHT液态乳的菌落总数，由表4可知，Retort 液态乳的菌落总数为0 CFU/mL，UHT 液态乳的菌落总数为0.91 CFU/mL。我国婴幼儿配方食品的菌落总数要小于1 000 CFU/mL[20]，Retort 液态乳和UHT 液态乳的菌落总数符合此要求，并且Retort 液态乳的菌落总数显著小于UHT 液态乳（P＜0.05），这说明Retort 液态乳的微生物安全性高于UHT 液态乳。
表4 生牛乳、Retort 液态乳和UHT 液态乳的菌落总数
Table 4 Aerobic plate count in raw milk，Retort liquid formula and UHT liquid formula
?
2.4.2 嗜热需氧芽孢 表5为Retort 液态乳和UHT 液态乳的嗜热需氧芽孢数，由表5可知，Retort 液态乳的嗜热需氧芽孢数为479.33 CFU/mL，UHT 液态乳的嗜热需氧芽孢数为713.00 CFU/mL。2013年美国乳业孢子研讨会提出，UHT 全脂配方乳中嗜热需氧芽孢数要小于2 000 CFU/g[21]，本研究的Retort 液态乳和UHT 液态乳均符合此要求。Retort 液态乳的嗜热需氧芽孢显著少于UHT 液态乳（P＜0.05），这说明Retort 液态乳的微生物安全性更高。
表5 生牛乳、Retort 液态乳和UHT 液态乳的嗜热需氧芽孢数
Table 5 Thermophilic aerobic bacterial spores in raw milk，Retort liquid formula and UHT liquid formula
注：同一列数据右上标不同字母说明它们之间具有显著性差异（P<0.05）。
?
2.5 生牛乳、Retort 液态乳和UHT 液态乳的微观结构分析
2.5.1 蛋白质微观结构分析 乳蛋白的微观结构如图4所示，图a1～a4 为生牛乳的蛋白形态扫描电子显微镜结果，图a1 和a2 观察到蛋白表面没有蜂窝状的孔径，图a3 和a4 观察到生牛乳具有少量的蛋白聚集和交联。图b1～b4 为Retort 液态乳的蛋白形态扫描电子显微镜结果，图b1 观察到蛋白表面具有少量的孔径，图b2～b4 观察到蛋白质之间发生了聚集，形成了致密的网状结构。图c1～c4 为UHT 液态乳的蛋白形态扫描电子显微镜结果，图c1～c4 为UHT 新生儿配方液态乳的蛋白形态扫描电子显微镜结果，图c1 和图c2 观察蛋白质表面具有少量的蜂窝状孔径，图c3 和图c4观察到蛋白质之间交联没有形成致密的规则结构，具有大小不一的孔径。这可能是由于灭菌过程中温度上升至130 ℃时酪蛋白开始变性，变性的酪蛋白与酪蛋白以及酪蛋白与乳清蛋白之间形成聚合物，交联程度增加，孔径大小不一致[22]。根据图a2、b2 和c2 比较发现Retort 液态乳的蛋白交联结构与生牛乳更加相似。根据图b3、b4 与c3、c4比较发现Retort 液态乳的乳蛋白微观结构比UHT配方乳蛋白质微观结构更加致密，这可能是Retort灭菌温度低于UHT，这导致乳清蛋白变性较多，酪蛋白变性较少，变性的酪蛋白与乳清蛋白之间通过稳定的二硫键结合形成网状结构，酪蛋白均匀分布在该网状结构中，使形成的网状结构更致密，孔径较小，结构更稳定[23-24]。
图4 Retort 液态乳和UHT 纯牛乳的乳蛋白微观结构图
Fig.4 Microstructure of Retort liquid formula and UHT pure milk
注：a1～a4.生牛乳；b1～b4.Retort 液态乳；c1～c4.UHT 液态乳；a1～c1 放大倍数为200 倍；a2～c2 放大倍数为800 倍；a3～c3 放大倍数为1 500 倍；a4～c4 放大倍数为3 000 倍。
2.5.2 脂肪球微观结构分析 使用激光扫描共聚焦显微镜进行脂肪球的微观结构分析，从图5a 可以看出，生牛乳中脂肪小球均匀分布并且没有聚集。图5b 为Retort 液态乳脂肪球观察结果，与生牛乳相比，Retort 液态乳出现了较多尺寸较小的脂肪球，这可能是由于新生儿配方乳中添加了复配植物油使脂肪球数量增多，然后经过均质使脂肪球尺寸减小。图5c 为UHT 液态乳脂肪球观察结果，与生牛乳和Retort 液态乳相比，脂肪球数量减少，尺寸增大，这可能是由于UHT 灭菌温度较高，灭菌过程导致脂肪球聚集，从而导致脂肪球尺寸增加[25]。
图5 Retort 液态乳和UHT 纯牛乳的脂肪球激光共聚焦扫描显微镜图
Fig.5 CLSM images of fat globules Retort liquid formula and UHT pure milk
注：图像为400 倍下拍摄。
3 结论
对新生儿配方液态乳的Retort 工艺进行研究，通过单因素实验和正交试验确定最佳Retort工艺为：均质压力20 MPa，灭菌温度115 ℃，灭菌时间8 min。优化完成的Retort 新生儿配方液态乳体系更加稳定，菌落总数为0 CFU/mL，嗜热需氧芽孢数较低。与UHT 液态乳相比蛋白质变性程度较小，脂肪球数量较多，尺寸较小。优化完成的瓶内灭菌工艺更适合用于新生儿配方液态乳的灭菌，Retort 液态乳为新生儿提供了营养丰富的母乳替代品。
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