金黄色葡萄球菌是常见的食源性致病菌之一，广泛存在于自然界和食品加工环境中[1]。在适当的条件下，该菌可产生耐热性肠毒素[2-3]。人体摄入由金黄色葡萄球菌及其肠毒素污染的食品后，可引发恶心、呕吐、腹痛、虚脱、休克、体温过低等食物中毒症状[4-5]。近年来，我国由金黄色葡萄球菌引发的食物中毒报道层出不穷，其中，2017年由该菌引起的食物中毒事件占细菌性食物中毒事件的20%左右，仅次于沙门氏菌和副溶血性弧菌，且主要与肉制品等动物源食品相关[6-8]。此外，以烤鸭为代表的即食鸭肉制品是我国常见的熟肉食品之一，深受消费者青睐[9]。然而，同大部分熟肉食品一样，烤鸭制品通常在敞开或半敞开的环境中加工、贮藏或销售，极易遭受包括金黄色葡萄球菌在内的食源性致病菌的污染[10]。方太松等[11]报道，2003-2017年期间，我国熟制鸭肉制品中金黄色葡萄球菌的检出率约8.11%，置信区间2.64%～22.32%。探究包括烤鸭制品在内的熟肉食品中金黄色葡萄球菌的生长规律对促进该菌的防控、保障熟肉制品安全具有重要意义。
预测微生物学模型是描述食品中微生物生长或失活行为的有效工具，可以用于微生物定量风险评估或货架期预测[12-13]。传统的微生物预测模型构建采用“两步法”：第1 步构建初级模型，描述恒定环境因子（比如温度、pH 值、水分活度）状态下微生物数量随时间的变化，通过非线性回归获得生长速率和迟滞期等参数；第2 步构建二级模型，描述环境因子对生长速率或迟滞期的影响，通过非线性回归获得最低、最大生长温度或pH 值等参数；因其涉及两次非线性回归，故数据分析过程中累积误差相对较大[14]。为减小建模过程中的累积误差，近年来，有文献报道使用“一步法”对数据进行整体分析，即通过一次非线性回归同步构建初级模型和二级模型[15]。目前，已有关于熟肉制品中金黄色葡萄球菌生长预测模型的文献报道[16-18]，然而，其建模过程均基于传统的两步法，缺乏波动温度条件下的预测建模，无法满足实际生产加工、运输、贮藏过程中的应用需求。
本文研究烤鸭中金黄色葡萄球菌的生长特性，构建基于一步法的动态预测模型，旨在为相关产品中金黄色葡萄球菌的生长模拟与风险评估提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
烤鸭，福州山姆会员超市。
利福平（Rifampicin，Rif），北京索莱宝科技有限公司；蛋白胨粉，杭州微生物试剂有限公司；胰酪大豆胨琼脂培养基（Tryptose Soya Agar Medium，TSA）、脑-心浸出液肉汤（Brain Heart Infusion Broth，BHI），广东环凯微生物科技有限公司；Whirl-Pak-207 mL 无菌均质袋，美国Nasco公司。
1.2 设备
KB115 低温恒温箱，德国BINDER 公司；Bag Mixer-400 均质拍打器，法国Interscience 公司；SHP-250 细菌生化培养箱，上海精宏实验设备有限公司；LDZX-75KBS 立式压力蒸汽灭菌器，上海精宏实验设备有限公司；H-1850R 高速冷冻离心机，湖南相仪实验室仪器有限公司；VORTEX-5 漩涡混合器，上海习仁科学仪器有限公司；AIRTECH生物安全柜，苏州安泰空气技术有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 金黄色葡萄球菌接种菌液的制备 两株金黄色葡萄球菌（CICC10786、CICC10787）均采购于中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC），并保存于-80 ℃、含20%甘油的BHI 冻藏管中。参照Jia 等[19]的方法，利用利福平分别逐步诱导两株金黄色葡萄球菌，使其产生抗性菌株，当其对利福平的耐受质量浓度达到100 mg/L 时，划线于TSA/Rif平板，保存于8 ℃培养箱中。为保证其菌株活性，每隔7 d 转接至新制备的TSA/Rif 平板。每次试验前，从TSA/Rif 平板挑取2 株金黄色葡萄球菌的单菌落，分别接种至10 mL BHI 溶液（利福平添加质量浓度100 mg/L）中，培养18～20 h，使菌株浓度达109.0～109.5 CFU/mL，再于4 ℃条件下以5 000 r/min 离心15 min，去掉上清液，用无菌蛋白胨水（0.1 g/L）清洗菌体2 次。将2 株金黄色葡萄球菌悬浮液按1∶1 混合，经无菌蛋白胨水稀释至约104.5 CFU/mL，备用。
1.3.2 烤鸭中金黄色葡萄球菌的生长试验 烤鸭去皮去骨后抽真空包装（2 kPa），并于115 ℃杀菌20 min，以消除背景微生物的影响。冷却后于无菌环境下将鸭肉切分为若干份，每份（5±0.05）g，并装入无菌均质袋中。取上述已制备的菌悬浮液，接种0.1 mL 至每份烤鸭样品中，并轻度揉捏，使菌液与样品充分混合。经平板涂布法，测得金黄色葡萄球菌的初始接菌浓度为102.5～103.0 CFU/g。将已接种的烤鸭样品分别置于12，16，20，25，30，35 ℃培养箱，开展恒定温度条件下的生长试验，每个温度条件下的取样点独立重复两次。另外，于变温培养箱中分别设置4 组温度任意波动的程序（TP1、TP2、TP3、TP4，见图3），开展动态温度条件下的生长试验。
1.3.3 金黄色葡萄球菌计数 根据试验条件，按预设的时间间隔取出样品，向均质袋中加入20 mL 无菌蛋白胨水（0.1 g/L），置于均质拍打器中正反两面各拍打2 min，然后取1 mL 均质液添加至9 mL 无菌蛋白胨水中，再进行梯度稀释。根据试验条件预设稀释倍数，取适量稀释或非稀释菌液（0.1 mL 或1 mL）涂布于TSA/Rif[20]培养基。涂布后的平板置于37 ℃条件下培养，24～48 h 后计数，单位为Ln（CFU/g）或lg（CFU/g）。
1.4 生长模型
1.4.1 初级模型 分别选取Huang 模型[21]、Baranyi 模型[22]和Two Compartment 模型[23]作 为 初级模型，用于描述烤鸭中金黄色葡萄球菌的生长随时间的变化，3 种初级模型的微分方程表达式分别如式（1）、式（2）、式（3）所示：
式（1）中，Y、Ymax 分别是t 时刻对应的细菌生长浓度和最大生长浓度（ln （CFU/g））；μmax 为细菌最大比生长速率（h-1）；λ 是迟滞期；A 和m 为回归系数。式（2）中，Y、Ymax、μmax 与式（1）相同，参数Q是描述细菌初始生理状态的物理量，当t=0 时，有Q=Q0。式（3）中，t 时间细菌总量N（CFU/g）为休眠期的细菌数NL （CFU/g） 与分裂期的细菌数ND（CFU/g）之和；Nmax 为细菌最大生长浓度（CFU/g）；γ 是与细菌迟滞期相关的参数，决定处于休眠状态的细胞向分裂状态的转化，其值在0～1 之间。
1.4.2 二级模型 选择Huang-Square-Root（HSR）模型[19]作为二级模型，用于评价温度对烤鸭中金黄色葡萄球菌生长速率的影响，其表达式如式（4）所示：
式（4）中，T、Tmin——分别是金黄色葡萄球菌的环境温度和最低生长温度，℃；μmax——细菌最大比生长速率，h-1。
1.5 动力学参数的确定与数值分析
将各个恒定温度条件下的2 次独立重复试验数据合并，并通过一步法进行分析，求解模型参数，构建金黄色葡萄球菌的生长预测模型。本研究基于Matlab 软件 （美国Math Works 公司，版本2018）编程实现对模型参数的求解，若将待求参数记为{P}，则Huang-HSR 模型、Baranyi-HSR 模型和Two Compartment-HSR 模型的待求参数可分别由式（5）、式（6）和式（7）表示。数值分析过程中，采用四阶龙格-库塔法结合最小二乘法，全局优化金黄色葡萄球菌生长浓度预测值Y^与观测值Y 的最小残差平方和RSS（式8），其中n 为观察值的总数。
1.6 模型评价
统计量均方根误差（RMSE）（如式9） 和AIC值[25]（如式10）可用于模型评价。一般而言，RMSE越小，表明模型拟合的准确度越高；AIC 反映模型拟合数据的优良性，可用于不同模型之间的比较分析，其值越小，表明模型的拟合优度越高。
式中，n——观测值总数；q——参数数量。
1.7 模型验证
通过4 组任意波动温度条件下的动态生长试验对所构建的模型及其参数的准确性进行验证，比较模型预测值Y^和试验观测值Y 之间的差异，计算均方根误差（RMSE）。另外，通过@Risk8.0 软件实现对误差的拟合分析。
2 结果与分析
2.1 数值分析与模型构建
本研究所用烤鸭样品均经灭菌处理，以便消除背景微生物对金黄色葡萄球菌生长的影响。样品中金黄色葡萄球菌的初始接菌量为102.5～103 CFU/g，12，16，20，25，30 和35 ℃条件下，金黄色葡萄球菌的生长曲线如图1所示。由图1可知，6 组不同的温度条件下，金黄色葡萄球菌在烤鸭样品中的生长状况均为良好，其生长曲线均包含迟滞期、对数期及稳定期3 个阶段。此外，随着试验温度的升高，金黄色葡萄球菌的生长速率逐渐增大，达到稳定期所需时间也更短。
图1 烤鸭中金黄色葡萄球菌生长曲线一步法拟合分析
Fig.1 One-step curve fitting of growth curves of S.aureus in roasted duck
通过一步法对由上述6 组恒温条件下金黄色葡萄球菌生长数据合并的新数据集（共计182 个数据点） 进行全局拟合分析，分别求解微分方程（1）、（2）、（3），计算金黄色葡萄球菌的生长动力学参数{P}（式5、6、7），构建包含初级模型和二级模型的3 种组合模型，即Huang-HSR 模型、Baranyi-HSR 模型和Two Compartment-HSR 模型，其统计分析和参数估计结果分别如表1和表2所示。F检验表明，3 种组合模型均可用于描述烤鸭样品中金黄色葡萄球菌的生长（P<0.05），其中Huang-HSR 模型、Baranyi-HSR 模型、Two Compartment-HSR 模型的均方根误差（RMSE）分别为0.50，0.52，0.52 lg（CFU/g），AIC 值分别为-242.513，-229.829，-231.492（表1）。由表2可知，通过一步法求解的Huang-HSR 模型、Baranyi-HSR 模型及Two Compartment-HSR 模型的生长参数或系数的估计值均达到显著水平（P<0.05），其中最大生长浓度的估计值分别为21.43 ln（CFU/g）〔或9.31 lg（CFU/g）〕、21.45 ln（CFU/g）〔或9.31 lg （CFU/g）〕和21.47 ln （CFU/g）（或9.32 lg （CFU/g）），三者之间最大差值仅为0.04 ln （CFU/g）（或0.01 lg（CFU/g）），无显著差异；3 种组合模型估计的最低生长温度分别为8.29，8.74 和8.74 ℃，与文献[26]报道的金黄色葡萄球菌的最低生长温度较为接近。另外，需要指出的是，虽然3 种组合模型具有相同的二级模型，且系数a 相近（分别为0.082，0.084，0.084），但其初级模型有所差异。Huang 模型仅以一个微分方程描述细菌生长，且以显函数的形式明确定义了细菌的迟滞期（λ），并通过表达式
描述了迟滞期 （λ） 与最大比生长速率（μmax）之间的关系，即，由表2可知，A 和m 分别为1.144 和1.324；Baranyi 模型以两个微分方程描述细菌生长，并通过引入参数Q （其初值Q0=-1.434），以隐函数的形式定义细菌的迟滞期；Two Compartment 模型将接种至样品中的细菌细胞分为处于休眠期细胞和分裂期细胞两类，通过参数γ（=0.286）定义休眠细胞向分裂期细胞的转化过程，并通过两个微分方程分别描述休眠期和分裂期细菌的变化 [27]。综合分析，本研究建议选择Huang-HSR 模型作为描述烤鸭中金黄色葡萄球菌的组合模型。
表1 一步法分析结果
Table 1 Results of one-step approach analysis
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表2 烤鸭中3 种模型的参数估计
Table 2 Estimated parameters of three models in roasted duck
注：a21.43 ln（CFU/g）=9.31 lg（CFU/g）；b21.45 ln（CFU/g）=9.31 lg（CFU/g）；21.47 ln（CFU/g）=9.32 lg（CFU/g）。
?
温度对烤鸭中金黄色葡萄球菌生长速率的影响如图2所示，同时，图2还将本研究结果与相关文献报道结果进行了对比。宇盛好等[16]研究了温度对烤鸭中金黄色葡萄球菌生长的影响，通过两步法构建二级模型
=0.024T-0.0018，估算的最低生长温度为0.075 ℃；张微等[18]研究了温度对盐水牛肉中金黄色葡萄球菌生长的影响，同样的，通过两步法构建二级模型
=0.023（T-1.0513），估算的最低生长温度为1.051 ℃。上述文献报道的最低生长温度均小于本研究估算的最低生长温度，这种差异主要是由二级模型的不同而导致。上述文献均选择Ratkowsky 平方根模型[28]作为二级模型，与HSR 模型（式4）相比，该模型估算的最低生长温度为表观最低生长温度（T0），一般而言，T0低于实际最低生长温度（Tmin）[29]。另外，由图2可知，当温度大于20 ℃时，本研究中金黄色葡萄球菌的生长速率约大于文献报道的生长速率，产生这种差异的一个原因可能是食品基质不同。值得注意的是，本研究所用的烤鸭样品均经过灭菌处理，金黄色葡萄球菌在此样品中的生长代表着无背景菌群干扰的极端情形（worst-case），其生长速率可能相对较大；反过来，当样品中存在背景菌群时，其生长速率可能因背景菌群的抑制而减小。
图2 温度对熟肉制品中金黄色葡萄球菌生长速率的影响
Fig.2 Effect of temperature on growth rate of S.aureus in cooked meat products
2.2 模型验证
模型构建过程仅选取了恒定温度条件下金黄色葡萄球菌的生长数据进行分析，因此，选取4 组波动温度（TP1-4：温度3～33 ℃，储存时间118～224 h）状态下的动态生长试验数据用于验证模型和参数的准确性。据前所述，以Huang-HSR 为组合模型，将其参数代入，正向计算获得4 组波动温度条件下金黄色葡萄球菌的预测曲线，由图3可知，烤鸭中金黄色葡萄球菌生长曲线的预测值与实际观测值相近，4 组验证试验的RMSE 值分别为0.28，0.31，0.33 和0.40 lg （CFU/g）；另外，由图4可知，其残差服从均值为0.04 lg （CFU/g）、标准差为0.44 lg （CFU/g）的正态分布，总体上，大约74.2%的残差处于±0.5 lg （CFU/g）范围内，表明Huang-HSR 模型可用于波动温度条件下烤鸭中金黄色葡萄球菌的生长预测。
图3 波动温度条件下烤鸭中金黄色葡萄球菌的生长曲线
Fig.3 Growth curves of S.aureus in roasted duck at dynamic condition
图4 烤鸭中Huang-HSR 模型的误差拟合分析
Fig.4 Error fitting analysis of Huang-HSR model in roasted duck
2.3 模型应用与动态生长数值模拟
在我国，除了城市地区的少数高端超市以外，大量的街边烤鸭店或卤味店是加工、售卖烤鸭的主要场所。通常情况下，产品在烤制结束后往往未经任何形式的包装，而直接暴露于室温中挂卖，或贮存于半敞开式的柜台中销售。然而，部分烤鸭店或卤味加工店的环境卫生状况较差，具有较高的交叉污染的风险。因此，当预测模型及其参数验证完成之后，继续将构建的模型应用于烤鸭实际生产销售或人工设置的波动温度状态，以模拟烤鸭中金黄色葡萄球菌的生长。本研究实地采集了某卤味店中产品的环境温度，时间从当日上午9：00持续至次日晚10：00，共计约37 h。由图5可知，采集开始至晚上打烊，产品平均温度约25 ℃（因空调制冷，中午温度稍微下降）左右，至当日晚上10：00，部分卤味产品转移至冰柜中保存，次日上午11：00 左右，冷藏产品取出再次销售。基于上述实测温度，图6模拟了不同初始污染浓度对烤鸭中金黄色葡萄球菌生长的影响，假设产品分别具有2.0，3.0，4.0 lg （CFU/g）的初始污染浓度，经历当日上午9：00 至晚上10：00 的贮藏，其浓度可达4.0，5.0，6.0 lg （CFU/g）；倘若经过夜间冷藏后于次日再次销售，直到次日晚10：00，其浓度可达6.0，7.0，8.0 lg （CFU/g）。虽然几乎不可能发生从当日上午至次日晚上的产品积压的极端情形，但烤制当日出现产品积压的情形则相对普遍。由模拟结果可知，当日采集开始至晚上打样期间内金黄色葡萄球菌的增长可达2 个数量级，仍有可能产生耐热的肠毒素。从此角度而言，被污染的烤鸭产品在食用前即使经过再次加热，仍有可能引发食物中毒的风险。图6模拟了不同振荡范围（10～20，15～25，20～30，25～35 ℃）和不同周期（图6a：2 h 或图6b：4 h）的正弦波动温度条件下，烤鸭中金黄色葡萄球菌的生长浓度随时间的变化。由图6可知，无论温度波动周期大小，25～35 ℃波动条件下金黄色葡萄球菌的生长最快，13 h 模拟时长中增长3.0 lg （CFU/g）；而10～20 ℃波动条件下金黄色葡萄球菌的增长不显著，这表明温度是影响其生长的重要因素。因此，需要加强烤鸭生产加工和销售环境的卫生监测及温度控制管理，尽量降低感染的风险。
图5 烤鸭中金黄色葡萄球菌数值模拟
Fig.5 Numerical simulation of S.aureus in roasted duck
图6 不同振荡范围和周期的正弦波动温度条件下，烤鸭中金黄色葡萄球菌生长数值模拟
Fig.6 The growth of S.aureus in roasted duck was numerically simulated under sinusoidal fluctuation temperature with different oscillation range and period
3 结论
本研究基于一步法对恒定温度（12～35 ℃）条件下烤鸭中金黄色葡萄球菌的生长数据进行拟合分析，分别构建Huang-HSR、Baranyi-HSR 和Two Compartment-HSR 3 种组合模型，且各模型具有等同的拟合效果；3 种模型估计的金黄色葡萄球菌的最低生长温度分别为8.29，8.74 和8.74 ℃，最大生长浓度分别9.31 lg （CFU/g），9.3 lg （CFU/g）1 和9.32 lg （CFU/g）；初级模型中，Huang 模型比Baranyi、Two Compartment 模型相对简洁，建议选用Huang-HSR 组合模型；4 组波动温度验证试验的RMSE 介于0.28～0.40 lg （CFU/g）之间，其残差服从均值为0.04 lg （CFU/g）、标准差为0.44 lg（CFU/g） 的正态分布，大约有74.2%的残差处于±0.5 lg （CFU/g）范围内；结合实际采集的烤鸭店环境温度和人工设置的正弦波动温度，开展烤鸭中金黄色葡萄球菌的生长数值模拟，证明了模型的潜在应用性。
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