陈皮为芸香科植物橘（Citrus reticulata Blanco）及其栽培变种的干燥成熟果皮，具有理气健脾，燥湿化痰之功[1]。其入药历史悠久，始载于《神农本草经》[2]，原名“橘柚”，为常用的药食两用品。《本草经集注》以其“陈久者良”[4]，之后医家以橘皮久藏能温、能行，至《食疗本草》[3]始有“陈皮”之名，沿用至今，流通药材分为“陈皮”与“广陈皮”。现代研究，学者多从贮藏条件[5]、环境因子[6]等各方面探究陈皮陈化机制，并通过对陈皮中真菌的分析进一步探究陈皮的药效物质基础。项目组前期研究了3，5，10年广陈皮优势菌落，常见、稀有菌群[7]，发现广陈皮表面真菌群落与湿度、水分、温度、总黄酮、多糖含量密切相关。尝试将黑曲霉反接陈皮，结果发现黄酮类成分含量均增加，抗氧化和祛痰作用增强，与仓储5年陈皮功效相当。提示广陈皮表面微生物可引起药效物质的改变。研究广陈皮微生物分布，于广陈皮质量控制具有重要意义。
本文以标准仓贮0，1，2，3，4，5，10，15，30年的广陈皮为研究对象，通过Illumina HiSeq 测序平台，分析不同贮藏年限广陈皮真菌与细菌群落的差异，以及微生物群落变化规律，为广陈皮质量控制提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验仪器与试剂
PTC200PCR 仪，美国BIO-Rad 公司；DYY-8C 电泳仪，北京六一仪器厂；2×Taq PCR Master-Mix （Tiangen Biotech Co.，China）；QIAquick 胶回收试剂盒，QIAGEN 公司；HiSeq 2500 测序系统，Illumina 公司；建库试剂盒TruSeq ® DNA PCR-Free Sample Preparation Kit，Illumina 公司。
1.2 试验材料
不同贮藏年限标准仓储广陈皮均购于江门市新会陈皮村市场股份有限公司，经成都中医药大学鉴定为茶枝柑，见表1。标准仓储为产地原位仓储，季节性定期管理，并记录仓储温湿度变化，是一种良好的样品可追溯收集办法，可避免环境以及年份不准确对微生物种类的影响，对确保试验结果准确性提供了保障。
表1 广陈皮信息表
Table 1 Sample information
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1.3 试验方法
使用无菌棉签擦拭样品表面，剪下棉签部分，采用CTAB 法提取样品总DNA，根据保守区设计得到引物，在引物末端加上测序接头，进行PCR扩增并对其产物进行纯化、定量和均一化形成测序文库，进行文库质检，质检合格的文库用Illumina HiSeq 2500 测序。
1.4 数据处理
采用Illumina HiSeq 测序平台得到双端reads数PE Reads，进行拼接得到原始序列数Raw Tags，将原始序列过滤得到优化序列Clean Tags，再进行过滤嵌合体，得到可用于后续分析的有效数据Effective Tags。使用UCLUST 对Tags 在97%的相似度水平下进行聚类、获得OTUs，并对每个OUT 进行物种注释。同时对OTUs 进行丰度、Alpha 多样性以及主成分分析。
2 结果与分析
2.1 OUT 分析结果
使用QIIME[8]（version 1.8.0）软件中的U CLUST[9]对Tags 在97%的相似度水平下进行聚类、获得OTU，并基于Silva（细菌）和UNITE（真菌）分类学数据库对OTU 进行分类学注释。不同年限广陈皮各等级的物种类型数目见表2，微生物“属”水平的物种分布见图1、图2。
由表2可知，随着贮存年限的增加，真菌各等级的物种类型数目整体呈先上升后下降的趋势，在贮存年限为两年时达到最高。由图1可知，在“属”水平，不同年限广陈皮样品的真菌种类不尽相同，总体相对丰度水平前10 的真菌属为有孢汉逊酵母属（Hanseniaspora）、节担菌属（Wallemia）、轮枝菌属（Verticillium）、被孢霉属（Mortierella）、假丝酵母属（Candida）、枝孢菌属（Cladosporium）、镰刀菌属（Fusarium）、曲霉属（Aspergillus）、青霉菌属（Penicillium）与耐干霉菌属（Xeromyces）。其中，有孢汉逊酵母属仅在贮存的初期存在，且相对丰度占比约为9%；假丝酵母菌属、枝孢菌属、曲霉属以及青霉菌属为常驻菌种，曲霉属与青霉菌属在广陈皮产出贮存2年后其生长活性最强。随着贮存的年限增长，耐干霉菌属相对丰度逐年增加，第10年时其相对丰度占比超过40%，第15年成为仅存的注释物种。
表2 各等级的物种类型数目
Table 2 The number of species in each class
编号 真菌 细菌纲目科属种纲目科属种Y0 15 28 45 50 40 18 51 93 237 275 Y1 13 27 43 47 44 21 53 102 261 295 Y2 23 42 70 86 69 25 71 123 288 319 Y3 18 35 52 58 48 23 57 93 206 233 Y4 16 35 60 66 50 24 52 93 236 261 Y5 21 35 42 53 46 34 91 150 281 310 Y10 16 35 58 64 52 20 49 91 229 263 Y15 11 16 22 25 20 20 46 90 239 275 Y30 7 9 13 14 11 22 60 111 264 299
图1 真菌“属”水平物种分布图
Fig.1 Distribution of genus level species of fungi
由表2可知，广陈皮的细菌各等级物种类型数目，随年限增加整体呈先增加，后减少，再增加，最终逐渐缓慢减少并趋于稳定。由图2可知相对丰度水平前10 的细菌属为布劳特氏菌属（Blautia）、霍氏真杆菌属（[Eubacterium]hallii group）、1174-901-12、泛菌属（Pantoea）、鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas）、乳杆菌属（Lactobacillus）、链球菌属（Streptococcus）、另枝菌属（Alistipes）、毛螺菌属（Uncultured bacterium f Lachnospiraceae）、瘤胃球菌属（[Ruminococcus]torques group）。其 中1174-901-12 仅存在于当年刚产的广陈皮中，泛菌属在贮存4年的广陈皮中相对丰度占比达20%以上，其它年份却极少存在，其它菌属在不同年限的样品中均存在，但在贮存的前4年，每年各有1至2 个显著的优势菌属。而在贮存年限为5年、10年、15年以及30年的样品中各菌属相对丰度占比渐趋均衡，与前4年的样品相比优势菌属并未显示出突出的优势。
图2 细菌“属”水平物种分布图
Fig.2 Distribution of bacteria at the genus level
注：1.一种颜色代表一个物种，色块长度表示物种所占相对丰度比例；2.为使视图效果最佳，只显示丰度水平前10 的物种，并将其它物种合并为Others 在图中显示，Unclassified 代表未得到分类学注释的物种。
2.2 Alpha 多样性分析结果
Alpha 多样性（Alpha diversity）反映的是单个样品物种丰度（richness）及物种多样性（diversity）。Chao1 和Ace 指数衡量物种丰度即物种数量的多少。Shannon 和Simpson 指数用于衡量物种多样性，受样品群落中物种丰度和物种均匀度（Community evenness） 的影响。相同物种丰度的情况下，群落中各物种均匀度越大，则群落多样性越大，Shannon 指数值越大，Simpson 指数值越小，说明样品的物种多样性越高[10]。另外还统计了OTU覆率Coverage，其数值越高，则样本中物种被测出的概率越高，而没有被测出的概率越低。该指数反映本次测序结果是否代表了样本中微生物的真实情况。
使用Mothur（version v.1.30）软件，对样品Alpha 多样性指数进行评估。各样品Alpha 多样性指数值统计如表3所示。
由表3可知，不同年限样品的真菌与细菌的OUT 覆盖率均在0.999 以上，表明本次测序结果能较准确地反映样本中微生物的真实情况。
表3 Alpha 多样性指数值统计表
Table 3 Statistical table of Alpha diversity index
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物种丰富度以ACE 指数为评价指标，各样品的丰富度大小顺序为Y10＞Y1＞Y4＞Y2＞Y3＞Y0＞Y5＞Y15＞Y30 （真菌）；Y2＞Y4＞Y5＞Y15 （Y30）＞Y10＞Y1＞Y3＞Y0（细菌）。以Chao1 指数评价物种丰富度，各样品的丰富度大小顺序为Y4＞Y2＞Y10＞Y3＞Y5＞Y1＞Y0＞Y15＞Y30 （真菌）；Y2＞Y4＞Y15＞Y30＞Y5＞Y10＞Y1＞Y3＞Y0（细菌）。综合ACE指数与Chao1 指数两个指标，真菌的物种类型在贮存年限为2 至4年时丰富度较高，随着贮存年限的增加物种丰富度下降，当贮存年限为30年时丰富度指数仅为指数得分较高样品的1/6 至1/10；细菌的物种类型在贮存年限为2年、4年时丰富度较高，当样品贮存10年以上丰富度指数变化差异小，物种类型数目趋于稳定。
物种多样性以Simpson 指数为评价指标，各样品的多样性顺序为Y2＞Y4＞Y3＞Y5＞Y10＞Y0＞Y30＞Y15＞Y1 （真菌）；Y15＞Y10＞Y5＞Y3 （Y30）＞Y0＞Y1＞Y2＞Y4（细菌）。以Shannon 指数为评价指标，各样品的多样性顺序为Y2＞Y3＞Y4＞Y5＞Y10＞Y0＞Y1＞Y15＞Y30（真菌）；Y5＞Y10＞Y15＞Y30＞Y3＞Y1＞Y4＞Y2＞Y0 （细菌）。综合Simpson 指数与Shannon 指数两个指标，在广陈皮的产出初期与贮存年限超过10年时真菌物种多样性较差，即物种均一性差，表明广陈皮在产出初期与贮存较长年限后真菌的优势菌群更为突出。而广陈皮中的细菌在贮存年限长的样品中物种多样性较大，即均一性较好，表明随着贮存时间的延长，广陈皮中各类细菌在长期生存竞争之下，逐渐达到一种相互制约平衡的状态，这与真菌形成显著优势菌群的情况存在差异。
2.3 主成分分析结果
通过主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）方法对不同样品OUT 组成进行分析，并使用R 语言工具绘制PCA 分析图，结果见图3、图4。
图3 真菌PCA 分析图
Fig.3 PCA analysis of fungi
注：点分别表示各样品；不同颜色代表不同分组；横坐标表示第一主成分，百分比则表示第一主成分对样品差异的贡献值；纵坐标表示第二主成分，百分比表示第二主成分对样品差异的贡献值。
图4 细菌PCA 分析图
Fig.4 PCA analysis of bacteria
注：点分别表示各样品；不同颜色代表不同分组；横坐标表示第一主成分，百分比则表示第一主成分对样品差异的贡献值；纵坐标表示第二主成分，百分比表示第二主成分对样品差异的贡献值。
由真菌的主成分分析图可知，两主成分之和大于90%，表明两个成分能很好地代表样品中真菌群落的信息，其中PC1 和PC2 分别解释了不同真菌群落71.10%和26.84%的信息。根据主成分分析结果可将不同贮存时间的广陈皮样品划分为3组，贮存0年、1年为一组，贮存2年、3年、4年、5年、10年为一组，贮存15年、30年为一组。
由细菌的主成分分析图可知，两主成分之和大于60%，其中PC1 和PC2 分别解释了不同细菌群落32.01%和28.63%的信息，两个成分所占比重相似。综合两大主成分的分析结果，不同年限的广陈皮样品可归为4 类，贮存1年、3年、5年、10年、15年、30年为一类，贮存0年、2年、4年各为一类。
2.4 真菌群落分布特征
基于ITS 区高通量测序的序列数据，并结合OUT 分析、Alpha 多样性分析与主成分分析的结果表明，9 个不同贮存年限的广陈皮样品，其真菌的物种类型丰富程度总体为先上升后下降，在贮存年限为2年、3年、4年、5年、10年时物种类型数目较多且均一性好，说明该期间广陈皮各真菌群落生长活力差异较小，不同菌落之间竞争生存以维持一个相对稳定的微生物环境。在此期间青霉菌属与曲霉属为主要菌群。据相关研究报道[7、11-12]，青霉菌具有一定的酶活性，可降解纤维素等以提高总黄酮的提取率。曲霉作为发酵工业的常用菌种，可促使化学活性物质合成转化。贮存3年的广陈皮中青霉菌属和曲霉属活力较强与传统要求的“存期3年或以上的才称之为陈皮” 的说法相对应，从各分析结果还可知，在贮存初期与超过10年的样品中真菌群落中优势菌属显著，但这两种时期的优势菌属种类却大不相同。陈皮在产出当年有孢汉逊酵母属相对丰度优势明显，但经过1年之后相对丰度占比减少至初始的三分之一，其相对丰度与曲霉属相当，约占总体的3%，贮存2年的样品中已不存在有孢汉逊酵母属，而耐干霉菌属则表现出相反的丰度变化趋势。有孢汉逊酵母属为一类拮抗酵母菌常喷洒于柑橘上以抑制柑橘采后病害的发生[10]，故此推断在产出当年有孢汉逊酵母属相对丰度占比高可能是由人为导致，后主导地位被更适宜生存的青霉菌等所取代。但随着年限的延长，真菌所需的营养物质不断消耗，生存条件逐渐恶化，大部分菌种难以存活，而耐干霉菌属这种极端环境微生物相对丰度不断地增加，由第10年的40%在第15年上升至80%，成为绝对的优势菌属。
2.5 细菌群落分布特征
通过16S 区高通量测序得到序列数据，运用OUT 分析、Alpha 多样性分析与主成分分析可知细菌在不同年限样品中的变化规律。区别于真菌，细菌种类数目的变化趋势波动较大，但变化幅度较小。细菌中的优势菌属有鞘氨醇单胞菌、乳杆菌属、另枝菌属与泛菌属，分别为贮存年限0年、1年、2年与4年样品的优势菌属，以及在各年份样品中均占有较高相对丰度的瘤胃球菌属。因优势菌属的制约，0年、1年、2年和4年的样品虽菌群种类丰富度略高，但均一性较差。加之不同年限优势菌属存在差异，贮存年限0年、2年、4年的样品与其它年限的样品被划归为不同类别。其中鞘氨醇单胞菌作为贮存0年样品的优势菌属具有降解芳香化合物的特性，解释了研究报道[13]中所述的广陈皮在陈化初期，阿魏酸、绿原酸呈下降趋势而香豆酸呈上升趋势的现象。作为早期优势菌的乳杆菌属与泛菌属主要分解消耗鼠李糖、果糖、蔗糖等营养物质。而在各年份均有着较高相对丰度的瘤胃球菌属可降解细胞壁中的纤维素，这将有利于植物细胞中物质的溶出，提高药效物质的提取率。通过以上不同细菌属的生物特性与分布特点可以从微生物的角度更好地理解广陈皮的陈化机制。
3 结论
通过本研究可知，不同年份广陈皮表面微生物的分布特点与自身的生物习性和所处的外在环境息息相关，寄生于广陈皮的微生物在消耗广陈皮营养物质的同时亦代谢产生各种活性酶而作用于寄主，以此改变寄主的内在物质基础。因此在广陈皮的陈化过程中，不同年份优势菌属的改变，也可从一定程度上反映广陈皮所处的年份，如同药材的成分特征图谱，不同的菌属亦可用于表达广陈皮的年份信息。相较于真菌，细菌在不同年份间的种类差异不是那么显著，故基于本次研究结果，可建立以真菌特征菌属为主，细菌特征菌属为辅的模式来初步判断陈皮药材的贮存时间。其中贮存年限0年的广陈皮应检出真菌孢汉逊酵母属或细菌1174-901-12，且不能检出耐干霉菌属；贮存年限1 至5年应检出青霉菌属与曲霉属，可检出真菌镰刀菌属或细菌泛菌属；贮存年限5年以上至10年的广陈皮应检出青霉菌属、曲霉属与耐干霉菌属；贮存年限10年以上的广陈皮应检出耐干霉菌属，青霉菌属与曲霉菌属不得检出或少量检出。
本研究利用高通量测序方法分析了0，1，2，3，4，5，10，15，30年的广陈皮药材表面微生物分布特点，从环境因子以外的另一个方面来更深入的认识广陈皮的陈化机制，加之本次研究所用广陈皮药材的贮存年限跨幅大，可较之前类似的报道更为全面地反映了微生物与广陈皮年份之间的关系，有助于更好地分析微生物对广陈皮陈化过程的影响，揭示广陈皮药效物质的形成机理。另外，本文对广陈皮特征菌属这一概念的首次提出可为陈皮质量研究提供新的思路。
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