牛磺酸（Taurine，C2H7NO3S，HO3S-CH2-CH2-NH2）化学名为β-氨基乙磺酸，是一种特殊的含硫非蛋白氨基酸，以游离状态分布于组织间液和细胞内液中。牛磺酸具有突出的生理药理作用，能调节机体内糖类和脂类的代谢，提高机体免疫力，维持渗透压平衡，增强细胞膜抗氧化能力等[1-3]，对婴幼儿智力开发和神经系统的发育也有重要作用[4-5]。目前，牛磺酸作为一种必备的营养强化剂添加在食品中，欧美等发达国家规定在婴幼儿食品中必须添加一定量的牛磺酸。我国食品安全国家标准也规定，为了改善婴幼儿配方食品的蛋白质质量，提高其营养价值，推荐婴儿配方乳制品中添加适当牛磺酸。
特殊医学用途配方奶粉（特医奶粉） 主要包括：部分水解、深度水解和全氨基酸水解配方奶粉，是针对过敏体质婴儿专门设计的。婴幼儿的免疫系统未完全发育，胃肠道屏障发育不成熟，牛奶蛋白对婴幼儿来说是一种异种蛋白，牛奶中的β-乳球蛋白有很强的致敏性，极易出现婴幼儿牛奶蛋白过敏，造成便血，腹胀，甚至会导致患儿出现死亡以及过敏性休克[6]。牛奶蛋白过敏的发病率为6%，已成为对婴幼儿健康成长发育产生影响的首要因素[7-8]。水解配方奶粉在加工时将牛奶中的蛋白质部分水解或者完全水解，以降低过敏概率，且不会影响蛋白质的营养，已成为大多婴幼儿食用的首选。
特医奶粉的基质体系相对于普通婴儿配方奶粉复杂很多，蛋白质被水解后形成大量的氨基酸于基质中，对于牛磺酸的定量分析会产生很大的干扰。其中，薄层扫描法[9-10]很容易受到其余氨基酸的干扰，准确性较低；高效液相色谱——串联质谱法[11-13]虽应用广泛，但对于奶粉本身的基质效应显著，重复性不理想；高效液相色谱——紫外检测[14-16]，受到牛磺酸自身紫外吸收较弱的影响，灵敏度较低。
本文选择基质最为复杂的全氨基酸水解配方奶粉，改进前处理方法，以克服反应时间长的缺点[17]，保留丹磺酰氯柱前衍生定量准确的优点，并构建二维液相系统（2D-LC）。在除去大量氨基酸的干扰后，利用荧光检测器精确测定牛磺酸含量。本试验方法，不仅解决了国家标准目前无法准确定量全氨基酸水解配方奶粉中牛磺酸含量的问题，对其余特殊医学用途奶粉和普通婴幼儿配方奶粉也同样适用。
1 材料与方法
1.1 设备和试剂
DionexUltiMate 3000 系统 （双三元梯度泵），美国 Thermal Scientific；Centrifuge 5804 高速离心机，德国 Eppendorf；D-91126 多管涡旋振荡器，德国Heidolph；C9NK-SK1200BTU 超声波清洗机，中国KUDOS；Milli-Q 超纯水系统，美国Millipore；MSZO 204S 型电子天平，瑞士Mettler Toledo。
牛磺酸标准品、牛磺酸实物标样，中国检验检疫科学研究院测试评估中心；婴幼儿配方奶粉、特殊医学用途水解配方奶粉，国内某知名乳业有限公司；丹磺酰氯，日本东京化成工业株式公社；甲醇、乙腈（色谱纯），美国Thermal Fisher Chemical；甲酸（色谱纯），美国ACS 色谱试剂；三乙胺（色谱纯），美国Tedia；三氟乙酸、亚铁氰化钾、乙酸锌（分析纯），国药集团化学试剂有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 标准溶液和衍生溶液配制 精确称取牛磺酸标准品100.0 mg 于100 mL 容量瓶，配成质量浓度为1.0 mg/mL 的标准储备液。试验前，将储备液用水稀释成质量浓度为1.0，5.0，10.0，15.0，20.0 μg/mL 的标准工作液进行衍生，由高效液相色谱-荧光检测器（HPLC-FLD）检测，以保留时间定性，外标法定量。
1.2.2 样品前处理 提取：精确称取（1.00±0.05）g 奶粉样品于50 mL 聚四氟乙烯塑料离心管中，加入约35 mL 超纯水，涡旋5 min，超声15 min，加入1 mL 150 g/L 亚铁氰化钾溶液和1 mL 300 g/L 乙酸锌溶液，去除基质中的蛋白质，以9 000 r/min 离心2 min，上清液转移至50 mL 容量瓶中，用超纯水定容至刻度。
衍生：取1 mL 溶液于10 mL 聚四氟乙烯塑料离心管中，加入1 mL 30 mg/mL 高质量浓度丹磺酰氯衍生液），10 μL 三乙胺，60 ℃避光加热1 h（每15 min 取出涡旋30 s），加入0.1 mL 质量浓度为20 mg/L 的盐酸甲胺终止反应，过0.22 μm PTFE 滤膜，供2D-LC 荧光检测器检测。
1.3 色谱条件
1.3.1 一维色谱条件 色谱柱：Agilent XDB-C18（3.0 mm×150 mm，3.5 μm）；柱温：35 ℃；进样量：20 μL；流动相A1：0.1%三氟乙酸水；流动相B1：甲醇；流速：0.4 mL/min；梯度洗脱程序见表1。紫外检测器：254 nm。
1.3.2 二维色谱条件 二维液相系统连接流程见图1。当六通阀从1-2 连通状态转变为1-6 连通时，目标物被中心切入第二维液相体系；色谱柱：Thermal AccucoreTM PFP （3.0 mm×150 mm，2.6 μm）；柱温：35 ℃；进样量：20 μL；流动相A2：0.1%甲酸水；流动相B1：乙腈；流速：0.6 mL/min；梯度洗脱程序见表1。荧光检测器：激发波长为330 nm，发射波长530 nm。
表1 液相色谱条件
Table 1 Liquid chromatography condition
时间/min 一维梯度条件A1：1‰三氟乙酸水 B1：甲醇80 20 1 80 20 11 0 100 11.1 80 20 14 80 20 0时间/min 二维梯度条件A2：1‰甲酸水 B2：乙腈90 10 5 90 10 12 60 40 14 60 40 0
图1 二维液相系统连接示意图
Fig.1 Schematic diagram of two-dimensional liquid system connection
2 结果与讨论
牛磺酸检测的关键因素为衍生条件，包括衍生液的浓度，衍生环境的pH 值，和衍生时间。丹磺酰氯（二甲氨基-萘磺酰氯DNS-CL）是一种强荧光剂，能专一地与肽链N-端的α-氨基反应生成丹磺酰-肽，后者水解生成的丹磺酰-氨基酸具有很强的荧光信号。传统婴儿配方奶粉在沉淀蛋白后，用1.5 mg/mL DNS-CL 在碱性条件下衍生，得到荧光产物（参考国标GB 5009.169-2016）[18]。在全氨基酸水解配方奶粉中，其余氨基酸同样可与DNS-CL 反应，导致牛磺酸的衍生反应不完全，其回收率不到25%，相对标准偏差也较大（见表2）。本试验将DNS-CL 的浓度大幅度提高，同时考虑其不溶于水的物理性质，利用三乙胺（有机碱）代替传统的碳酸氢钠缓冲液调节溶液pH 值，并在60 ℃水浴中加热，提高反应速率，使高浓度的DNS-CL 与牛磺酸充分反应。
表2 牛磺酸在不同奶粉基质中的回收率和相对标准偏差
Table 2 Recoveries and relative standard deviations （RSDs） of taurine in different matrixes
注：企业理论添加量40.0 mg/100 g；3 平行，4 批次，12 个样品的平均值。
实际含量/mg（100g）-1 回收率/% 相对标准偏差RSD/%婴幼儿配方奶粉 39.2 98.0 0.43全氨基酸水解配方奶粉9.6 24.0 6.76
另外，对二维液相系统进行探究，二维液相色谱是将分离机理不同且相互独立的两支色谱柱串联起来构成的分离系统，通过柱切换技术完成牛磺酸在二维色谱柱之间的流动[19]。样品经第一维色谱洗脱分离，锁定目标物的出峰时间，进入切换阀的接口中，经捕集和中心切割，被切换进入第二维色谱柱及检测器[20]。由此得到的牛磺酸具有更高的峰容量和分辨力。2D-LC 系统更适合于牛磺酸在多组分、复杂基质体系中的分离分析[21-23]。
2.1 DNS-CL 衍生液浓度
提高DNS-CL 的浓度，将包括牛磺酸在内的所有氨基酸一并衍生。DNS-CL 在乙腈中的溶解度为50 mg/mL，尝试3 个衍生质量浓度（15，30，45 mg/mL），研究全氨基酸水解配方奶粉的最佳衍生液浓度（表3）。
表3 全氨基酸水解配方奶粉中牛磺酸在不同丹磺酰氯浓度下的回收率和相对标准偏差
Table 3 Effect of different DNS-CL concentration on the recoveries and relative standard deviations （RSDs）of taurine in amino-acid-hydrolyzed formula milk powder
注：企业理论添加量40.0 mg/100 g；控制变量：三乙胺为10 μL，反应时间2 h；结果取12 个样品的平均值。
丹磺酰氯质量浓度/g·L-1实际含量/mg（100g）-1 回收率/%相对标准偏差RSD/%全氨基酸-水解配方奶粉15.0 18.6 46.5 1.06 30.0 38.1 95.3 1.21 45.0 37.9 94.8 2.81
随着DNS-CL 浓度的增大，牛磺酸的回收率均有大幅提升。使用15.0 mg/mL DNS-CL 衍生，牛磺酸的回收率低于60%，这说明衍生反应仍不完全。而30.0 mg/mL 和45.0 mg/mL 质量浓度的DNS-CL 均能确保牛磺酸得到较为完整的衍生，其牛磺酸的回收率都在90%以上。衍生物丹磺酰-氨基乙磺酸DNS-NH-（CH2）2-SO3H 的色谱峰形更为尖锐，峰面积、峰高均大幅增加。值得一提的是，45.0 mg/mL DNS-CL 在与牛磺酸反应的同时，因自身溶解度的问题，衍生一段时间后，会有反应物沉淀析出[24]，造成衍生过程的不均匀，重现性不理想，这可能是其结果的相对标准偏差更大的主要原因。另外，高浓度DNS-CL 衍生得到的丹磺酰-氨基乙磺酸中会伴有其它杂质（图5c），经波长鉴定，与丹磺酰基团有关，其对色谱柱的分离和柱效都会有影响，目标峰的相对百分比也会下降，应尽量避免。在30.0 mg/mL 和45.0 mg/mL 的DNS-CL 对牛磺酸检测结果没有显著性差异的情况下，本试验选择30.0 mg/mL DNS-CL 作为最终的衍生液。
2.2 衍生环境pH 值
牛磺酸与DNS-CL 的反应过程中，随着荧光产物丹磺酰-氨基乙磺酸DNS-NH-（CH2）2-SO3H的生成，DNS-CL 上的Cl-与H+结合为HCl，降低了溶液的pH 值，会抑制反应向正方向进行。在衍生过程中，需保持溶液体系在碱性环境中进行。牛磺酸的最佳起始衍生环境通常控制在pH=9.5 左右[25-26]。考虑到DNS-CL 不溶于水，30.0 mg/mL DNS-CL 在与牛磺酸反应时，无法利用碳酸钠缓冲液调节溶液pH 值，故本试验尝试用三乙胺（有机碱，TEA）来代替传统的碳酸钠缓冲液。表4表明不同初始衍生溶液的pH 值对牛磺酸结果的影响。
表4 全氨基酸水解配方奶粉中牛磺酸在不同三乙胺添加量下的回收率和相对标准偏差
Table 4 Effect of different triethylamine content on the recoveries and relative standard deviations （RSDs）of taurine in amino-acid-hydrolyzed formula milk powder
注：企业理论添加量40.0 mg/100 g；控制变量丹磺酰氯质量浓度30.0 mg/mL，反应时间2 h；结果取12 个样品的平均值。
三乙胺添加量/μL 溶液初始pH 值 实际含量/mg·（100g）-1 回收率/% 相对标准偏差RSD/%全氨基酸水解配方奶粉6.4 1.6 4.1 0.25 10 10.1 37.6 93.4 1.18 20 10.5 36.4 91.0 1.21 50 10.7 37.3 93.3 1.13 0
在不添加三乙胺的情况下，牛磺酸的回收率仅4.1%。加入三乙胺能迅速提升溶液的pH 值，三乙胺（C2H5）3N 中的N 孤电子对为SP3 杂化，很容易给出电子。同时，三乙胺结合氢质子后，其3 个乙基可以通过超共轭效应来稳定电荷，保证衍生溶液的稳定性。10 μL 三乙胺可将溶液的pH 值调节至10.1，可以充分满足衍生条件，其回收率达90%以上。随着三乙胺的增加，目标物的色谱峰面积和回收率并没有显著性增加，考虑到三乙胺有一定的刺激性，在保证衍生充分性的前提下，尽量控制其添加量。本试验最终选择10 μL 三乙胺来调节衍生液的pH 值。
2.3 衍生反应时间
从图2a 可知，在反应后的0.5 h，利用本方法得到的牛磺酸含量达25.6 mg/100 g （回收率64%），1 h 后接近企业理论添加量40 mg/100 g，1.5 h 后，其含量没有显著性增加。值得注意的是，本方法同样可用于检测普通婴幼儿配方奶粉中的牛磺酸。虽然奶粉基质体系不同，但是在牛磺酸添加量相同的情况下，其检测结果随反应时间增加的变化趋势相同。经1 h 的衍生，回收率均达90%以上 （图2a 和图2b）。本方法与国标GB 5009.169-2016 相比，当检测同一普通婴幼儿配方奶粉时，可将衍生时间缩短一半，衍生过程在1 h 左右完成，加快了反应效率，减少了反应时间和能耗（图2b 和图2c）；而图2d 说明国标方法无法完全衍生全氨基酸水解配方奶粉。
图2 衍生时间对牛磺酸含量和回收率的影响
Fig.2 Effect of derivative time on the recoveries and relative standard deviations （RSDs） of taurine
注：企业理论添加量40.0 mg/100g；控制变量：丹磺酰氯质量浓度为30.0 mg/mL，三乙胺添加量10 μL；结果取12 个样品的平均值。
综上比较，DNS-CL 衍生法检测牛磺酸的优势在于准确度很高，缺点在于专一性和特异性不强，柱前衍生时间较慢。本试验利用高质量浓度的DNS-CL 在60 ℃水浴中避光加热反应物，使其充分反应，提高衍生速度和效率。对于全氨基酸水解配方奶粉基质，加热能提升高浓度DNS-CL 的溶解度，降低DNS-CL 的析出，使整个衍生反应更加均匀和彻底。全氨基酸水解配方特医奶粉在30.0 mg/mL 的DNS-CL，10 μL 三乙胺的衍生条件下，60 ℃加热1 h，衍生得到最理想量的丹磺酰-氨基乙磺酸，供荧光检测器检测。
2.4 液相条件
2.4.1 一维液相条件 比较图3b 和3c 可知，全氨基酸水解配方奶粉中含有大量普通婴幼儿奶粉中没有的氨基酸。牛磺酸本身紫外吸收很弱[27]，与其余氨基酸衍生物相比，牛磺酸衍生物的响应小很多数量级，无法精确积分定量，应将其分离出来。为了保证将一维色谱柱中的牛磺酸全部中心切割至第二维色谱中，首先利用牛磺酸标准品确定其衍生物在一维色谱中的出峰位置（图3a）。选择0.1%三氟乙酸和甲醇为一维流动相，Agilent XDB-C18（150 mm）为色谱柱，紫外检测器。流动相中的三氟乙酸与疏水键合相和残留的极性表面以多种模式相互作用，来抑制待测物和反相色谱柱填料表面残留的硅羟基的作用，确保牛磺酸衍生物良好的峰形。另外，三氟乙酸的紫外最大吸收峰低于200 nm，对多肽在低波长处的检测干扰很小。牛磺酸衍生物在最大紫外波长（254 nm）吸收下的响应和峰面积虽很低，但这不影响六通阀切换的时间。一维液相色谱的切割时间最终设定为4.2 min 至5.2 min。此时，目标物顺利被切入第二维液相色谱中，而其余氨基酸都被保留在一维体系中。
图3 牛磺酸衍生物一维紫外色谱图
Fig.3 One-dimensional Ultra Violet chromatogram of taurine derivative
2.4.2 二维液相条件 二维液相色谱既要考虑2个维度的兼容性，又要考虑不同液相体系存在的差异。本试验选择和一维液相条件相近的0.1%甲酸水和乙腈为二维流动相，Thermal AccucoreTM PFP 色谱柱，荧光检测器。五氟苯基（PFP）固定相中的氟化基团可为卤代化合物中含极性官能团的化合物提供独特的选择性，对含有双苯环的丹磺酰-氨基乙磺酸具有很好的保留，同时，其高硅胶表面覆盖率最大程度地减少了次级相互作用和峰拖尾的情况，可以获得很好的峰形。考虑到PFP 填料的稳定性，选择离解常数更温和的0.1%甲酸水作为二维水相；化合物的保留时间更稳定，柱压更小的乙腈作为二维有机相。图4说明0.1%甲酸水-乙腈体系无论在牛磺酸衍生物峰面积的大小还是稳定性上，都是最佳选择。图5则说明牛磺酸衍生物在二维液相色谱中具有足够强的荧光响应信号和良好的色谱峰形，分离度和灵敏度均满足奶粉中牛磺酸检测的要求。
图4 牛磺酸衍生物在不同流动相体系中的峰面积
Fig.4 Peak area of taurine derivatives by different mobile phase system
图5 牛磺酸衍生物二维荧光色谱图
Fig.5 Two-dimensional fluorescence chromatogram of taurine derivative
2.5 方法学评价
2.5.1 线性关系 牛磺酸标样质量浓度在1.0～20.0 mg/L 范围，标准曲线的线性良好，相关系数（R2）达到0.9996。其浓度与峰面积的线性方程为Y=10433.78X+1769.98。
2.5.2 回收率和精密度 测定4 种不同基质奶粉中的牛磺酸含量，所得结果基本一致（见表5），回收率均在90%以上，相对标准偏差均在5%内，说明该方法在检测全氨基酸水解配方和普通婴幼儿配方的奶粉时具有良好的精密度、稳定性和一致性。
表5 4 种基质奶粉中牛磺酸的回收率和相对标准差
Table 5 Recoveries and relative standard deviation （RSDs） of taurine in four different matrix milk powder
注：理论添加量40 mg/100g；3 平行，4 批次，12 个样品的平均值。
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3 结论
本文建立了一套二维液相色谱体系，测定特殊医学用途全氨基酸水解配方奶粉中牛磺酸的含量。该方法在1.0～20.0 mg/L 范围线性良好，线性相关系数0.9996，12 个实际样品的平均回收率为95.2%，相对标准偏差1.86%。该方法准确性高，抗干扰能力强，缩短了丹磺酰氯的柱前衍生时间，具有较好的实际应用价值，解决了现行国家标准无法准确定量全氨基酸水解配方奶粉中牛磺酸的含量，为特殊医学用途乳制品的检测提供了新技术支持，有助于质检部门加强对乳制品市场的监管。经验证，此方法同样适合于其它奶粉基质，可为深度水解配方奶粉，部分水解配方奶粉，和普通婴幼儿配方奶粉的技术优化提供新的思路。同时，此方法也被美国分析化学家协会（AOAC，Association of Official Analytical Chemists） 认可为检测特殊奶粉基质中牛磺酸含量的推荐性方法。
致谢
感谢上海市科委项目基金（NO.17DZ2201200）对本试验的支持，感谢AOAC 委员会专家对本试验方法的认可和优化意见，并感谢美国奥本大学生物系统工程系教授对本试验的指导和建议。
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