油炸外裹糊食品是在食品原料表面裹上由小麦粉、盐、水等复配的糊，再裹上一层面包糠，经深度油炸后制得的一类风味食品，例如：油炸肉制品、果蔬制品和海鲜制品等[1-2]。外裹糊作为外层屏障，在油炸过程中发生一系列的物理和化学变化，包括水分蒸发、淀粉糊化和蛋白质变性等，形成一层金黄色保护层，使食品原料不直接与高温油接触，可以保持食品原料内的水分和鲜味，减少营养成分的流失，赋予油炸外裹糊食品酥脆外壳，具有色泽诱人、浓郁香味等特点。同时，深度油炸也可以杀灭食品中的细菌，延长食品保质期，改善食品风味，增强食品营养成分的消化性，其加工时间比一般的烹调方法短，深受国内外消费者的喜爱。
然而，油炸外裹糊食品的油脂含量过高，占食品质量的三分之一，有的甚至高达50%，长期食用高油脂含量的油炸外裹糊食品容易造成肥胖，导致各种心血管疾病[3-5]。这使低脂油炸外裹糊食品成为油炸食品的研究热点。目前，降低油炸外裹糊食品油脂含量的方法主要有：添加可食性成分，采用预处理工序（例如：热风干燥、微波干燥、热水浸泡处理等），改变油炸介质，物理法脱油（例如：过热蒸汽脱油和真空高速离心脱油等）[4]。其中，添加可食性成分是一种常用的减脂方法，向基础外裹糊中添加蛋白质和多糖等可有效降低油炸食品的油脂含量[5-9]。
蛋白质具有营养价值高，易消化，功能性强（例如：保水性、乳化性、凝胶性等）的特点，将蛋白质作为可食性成分，以降低油炸食品油脂含量的研究，近年来受到很多学者的关注[2-3，5，10]。在外裹糊中添加蛋白质能够改善外壳的致密性和切面的平整度；形成的蛋白质凝胶为立体网状结构，既能束缚水分又可作为风味物质的载体[11]。同时，蛋白质良好的持水能力在深度油炸过程中可以减少油脂的吸收，从而抑制油脂的渗透[12]。Chen 等[13]在含玉米和小麦粉的外裹糊中分别加入1%小麦蛋白、1%大豆蛋白、1%羟丙基甲基纤维素（HPMC）制备油炸外裹糊鱼块，结果发现含1%小麦蛋白和1%大豆蛋白的外壳硬度和脆度均高于对照（未添加成分），且色泽金黄。Susanne 等[14]通过将大豆分离蛋白、酪蛋白酸钠、乳清蛋白、甲基纤维素等11 种可食性成分对谷物制品进行涂膜，比较这些成分对油炸谷物制品的品质、水分和油脂含量等的影响，结果显示，大豆分离蛋白、乳清蛋白和甲基纤维素显著降低了油炸制品的油脂含量，尤其是10%的大豆分离蛋白涂膜使产品的吸油率降低80%。Dogan 等[15]将大豆分离蛋白、乳清分离蛋白及蛋清蛋白添加到外裹糊中，研究蛋白质种类对油炸外裹糊鸡肉块品质的影响，结果发现3 种蛋白质均能抑制油炸过程油脂的渗透，其中乳清分离蛋白和蛋清蛋白能显著降低油脂含量。
本课题组前期研究表明：在外裹糊中分别添加大豆蛋白、乳清蛋白、蛋清蛋白、大米蛋白，能够明显抑制外裹糊鱼块深度油炸过程的油脂吸收[16]。然而，在模式外裹糊体系（高纯度的小麦淀粉和小麦面筋蛋白）中添加蛋白质，研究蛋白质抑制外裹糊鱼块在深度油炸过程中油脂渗透的机制未见报道。添加的蛋白质与小麦淀粉、小麦面筋蛋白相互作用抑制油脂渗透的机制尚不清楚。本试验在模式外裹糊中分别添加大豆蛋白、蛋清蛋白、乳清蛋白和大米蛋白（添加量均为质量分数6%），经170 ℃初炸40 s 后190 ℃复炸30 s，制作油炸外裹糊鱼块，通过分析外壳中蛋白质的表面疏水性、巯基和二硫键含量、荧光强度和二级结构，小麦淀粉晶体结构，油炸外裹糊鱼块的表面油脂和表面渗透油脂含量及油脂的渗透与分布规律，从蛋白质之间及蛋白质与小麦淀粉相互作用的角度，探讨添加蛋白质抑制油脂渗透的机制，为低脂油炸外裹糊鱼制品的规模化生产提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
鲢鱼鱼糜，洪湖市新宏业食品有限公司；金龙鱼大豆油，益海嘉里（武汉）粮油工业有限公司；小麦淀粉（水分含量10.9%，淀粉含量87.2%）、小麦面筋蛋白（水分含量7.5%，蛋白质含量81.9%），北京瑞麦嘉禾商贸有限公司；面包糠（粒径＜2 mm），无锡圣伦特国际贸易有限公司；大豆蛋白（水分含量6.3%，蛋白质含量87.4%），山东御馨生物技术有限公司；蛋清蛋白（水分含量5.2%，蛋白质含量81.6%），大连绿雪蛋品发展有限公司；乳清蛋白（水分含量5.3%，蛋白质含量81.8%），河南盛之德商贸有限公司；大米蛋白（水分含量5.5%，蛋白质含量77.4%），无锡金农生物科技有限公司。
考马斯亮蓝G250，天津大茂化学试剂厂；巯基乙醇（分析纯），山东西亚化学工业有限公司；1-苯胺基-8-萘磺酸 （1-Anilino-8-naphthalisene sulfonate，ANS）、磷酸盐缓冲溶液（0.01 mol/L，pH 7.0），上海源叶生物科技有限公司；Ellman's 试剂，北京科展生物科技有限公司；抗荧光猝灭剂，武汉谷歌生物科技有限公司；Nile Red 染料，Sigma 公司（圣路易斯）。
1.2 仪器与设备
F-4600 型荧光光谱仪，日本Hitachi 公司；FD-1-50 真空冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司；7200 型可见分光光度计，上海尤尼柯仪器有限公司；Bruker D8 Venture X-射线衍射仪，荷兰帕纳科公司；傅里叶红外光谱仪，美国尼高力仪器公司；SZF-06C 脂肪测定仪，浙江托普仪器有限公司；XSP-BM-4C 光学显微镜，上海彼爱姆（BM）光学仪器制造公司；Cryotome E 冷冻切片机，美国Thermo 公司；LYMPUS FV1200 激光共聚焦扫描显微镜，日本奥林巴斯公司。
1.3 试验方法
1.3.1 油炸外裹糊鱼块的制作
1）制备鱼糜肠 参考Weng 等[17]的方法并稍作修改。将大块冷冻鱼糜切成小块（约500 g）室温（25 ℃）解冻，1 200 r/min 空斩5 min，再添加1%的食盐，2 000 r/min 盐斩7 min。取出鱼糜，放入灌肠机进行灌肠封口，置于-18 ℃冰箱冷冻成型备用。
2）调制外裹糊 将小麦淀粉（91.67 g）、小麦面筋蛋白（8.33 g）和添加蛋白质（6%，以小麦淀粉和小麦面筋蛋白为基准）依次加入不锈钢盆中，用筷子搅拌混合均匀后缓慢加入98 g 的水，边加边搅拌至充分混合，用保鲜膜封住盆口防止水分损失，精密搅拌机以1 000 r/min 搅拌10 min，调制成均匀的外裹糊。
3）裹糊、油炸 将冷冻鱼糜肠室温（25 ℃）解冻，切成质量约为5 g 的圆柱形鱼块 （直径2.5 cm，长约1.5 cm），浸没在配制好的外裹糊中，约10 s 后缓慢取出，待鱼块上的外裹糊不成股滴下时进行二次裹糊。将裹好外裹糊的鱼块放入盛有面包糠的不锈钢盆中，抖动面包糠，使面包糠均匀黏附在鱼块表面制成外裹糊鱼块。将3 L 新鲜大豆油倒入油炸锅，待油温升至170 ℃放入外裹糊鱼块，每次投入量为4 块，初炸40 s 后捞出放在滤网中，使油温升至190 ℃复炸30 s，且油炸过程中不断用筷子翻动鱼块，使其受热均匀。油炸完成后用笊篱捞出鱼块，放入不锈钢滤网中室温（25 ℃）冷却1 h，自然沥去表面多余的油脂。
1.3.2 荧光强度
1）蛋白质溶液的制备 用不锈钢手术刀将外壳剥下，在-80 ℃的超低温冰箱中冷冻4 h，放入冷冻干燥机内冷冻干燥48 h，再用高速粉碎机粉碎。取2.5 g 粉碎的外壳放入100 mL 离心管中，加入25 mL 磷酸盐缓冲液 （0.01 mol/L，pH 7.0），冰水浴条件下均质机以20 000 r/min 匀浆1 min，再在4 ℃，8 000 r/min 离心15 min，取上清液，重复离心至上清液澄清。采用考马斯亮蓝法测定上清液的蛋白质浓度后，通过稀释使得上清液中蛋白质质量浓度达到0.1 mg/mL。
2）测定方法 采用F-4600 型荧光光谱仪测定，参数设置：激发波长280 nm；发射光谱300～450 nm；狭缝宽度2.5 nm；扫描速度240 nm/min；电压700 V。以磷酸盐缓冲液（0.01 mol/L，pH 7.0）为空白对照[18]。
1.3.3 表面疏水性 参照Tang 等[19]的方法并稍作修改，采用ANS 作为荧光探针测定外壳中蛋白质的表面疏水性。按照1.3.2 节步骤（1）的方法制备蛋白质溶液，并用考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度。分别取0.4，1.2，2，2.8，3.6 mL 上清液，加入磷酸盐缓冲溶液混合至4.0 mL，再加入40 μL ANS溶液（8 mmol/L），漩涡振荡混匀后静置5 min，在激发波长390 nm 和发射波长490 nm 下测其荧光强度（FI）。以蛋白质浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，初始段的斜率即为外壳中蛋白质的表面疏水性指数（H0）。
1.3.4 巯基和二硫键 参照Tang 等[19]的方法并稍作修改，采用Ellman's 试剂比色法测定外壳中蛋白质的-SH 和S-S 含量。
1）配制溶液 Tris-Gly 缓冲液：精确称量5.2085 g Tris、3.3781 g Gly、0.5855 g 乙二胺四乙酸（EDTA），用0.1 mol/L HCl 调节pH 值至8.0，加蒸馏水定容至500 mL。
含8 mol/L 尿素的Tris-Gly 溶液：在200 mL Tris-Gly 溶液中加入96.096 g 尿素。
12%三氯乙酸（TCA）溶液：称量12 g 三氯乙酸，加蒸馏水定容至100 mL。
2）蛋白质溶液的制备 按照1.3.2 节步骤（1）的方法制备蛋白质溶液，并用考马斯亮蓝法测定蛋白质质量浓度（C）。
3）巯基含量的测定 在1 mL 蛋白质溶液中加入4 mL Tris-Gly 缓冲液和0.05 mL Ellman's试剂（4 mg/mL，用Tris-Gly 缓冲溶液配制），漩涡振荡混匀后在25 ℃下保温反应10 min，用分光光度计测定波长为412 nm 处的吸光值（A412nm）。根据公式（1）计算游离巯基的含量。
式中，μSH——游离巯基含量（μmol/g）；C——蛋白质溶液质量浓度（mg/mL）；D2——稀释系数。
4）二硫键含量的测定 在1 mL 蛋白质溶液中加入4 mL Tris-Gly 缓冲液和0.05 mL 巯基乙醇，漩涡振荡混匀后在室温（25 ℃）下保温1 h，再加入10 mL 12%的TCA 溶液，漩涡振荡混匀后继续保温1 h，8 000 r/min 离心10 min，弃去上清液，沉淀加5 mL 12%TCA 溶液洗涤，磁力搅拌后再离心，重复2 次除去巯基乙醇。取沉淀物加10 mL Tris-Gly 缓冲液溶解，混合均匀后取4 mL，加0.04 mL Ellman's 试剂，漩涡振荡混匀后在25 ℃下保温反应10 min，用分光光度计测定在412 nm 下吸光度值（A412nm）。按照公式（2）计算总巯基含量，按公式（3）计算二硫键含量。
式中，μ′SH——总巯基含量 （μmol/g）；μSS——二硫键含量（μmol/g）；C——蛋白质溶液质量浓度（mg/mL）；D2——稀释系数。
1.3.5 蛋白质的二级结构 取30 g 左右的外壳，用正己烷脱油。将脱油后的外壳冷冻干燥48 h，再用高速粉碎机粉碎，过100 目筛，备用。取适量外壳粉末与溴化钾（光谱纯）按1∶100 质量比于玛瑙研钵中混合研磨至粉末状，装样并压制成透明薄片，放入傅里叶红外光谱仪，做全波段扫描测定，纯溴化钾为空白对照。参数设置：扫描波数范围4 000～400 cm-1，扫描次数16 次，分辨率4.0 cm-1，主要测量1 700～1 600 cm-1 内酰胺Ⅰ谱带，采用Peakfit 软件对酰胺I 带进行拟合（R2＞0.99）[20]。
1.3.6 小麦淀粉的晶体结构 取30 g 左右的外壳，用正己烷脱油，用研钵研磨后过100 目筛，备用。取适量外壳粉末置于带矩形凹槽的专用玻璃片中，放入Bruker D8 X-射线衍射仪中测定，特征射线选择Cu 靶，参数设置：电压40 kV，电流40 mA，测量角度范围2θ 为3°～60°，步长0.02°，发散和防发散狭缝均为1 mm，接受狭缝0.1 mm，扫描速度为4°/min。每个样品约扫描15 min，利用MDI Jade 6 软件计算淀粉的相对结晶度，见公式（4）[21]。
式中，S0——XRD 衍射图中结晶区面积；S1——XRD 衍射图中无定形区面积。
1.3.7 表面油脂和表面渗透油脂
1）标准曲线的绘制 在大豆油中添加苏丹红B 配制成不同质量浓度（0.4，0.5，0.6，0.7，0.8 g/L）的苏丹红油液，在30 ℃磁力加热搅拌器上加热搅拌24 h，使苏丹红B 完全溶解。用石油醚以体积比将每个浓度的苏丹红油液稀释40 倍，然后用可见分光光度计在波长510 nm 处测其吸光值（A510nm）。以吸光值为横坐标，苏丹红油溶液浓度为纵坐标做标准曲线。
2）表面油脂含量的测定 采用质量浓度为0.4 g/L 苏丹红油液制作油炸外裹糊鱼块，炸制后质量为m0。在250 mL 的干净烧杯中加入100 mL的石油醚，将油炸外裹糊鱼块放入石油醚中浸泡10 s 立即取出，再将石油醚转移到恒重的抽提瓶中（恒重质量：m1），采用脂肪测定仪回收石油醚，然后将抽提瓶放入105 ℃的烘箱中干燥至恒重（m2），表面油脂的质量m=m2-m1。根据公式（5）计算表面油脂含量。
3）表面渗透油脂含量的测定 将已经除去表面油脂的油炸外裹糊鱼块粉碎至直径不超过3 mm 的颗粒，用脂肪测定仪提取油脂，得到除去表面油脂的油炸外裹糊鱼块所含的油脂质量m3。将提取的油脂用石油醚以体积比稀释40 倍（V/V），在波长510 nm 处测吸光值（A510nm）。由标准曲线计算出对应的苏丹红油液的质量浓度C1，根据公式（6）计算表面渗透油脂的含量[22]。
式中，C0——油炸外裹糊鱼块时苏丹红B 油溶液的质量浓度（g/L）。
1.3.8 油脂分布 采用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）定性分析油炸外裹糊鱼块中油脂的分布[23]。首先将1 mg 尼罗红溶解在10 mL 丙酮中，配制成0.01%的丙酮染液。在-20 ℃下，用冷冻切片机从油炸外裹糊鱼块表面切下完整的薄片（1 cm×1 cm×8 μm），固定在显微镜载玻片上，取适量染液滴在试样薄片上，并放入4 ℃冰箱里避光染色3 h。染色结束后立即在试样薄片上滴1 滴抗荧光猝灭剂封片，盖上盖玻片，将载玻片倒放在CLSM 的载物台上观察。参数设置：扫描模式像素800×800，拍照模式像素1 024×1 024；扫描速度为400 Hz；线频为0.14 Hz；尼罗红激发波长543 nm；发射波长638～768 nm，放大倍数10×。
1.4 数据处理
应用Excel、Origin 和SPSS 软件对所有数据进行处理和分析，结果用“平均值±标准差“表示。其中方差分析采用ANOVA，显著性分析采用Duncan 检验，P＞0.05 判定为差异不显著，P＜0.05判定为差异显著。
2 结果与分析
2.1 表面疏水性和荧光强度
天然蛋白质分子结构紧密，疏水氨基酸侧链位于分子内部，H0 的大小取决于疏水性基团暴露程度[24]。荧光强度主要是色氨酸（Trp）残基的荧光发射光谱，反映蛋白质的三级结构变化，即蛋白质之间以及其它成分与蛋白质相互作用的构象变化[25]。蛋白质的荧光发射峰的最大吸收波长（λmax）增大或减小表示最大吸收波长红移或蓝移，红移表明蛋白质结构变得松散，蓝移表明蛋白质结构变得紧凑[26]。外壳中蛋白质的H0 和荧光强度见图1。
图1 外壳中蛋白质的H0 和荧光强度
Fig.1 H0 and tryptophan fluorescence emission spectra of protein in the crust
与对照相比，大豆蛋白组、蛋清蛋白组和乳清蛋白组的H0 较高，而大米蛋白组的H0 较低。大豆蛋白的结合水能力较强，外裹糊鱼块在深度油炸过程中抑制了淀粉的吸水膨胀，使大豆蛋白与小麦面筋蛋白接触几率增加。由于外壳中蛋白质受热变性展开，内部疏水性基团暴露，使得H0 增加[27]。蛋清蛋白、乳清蛋白结合水的能力弱于大豆蛋白，蛋白质之间接触几率减小，蛋白质展开程度较低；大米蛋白结合水的能力最差，蛋白质展开程度最低，H0 最小。小麦淀粉与5 种蛋白质的水分吸附等温线见图2。
图2 小麦淀粉和5 种蛋白质的水分吸附等温线
Fig.2 Moisture adsorption isotherms for wheat starch and five proteins
对照的λmax 为349 nm，大豆蛋白组和蛋清蛋白组的λmax 从349 nm 增至351 nm，发生了红移；乳清蛋白组和大米蛋白组的λmax 从349 nm 减至341 nm，发生了蓝移，说明添加大豆蛋白和蛋清蛋白，使外壳中蛋白质的结构变得松散，而乳清蛋白和大米蛋白使结构紧凑。乳清蛋白组、蛋清蛋白组、大豆蛋白组的荧光强度小于对照，而大米蛋白组的荧光强度大于对照，这是由于大米蛋白结合水的能力最差，降低了蛋白质分子之间接触几率，使得蛋白质分子聚集较少，色氨酸被包埋的程度减小，因此荧光发射增强。
2.2 巯基和二硫键
巯基和二硫键是蛋白质中重要的功能基团，两者含量的变化影响蛋白质分子间的相互作用。巯基和二硫键之间的相互转化及疏水相互作用，可以使蛋白质聚集形成凝胶网状结构[27]。外壳中蛋白质的巯基和二硫键含量见表1。
表1 外壳中蛋白质的巯基和二硫键含量（μmol/g）
Table 1 Free-SH and S-S contents of protein in the crust （μmol/g）
注：每个数值均为3 次重复试验的平均值和标准差。同一列不同
字母表示差异显著（P＜0.05）。
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5 种天然蛋白质的巯基和二硫键含量依次为：大豆蛋白＞乳清蛋白＞小麦面筋蛋白＞蛋清蛋白＞大米蛋白；小麦面筋蛋白＞乳清蛋白＞蛋清蛋白＞大米蛋白＞大豆蛋白。而外壳中蛋白质的巯基和二硫键含量依次为：大米蛋白组＞大豆蛋白组＞对照＞乳清蛋白组＞蛋清蛋白组；乳清蛋白组＞大豆蛋白组＞蛋清蛋白组＞大米蛋白组＞对照。天然大豆蛋白的巯基含量最高，二硫键含量最低，而外壳中蛋白质的巯基含量增加幅度较小，二硫键含量增加幅度较大；与大豆蛋白相比，天然蛋清蛋白的巯基含量较低，二硫键含量较高，而蛋清蛋白组外壳中二硫键含量低于大豆蛋白组，说明外裹糊鱼块在油炸过程中，添加蛋白质与小麦面筋蛋白相互交联，促进了蛋白质中的巯基向二硫键转化，且添加蛋白质的结合水的能力越强，巯基向二硫键转化程度越高。这与表面疏水性和荧光强度的结果一致。在4 种添加蛋白质中，天然乳清蛋白和外壳中蛋白质的二硫键含量均最高，说明添加蛋白质自身的凝胶性能也影响了外壳中蛋白质的凝胶强度。大米蛋白组外壳中蛋白质的巯基含量高于对照，且二硫键含量增加幅度较小，说明大米蛋白与小麦淀粉、小麦面筋蛋白相互作用对巯基和二硫键的影响小于大米蛋白自身。
2.3 蛋白质的二级结构
傅里叶红外光谱普遍用于分析蛋白质的二级结构。由于酰胺Ⅰ（1 700～1 600 cm-1）带有强烈的吸收，因此酰胺Ⅰ带常被用来分析蛋白质的二级结构。在酰胺I 带中，1 615～1 637 cm-1、1 700～1 682 cm-1 范围内为β-折叠，1 637～1 645 cm-1 范围内为无规卷曲，1 646～1 664 cm-1 范围内为α-螺旋，1 664～1 681 cm-1 范围内为β-转角[28]。α-螺旋和β-折叠比β-转角和无规卷曲的排列更有序，因此可以用α-螺旋和β-折叠的相对含量来判断蛋白质的稳定性[29]。外壳中蛋白质的二级结构的相对含量见表2。
表2 外壳中蛋白质的二级结构的相对含量
Table 2 The relative content of secondary structure of protein in the crust
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与对照相比，添加蛋白质的外壳中蛋白质的β-折叠的相对含量明显降低，β-转角的相对含量明显增加，α-螺旋和无规卷曲的相对含量轻微降低，其中大米蛋白组的β-折叠的相对含量和乳清蛋白组的α-螺旋的相对含量高于对照。这可能是添加蛋白质后，蛋白质结合一部分水分，抑制了淀粉的吸水膨胀，增加了蛋白质与小麦面筋蛋白的相互交联，促使蛋白质发生热聚集反应，蛋白质的二级结构之间相互转化。孙佳悦等[30]研究发现，热处理使乳清蛋白变性、展开并发生相互作用，α-螺旋的相对含量降低，β-转角的相对含量升高，促进了乳清蛋白热聚集体的形成，且β-转角在热聚集体的形成过程中具有重要作用。Bock 等[31]研究麦麸对模式谷蛋白面团中水分状态和谷蛋白构象的影响时，发现添加麦麸引起了谷蛋白面团中结合水和单分子层水数量的变化，面团中水的重新分布使谷蛋白的二级结构由β-转角转变成β-折叠和无规卷曲，破坏了谷蛋白的凝胶网状结构，导致添加麦麸的面包品质劣化。
在5 种蛋白质中，大豆蛋白的β-折叠相对含量最高，其次是小麦面筋蛋白、大米蛋白和乳清蛋白，蛋清蛋白的β-折叠相对含量最低（轻微低于乳清蛋白）；而蛋清蛋白的β-转角相对含量最高，其次是小麦面筋蛋白、大豆蛋白和乳清蛋白，大米蛋白的β-转角相对含量最低 （轻微低于乳清蛋白）。添加蛋白质后，大豆蛋白组、蛋清蛋白组和乳清蛋白组的β-折叠的相对含量均低于对照，而β-转角含量高于对照；而大米蛋白组的β-折叠的相对含量高于对照，且β-转角含量明显增加，进一步说明添加蛋白质的结合水能力和自身凝胶性能影响了外壳中蛋白质的凝胶强度，且添加蛋白质的结合水的能力越弱，稳定结构向不稳定结构转化越多，生成的凝胶结构越不稳定。
2.4 小麦淀粉晶体结构
外壳中小麦淀粉的X-射线衍射图谱见图3。小麦淀粉的X-射线衍射图谱中2θ 为15.22°，17.02°，18.06°，23.05°处有较强衍射峰，且在17.02°和18.06°处的衍射峰为相连双峰，呈现典型的A 型晶体结构特征，与Lopez-rubio 等[32]的结果一致。5 组外壳的X-射线衍射图谱中，小麦淀粉原有的部分衍射峰消失，在2θ 为7°，13°，20°附近出现了新的衍射峰，呈现V 型晶体结构的特征，与Garcia 等[33]的结果一致。这是因为小麦原淀粉经高温油炸后糊化，A 型晶体的天然双螺旋结构部分支链淀粉发生降解形成部分直链淀粉，直链淀粉相对浓度增加，易与煎炸油中脂肪酸的疏水性碳链发生疏水相互作用，使A 型晶体更多的转变为V 型晶体的淀粉-脂质络合物，相对结晶度降低[34]。
图3 外壳的X-射线衍射图谱
Fig.3 X-ray diffractogram of the crust
注：a～f 分别代表对照、大豆蛋白组、蛋清蛋白组、乳清蛋白组、大米蛋白组和小麦淀粉。
5 组外壳中小麦淀粉的相对结晶度分别为45.22%（对照）、34.56%（大豆蛋白）、36.08%（蛋清蛋白）、37.08%（乳清蛋白）和40.66%（大米蛋白）。添加蛋白质的外壳中淀粉-脂质络合物的相对结晶度均小于对照，且大豆蛋白组的相对结晶度最小。在2θ 为15°和17°附近，对照和大米蛋白组仍然保留有A 型晶体结构的特征峰，且衍射峰强度明显减弱。这可能由于大米蛋白组中蛋白质的热变性展开程度较轻，表面疏水性基团和巯基暴露较少，外壳中蛋白质形成的凝胶的强度较低，且大米蛋白结合水的能力较弱，外裹糊鱼块深度油炸过程中水分迅速蒸发，部分淀粉未能充分糊化[1-2]。大豆蛋白组的3 个衍射峰7.63°，13.03°，20.18°；蛋清蛋白组的2 个衍射峰7.66°与20.05°和乳清蛋白组的一个衍射峰20.08°均是V 型晶体结构特征峰，说明添加这3 种蛋白质后，外壳中小麦淀粉的晶体结构从A 型晶体完全转变为V 型晶体。大豆蛋白组的淀粉-脂质络合物的相对结晶度最低，可能是外裹糊鱼块经油炸，大豆蛋白充分变性展开，支链淀粉的双螺旋结构解螺旋，与蛋白质相互作用形成较多的淀粉-蛋白质复合物，且淀粉糊化后较均匀地填充在蛋白质网状结构中形成致密的淀粉蛋白质凝胶，阻碍了油脂渗入（油脂渗透与分布分析验证了该假设）。
2.5 表面油脂和表面渗透油脂
表面油脂是油炸后的外裹糊鱼块在冷却过程中吸附在鱼块表面的油脂；表面渗透油脂是在冷却过程中由于温度降低引起外壳表面孔洞的内外压差，使部分表面油脂渗入外壳内部的油脂[35]。油炸外裹糊鱼块的表面油脂和表面渗透油脂含量见表3。
表3 油炸外裹糊鱼块的表面油脂和表面渗透油脂含量（%，湿基）
Table 3 Surface oil and penetrated surface oil contents of fried BBFNs （%，wet basis）
注：每个数值都是3 次重复试验的平均值和标准差。同一列不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
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表面油脂和表面渗透油脂的含量依次为：大米蛋白组＞大豆蛋白组＞蛋清蛋白组＞乳清蛋白组＞对照，对照＞大米蛋白组＞乳清蛋白组＞蛋清蛋白组＞大豆蛋白组，说明添加的4 种蛋白质均抑制了外裹糊鱼块在油炸过程中的油脂渗透。大豆蛋白结合水的能力较强、自身凝胶性能较好。同时，大豆蛋白组外壳中蛋白质的H0 和二硫键含量较高，形成淀粉蛋白质复合凝胶致密，外壳表面孔隙细小且外壳结构完整，有效抑制了油脂的渗透（CSLM 分析验证了该假设）。蛋清蛋白和乳清蛋白结合水的能力弱于大豆蛋白，H0 较低，外裹糊中形成的淀粉蛋白凝胶层致密性和强度弱于大豆蛋白，导致较多的表面油脂渗透到外壳中。大米蛋白结合水能力最差，且自身凝胶性能弱，大米蛋白组的H0 和二硫键含量最低，蛋白质二级结构向更稳定构象转化最少，形成的凝胶网状结构疏松，水分蒸发较多使外壳上形成的孔隙较大，外裹糊鱼块在油炸过程中表面黏附较多的油脂，且在冷却时由于负压作用渗入鱼块，导致在4 种添加蛋白质组中表面渗透油脂和表面油脂的含量最高。
2.6 油脂分布
油炸外裹糊鱼块外壳的油脂分布见图4。对照外壳的孔隙和裂纹最多，且裂纹最宽，红色荧光强度最强，最多的油脂分布在裂纹和孔隙中。大豆蛋白组的外壳结构最致密，孔隙最少，裂痕最浅，红色荧光强度最弱，油脂分布最少。蛋清蛋白组外壳的孔隙细小且较多，裂纹较少，油脂分布在孔隙的周围，红色荧光强度较弱，油脂分布较少。乳清蛋白组外壳孔隙较小且少，裂纹较多，大部分油脂分布在裂纹中。大米蛋白组外壳孔隙大小不均，裂纹多且深，大量油脂大量分布在裂纹中，荧光强度较强。这与油炸外裹糊鱼块的表面油脂和表面渗透油脂含量分析的结果一致，进一步证明了添加4 种蛋白质使外裹糊在油炸过程中形成不同强度的凝胶保护层，阻碍了水分的蒸发，抑制了油脂的渗透，从而降低了油炸外裹糊鱼块的油脂含量。
图4 油炸外裹糊鱼块外壳的激光共聚焦图
Fig.4 Images of confocal laser scanning microscopy of fried BBFNs
注：A～E 分别代表对照、大豆蛋白组、蛋清蛋白组、乳清蛋白组和大米蛋白组。图中下标1 表示在显微镜下观察到的结构图；下标2 表示在荧光模式下扫描的油脂分布图；下标3 表示油脂分布的直观表象图；放大倍数为10×。参数相同时，2 中红色荧光强度越大说明外壳油脂含量越高。
3 结论
添加蛋白质的结合水能力和自身的凝胶性能显著影响了油炸外裹糊鱼块外壳中蛋白质的表面疏水性、巯基和二硫键含量、荧光强度和二级结构，以及小麦淀粉的晶体结构，最终影响了外裹糊鱼块深度油炸过程中油脂的渗透。添加蛋白质的结合水能力和自身凝胶性能较强，蛋白质的热变性展开程度较大，表面疏水性基团和巯基暴露较多，促使蛋白质之间、蛋白质与淀粉之间相互作用增强，形成较致密的淀粉蛋白质复合凝胶，较好的抑制了外裹糊鱼块油炸过程中的油脂渗透。该试验可为低脂油炸外裹糊鱼制品的规模化生产提供理论依据。
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