多糖 （Polysaccharide） 是由大量通过糖苷键（α-或β-） 脱水聚合相互连接而成的单糖残基组成的一种生物大分子物质[1]。自然界中，几乎所有活的生物体中都含有多糖。人们习惯上把从生物体中提取的并通过研究证明具有一定生理活性的多糖称为生物活性多糖 （Bioactive polysaccharides）。近年来，由于人们日常生活水平的提高和对身体健康知识的逐步了解，生物活性多糖因本身的低毒性、广泛性和高效性等特点而被作为营养补充剂被大量的研究。多糖的生物活性主要包括增强免疫调节[2-3]、抗氧化[4-5]、抗病毒[6-7]、抗肿瘤[8-9]、降血糖[10]、降血脂[11]、抗凝血[12]等。
壶瓶碎米荠（Cardamine hupingshanensis），十字花科碎米荠属，别名雀儿菜、白带草，1年到2年生草本植物，常见于海拔1 km 以下的低地草丛中，在全中国分布广泛[13]。壶瓶碎米荠具有较强富硒能力。现有研究中，对碎米荠属的基因组学研究主要有：①基因组学研究，如：Bleeker 等[14]对德国的碎米荠种属的DNA 序列进行研究，得出结论：此种碎米荠是来自于亚洲的物种；②蛋白质组学研究，如：Both 等[15]通过检测壶瓶碎米荠中的无机硒、有机硒，得出壶瓶碎米荠生物体内无机硒占20%，有机硒以硒代半胱氨酸和硒代甲硫氨酸的形式存在；③硒耐受能力测试[16-17]，Zhou 等[2]从壶瓶碎米荠中组装48 989 个单基因，分别在根和叶中表达39 579 个和33 510 个。通过差异表达分析鉴定出位于4 个不同路径中的25 个基因，这些路径对壶瓶碎米荠中的亚硒酸盐有显著响应；④品种改良[18]等方面研究。
本试验中采用超声波与酶辅助提取壶瓶碎米荠多糖，采用Sevag 法除蛋白，通过DEAE-52 纤维素分级醇沉，采用Sephadex G-100 和紫外光谱法进行纯度鉴定，并研究其体外抗氧化活性。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
壶瓶碎米荠，采自湖北省恩施市新塘乡渔塘坝。自然风干后粉碎过100 目筛，贮存于试剂瓶中保存备用。
纤维素酶、标准葡萄糖、DEAE-52 纤维素、Sephadex G-100 葡聚糖、乙醇、苯酚、硫酸、三氯甲烷、正丁醇均为分析纯级。
1.2 仪器与设备
Nicolet iS5 红外分析仪，赛默飞世尔公司；KQ5200 型超声波仪，北京中仪汇丰科技有限公司；BS-100A 自动部分收集器、HL-2 恒流泵，北京佳航博创科技有限公司；BC-W203 旋转蒸发仪，上海耀特仪器设备有限公司；真空冷冻干燥箱，上海启前电子科技有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 提取 称取1.0 g 壶瓶碎米荠粉末，适当条件下经超声波、酶处理后进行热水提取，收集滤液后，4 000 r/min 离心15 min，旋转蒸发，加入95%乙醇4 ℃醇沉至少10 h，4 000 r/min 离心10 min，冷冻干燥得到壶瓶碎米荠粗多糖。
1.3.2 单因素实验设计 液料比：15∶1，20∶1，25∶1，30∶1，35∶1；纤维素酶添加量：0%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%；超声波时间：10，15，20，25，30 min；提取时间：30，60，90，120，150 min；提取温 度：60，70，80，90，100 ℃。
1.3.3 响应面试验设计 根据单因素实验结果，选择料液比、纤维素酶添加量、超声波时间、提取时间、提取温度为考察因素，以碎米荠多糖得率为考察目标，利用Design-Expert.V8.0.6 软件进行5 因素3 水平的响应面试验设计，因素水平表见表1。
表1 响应面试验因素水平表
Table 1 Level table of experimental factors for response surface
水平 A（料液比/g·mL-1） B（超声时间/min） C（纤维素酶添加量/%） D（提取温度/℃） E（提取时间/min）-1 1∶20 15 1.0 70 60 0 1∶25 20 1.5 80 90 1 1∶30 25 2.0 90 120
1.3.4 多糖含量的测定 多糖含量测定均使用苯酚-硫酸法[19]。以葡萄糖为标准品，葡萄糖浓度为横坐标（x），吸光度为纵坐标（y），测得标准曲线为y=0.0089x-0.0003，R2=0.9961。
1.3.5 除蛋白
1.3.5.1 蛋白质含量测定 以牛血清白蛋白为标准品，牛血清白蛋白浓度为横坐标（x），吸光度为纵坐标（y），测得标准曲线为y=0.006x+0.0085，R2=0.9979。
1.3.5.2 方法 Sevag 法：将正丁醇与三氯甲烷按照1∶4 的体积比配制Sevag 试剂，将壶瓶碎米荠粗多糖溶液与sevag 试剂以4∶1 的体积比混合后，封口，置于摇床上剧烈振荡30 min 后，转置于分液漏斗中静置30 min。收集上层液，待用。
1.3.6 分级 将DEAE-52 纤维素层析柱用去离子水平衡，将样品溶液上样至层析柱中，以0，0.1，0.2，0.4，0.7 mol/L 的NaCl 溶液进行洗脱，流速为1 mL/min，每管收集10 mL，多糖浓度由苯酚-硫酸法在波长490 nm 处测定，以管数为横坐标（x），吸光度为纵坐标（y）绘制曲线。
1.3.7 纯度鉴定 将Sephadex G-100 层析柱用去离子水平衡，将样品溶液上样至层析柱中，用蒸馏水洗脱，流速为0.1 mL/min，每管收集2 mL，多糖浓度由苯酚-硫酸法在波长490 nm 处测定，以管数为横坐标（x），吸光度为纵坐标（y）绘制曲线。
1.3.8 体外抗氧化能力测定
1.3.8.1 ABTS 自由基清除能力测定 参考文献[20]的方法，并对试验步骤稍作修改。配制0.007 mol/L 的ABTS 溶液和0.14 mol/L 的过硫酸钾溶液，按1∶1（体积比）混合后在25 ℃下避光反应12 h，为ABTS 自由基储备液。使用PBS（pH 7.4）将储备液在波长734 nm 处的吸光值调整为0.70±0.02，备用。取不同浓度的壶瓶碎米荠粗多糖溶液1 mL（空白组取等量的纯水），加3 mL 调整吸光值后的储备液，于暗处反应1 h，在波长734 nm 处测定其吸光度，VC 作为阳性对照，每组重复3 次。
1.3.8.2 羟基自由基清除能力测定 参考文献[21]的方法，并对试验步骤稍作修改。量取不同浓度的壶瓶碎米荠粗多糖溶液1 mL 于具塞试管中（空白组取等量的纯水），加入2 mL 3 mmol/L 硫酸亚铁溶液和1.5 mL 1.8 mmol/L 水杨酸-乙醇溶液，再加入0.1 mL 0.03%H2O2 溶液启动反应，在37 ℃下水浴30 min 后，在波长510 nm 处测定吸光值，VC作为阳性对照，每组重复3 次。
1.3.8.3 总还原能力测定 参考文献[22]的方法，并对试验步骤稍作修改。量取不同浓度的壶瓶碎米荠粗多糖溶液1 mL 于具塞试管中（空白组取等量的纯水），加入1.0 mL 1.0 mol/L pH 6.6 PBS 和2.5 mL 1%K3[Fe（CN）6]溶液，50 ℃下水浴20 min，冷却后向其中加入2.0 mL 10%TCA 溶液，5 000 r/min 离心5 min 后，取2.5 mL 上层清液，再加入2.5 mL 超纯水和0.5 mL 1%FeCl3 溶液，混匀后在波长700 nm 处测定吸光值，VC 作为阳性对照，每组重复3 次。
1.4 统计分析
所有试验重复3 次，统计结果均为平均值。响应面试验利用Design-Expert.V8.0.6 软件进行分析，细胞学试验利用SPSS 24 软件进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 单因素实验结果
2.1.1 液料比对壶瓶碎米荠多糖得率的影响 在植物多糖提取过程中，原料与溶剂的比例是十分关键的参数，本试验探究了不同液料比对碎米荠多糖得率的影响，所得结果如图1a 所示。结果表明，当提取溶剂用量达到300 mL，原料为10 g 时，碎米荠多糖的得率达到最大值，若继续增加溶剂用量，壶瓶碎米荠多糖的得率反而呈缓慢下降的趋势。分析其原因可能是当液料比达到30∶1 时，糖类物质已基本溶出，再增加溶剂的用量，使多糖的损失率提高，因此，确定液料比为30∶1 比较合适。
图1 单因素实验结果
Fig.1 Single factor experiment results
2.1.2 纤维素酶添加量对壶瓶碎米荠多糖得率的影响 植物体内含有大量的纤维素，利用适量的纤维素酶对植物原料进行处理，能提高多糖的得率。本试验探究了纤维素酶添加量对碎米荠多糖得率的影响规律，结果如图1b 所示。结果表明，添加纤维素酶能明显提高多糖得率，而且随着添加量的增加，多糖得率也在增加，在2.5%时最大。
2.1.3 提取时间对壶瓶碎米荠多糖得率影响 提取时间作为提取多糖的另一个重要的影响因素，本试验对不同提取时间下壶瓶碎米荠多糖的得率进行探究，结果如图1c 所示。结果表明，随着提取时间的延长，多糖得率在逐渐上升，然而多糖的绝对增长量不高，在考虑到节约时间成本的情况下，选择120 min 比较合适。
2.1.4 提取温度对壶瓶碎米荠多糖得率影响 提取温度是对多糖得率的一个重要的影响因素，本试验探究不同提取温度对壶瓶碎米荠多糖得率的影响，结果如图1d 所示。结果表明，随着温度的升高，多糖得率在逐渐上升，在80～90 ℃之间，多糖量有一个大的提升，故选择90 ℃比较合适。
2.1.5 超声波时间对壶瓶碎米荠多糖得率的影响 超声波通过对细胞膜通透性的改变和破坏，能刺激细胞将细胞液内物质释放，因此能够有利于植物细胞中生物活性物质的提取，本试验探究了不同超声时间对碎米荠多糖得率的影响规律，结果如图1e 所示。结果表明，随着超声时间的逐渐延长，碎米荠多糖的得率呈先上升后下降的趋势，在超声时间到20 min 时达到最大值，此时继续增加超声时间，碎米荠多糖得率呈下降趋势。分析其原因可能是超声时间过长，溶液温度也变高，导致多糖类物质稳定性下降，部分被氧化，得率降低。因此，超声时间选择20 min 为宜。
2.2 响应面试验结果与分析
2.2.1 响应面分析 根据Design-Expert 软件中的Box-Behnken 进行响应面设计，料液比、纤维素酶添加量、超声时间、提取温度、提取时间为响应面因变量，碎米荠粗多糖为响应值，进行响应面试验。所得试验结果见表2。
表2 响应面试验设计与结果
Table 2 Design and results of response surface experiment
编号 多糖得率/mg·g-1 编号 多糖得率/mg·g-1 编号 多糖得率/mg·g-1 1 50.3464 16 43.8314 31 33.4636 2 49.8754 17 58.4354 32 52.9184 3 60.0034 18 44.4723 33 47.8176 4 50.2541 19 35.4177 34 52.9184 5 50.516 20 57.1239 35 52.9184 6 50.7993 21 42.1229 36 48.2484 7 48.7676 22 52.3375 37 60.7147 8 48.4392 23 55.7105 38 52.9184 9 50.9753 24 38.1466 39 52.9184 10 45.0026 25 46.4723 40 39.0854 11 55.7743 26 38.6097 41 48.2152 12 50.3483 27 49.2184 42 50.8556 13 58.7019 28 45.0859 43 62.1197 14 38.331 29 58.9025 15 45.9508 30 45.0019
2.2.2 回归模型的方差分析 如表2所示，BBD设计试验进行了46 次，以优化5 个单独的提取参数。结果表明，在以下试验条件下能取得最大收益：料液比1∶30，超声时间24.80 min，纤维素酶添加量2%，提取温度90 ℃，提取时间120 min，多糖提取量为44.54 mg/g。通过对试验数据进行多元回归分析，响应值与变量之间以下列二阶多项式方程式关联：
Y=5.44+0.25A-0.12B-0.21C-0.024D-0.31E-0.048AB+0.047AC-0.012AD+0.20AE+0.11BC-0.076BD-0.0021BE-0.16CD-0.37CE+0.30DE-0.49A2-0.34B2-0.42C2-0.37D2-0.23E2
式中，Y——多糖的质量（mg）；A，B，C，D，E——液料比、超声波时间、纤维素酶酶量、提取温度、提取时间。
把响应面分析所得数学模型进行方差分析，以检验方程的有效性，回归模型的方差分析如表3所示。通常模型中有较高的F 值和较低的P 值会使模型更加的显著，在本试验中二次回归模型的F=5.013，P＜0.01，表明模型极显著；失拟项是所得数学模型中的数据变异，本试验中失拟项F=0.4739，P＞0.05，表示模型无失拟项的存在，已然能充分说明实际情况，回归模型是合适的。
表3 回归模型的方差分析
Table 3 Variance analysis of regression model
注：A.料液比，B.超声时间，C.纤维素酶添加量，D.提取温度，E.提取时间。*.P＜0.05 具有显著性；**.P＜0.01 具有极显著差异。
来源 偏差平方和 自由度 均方 F 值 P-值P＞F模型 1 613.626 20 80.68128 5.01299 0.0001**A 66.08145 1 66.08145 4.105855 0.0535 B 120.4676 1 120.4676 7.485045 0.0113*C 198.6 1 198.6 12.33966 0.0017**D 137.2459 1 137.2459 8.527534 0.0073**E 74.41003 1 74.41003 4.623337 0.0414*AB 35.58123 1 35.58123 2.210777 0.1496 AC 6.588206 1 6.588206 0.409347 0.5281 AD 162.8686 1 162.8686 10.11956 0.0039**AE 110.0034 1 110.0034 6.834867 0.0149*BC 29.69651 1 29.69651 1.84514 0.1865 BD 144.2713 1 144.2713 8.964046 0.0061**BE 11.20776 1 11.20776 0.696375 0.4119 CD 20.85201 1 20.85201 1.295603 0.2658 CE 112.7037 1 112.7037 7.002647 0.0139*DE 168.2209 1 168.2209 10.45211 0.0034**A2 135.1366 1 135.1366 8.396477 0.0077 B2 0.729909 1 0.729909 0.045352 0.8331 C2 76.33609 1 76.33609 4.743009 0.0391 D2 79.17716 1 79.17716 4.919534 0.0359 E2 12.29054 1 12.29054 0.763651 0.3905残差 402.3611 25 16.09444失拟项 331.327 20 16.56635 1.166085 0.4739（不显著）纯误差 71.03409 5 14.20682总和 2 015.987 45
为了更直观的预测自变量与响应值的关系，使用Design-Expert 绘制出如图2所示的3D 响应图和轮廓图，这些图能明显的看出各个变量之间两两存在的联系。由图可知，两两因素交互在可选范围内均有最大值。从图2中AB 交互项3D 轮廓图中分析可知，在其它因素都恒定时，随着超声波时间的延长，提取壶瓶碎米荠多糖量先增加后下降，液料比同之，说明在这两个因素的交互作用下，多糖提取有最大值，同时等高线图形为椭圆形，曲面陡峭，说明这两个因素交互时有显著影响。同理可分析其它因素之间的显著性。
图2 各因素交互作用响应面与等高线图
Fig.2 Response surface and contour map of the interaction of various factors
使用此模型方程对各因素选择最佳条件：液料比30∶1，超声时间24.80 min，纤维素酶添加量2%，提取温度90 ℃，提取时间120 min，多糖提取量为44.54 mg/g。为了验证预测结果不偏离试验值且能正常实施，将最佳条件修改为：液料比30∶1，超声时间25 min，纤维素酶添加量2%，提取温度90 ℃，提取时间120 min，并进行验证试验。测得实际值为48.53 mg/g，与预期并无显著性差异，说明此设计可用于超声波酶法提取壶瓶碎米荠粗多糖的预测和分析。
2.3 除蛋白结果
通过重复使用Svage 法对壶瓶碎米荠多糖溶液进行除蛋白，在每次步骤完成后对溶液的蛋白质含量以及多糖含量进行测定，根据标准曲线计算，得到如图3所示的蛋白去除率和多糖保留率图。从图中可知，随着使用Svage 法次数的增加，蛋白质含量明显降低，然而多糖的损耗也随之增多，到第8 次时蛋白质的去除率趋于平缓，而多糖的损耗量却没变化，故选择使用Svage 法除蛋白7次。
图3 蛋白去除率和多糖保留率
Fig.3 Protein removal rate and polysaccharide retention rate
2.4 碎米荠多糖纯化工艺
由图4可知，在第30～37 管处出现了第1 个峰，第48～58 管处出现了第2 个峰，第70～79 管处出现了第3 个峰，第96～102 管处出现了第4 个峰，且这4 处峰都比较对称，证明利用NaCl 溶液浓度梯度洗脱能将壶瓶碎米荠多糖较好的分离，将4 种组分分别命名为CHP-1、CHP-2、CHP-3、CHP-4。
图4 DEAE-52 纤维素层析柱试验结果
Fig.4 Experimental results of DEAE-52 cellulose column
2.5 纯度鉴定结果
由图5可得，4 种组分经Sephadex G-100 层析柱洗脱后呈现单一且对称的峰，说明纯化过后的各组分壶瓶碎米荠多糖相对分子质量较均匀且纯度较高。
图5 Sephadex G-100 层析柱洗脱曲线
Fig.5 Experimental results of Sephadex G-100 column
2.6 抗氧化试验结果
2.6.1 ABTS 自由基清除能力测定 ABTS 自由基清除能力通常作为抗氧化物质的总抗氧化能力测定的指标。不同质量浓度的壶瓶碎米荠粗多糖对ABTS 自由基清除率如图6a 所示。结果显示，壶瓶碎米荠粗多糖的质量浓度与ABTS 自由基清除率呈正相关，随着壶瓶碎米荠粗多糖质量浓度的升高，对ABTS 自由基的清除率也随之升高；在相同质量浓度下，壶瓶碎米荠粗多糖的清除能力远小于VC。
2.6.2 羟基自由基清除能力测定 羟基自由基在所有自由基中具有最强的氧化能力，人体内产生大量的羟基自由基，会对机体中的生物大分子（蛋白质、脂质、核酸）造成严重的破坏，严重会导致细胞产生癌变[23]。不同质量浓度的壶瓶碎米荠粗多糖对氧基自由基的清除率如图6b 所示。结果显示，壶瓶碎米荠粗多糖的质量浓度与羟基自由基的清除率呈正相关，并且随着浓度的升高，清除能力也越来越强；而对羟基自由基的清除能力还是远小于同质量浓度的VC。
2.6.3 总还原能力测定 通过不同质量浓度的壶瓶碎米荠粗多糖对总还原力的测定，结果如图6c所示。结果显示，壶瓶碎米荠粗多糖的质量浓度与总还原力呈正相关，并且随着质量浓度的升高，还原能力也越强；而还原能力还是远小于同质量浓度的VC。
图6 抗氧化活性试验结果
Fig.6 Antioxidant capacity test results
3 结论
通过单因素实验及响应面试验结果，得到壶瓶碎米荠最佳的提取工艺：液料比30∶1，超声时间25 min，纤维素酶添加量2%，提取温度90 ℃，提取时间120 min，并进行验证试验，测得实际值为48.53 mg/g，与预期并无显著性差异。通过对Svage 法除蛋白次数的简单探究，得到使用Svage法7 次能使蛋白的去除率达到最大的同时多糖损失率最小。通过DEAE-52 纤维素柱层析柱对多糖溶液浓度梯度洗脱，可得到4 种组分多糖（CHP-1、CHP-2、CHP-3、CHP-4），并通过Sephadex G-100 层析柱验证其纯度，壶瓶碎米荠粗多糖具有较好的体外抗氧化活性。
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