细叶百合(L.pumilum DC),又称山丹百合,为百合科百合属多年生草本植物,生于山坡草地或林缘处,在我国拥有丰富的野生资源,主要分布在宁夏、甘肃、青海、陕西等地[1-2]。其鳞茎中不仅含有丰富的淀粉、蛋白质、脂肪和膳食纤维,亦富含多糖、皂苷、生物碱及多酚类物质等活性成分,具有良好的食用和药用价值[3-6]。
国内外对百合活性物质的研究主要涉及兰州百合(L.davidii var.)、卷丹百合(L.lancifolium)和龙牙百合(L.brownii var.)、岷江百合(L.regale)、渥丹(L.concolor)等种类[7-10],研究重点主要集中在活性物质的含量或不同种类百合之间含量的差异评价上,而针对百合活性物质与生态因子的关系尚未见研究报道。目前仅有雷卢恒等[11]研究表明,15 个不同卷丹居群鳞茎多酚物质含量与海拔、年均气温、光照等因素存在显著正相关或负相关作用。本研究以宁夏野生细叶百合鳞茎为材料,测定8 个生长区域细叶百合鳞茎中的活性物质含量,以及生长区域的土壤养分含量。收集该分布区的气象资料,比较分析不同分布区细叶百合鳞茎中活性物质含量的差异,筛选宁夏野生细叶百合优质种质资源,阐明细叶百合鳞茎中活性物质含量与生态因子的关系,以及影响宁夏细叶百合活性成分积累的主要生态因子,为细叶百合的优质栽培提供理论依据。
根据细叶百合在宁夏地区的自然分布情况设置样地,选取8 个自然分布区作为样地,主要设在南部六盘山地区(泾源县、西吉县)、中部干旱带的罗山地区(红寺堡区)和北部的贺兰山地区(镇北堡县),地理位置为纬度35~39°N,经度105~107°E,海拔1 426~2 434 m。
于2017年7-8月,细叶百合成熟期采集百合鳞茎和土壤样品。在每个样地采集5~8 个野生细叶百合鳞茎,真空冷冻干燥处理24 h,粉碎过100目筛,密封保存备用;在每个样地沿着东、南、西、北、中5 个方位(水平距离相距5 m 以上),采集5份0~40 cm 土壤样品,然后充分混合,做3 个重复。自然风干,除去土壤样品中的树根和石块,研磨过20 目筛,置于棕色瓶中保存。
1.3.1 仪器与设备 UV-4803 型紫外可见光分光光度计,上海尤尼柯仪器有限公司;5424 型艾本德台式高速离心机,南京贝登电子商务有限公司;KQ-500DE 型数控超声清洗器,昆山市超声仪器有限公司;SENCO-R 旋转蒸发仪,上海申生生化仪器厂;HHS-21-8 型电热恒温水浴锅,上海博迅实业有限公司医疗设备厂;Rapid CS Cube 型碳硫分析仪,北京嘉德元素科技有限公司;BUCHIK360 型全自动凯氏定氮仪法,上海沃珑仪器有限公司。
1.3.2 细叶百合鳞茎提取液制备 称取一定量的百合鳞茎干粉,采用超声波进行提取,以无水甲醇为提取溶剂,在料液比1∶15(g/mL),超声功率60 Hz,pH 5,温度50 ℃条件下,超声提取40 min,连续提取2 次,将提取液在10 000 r/min 条件下离心5 min,合并上清液,45 ℃旋转蒸发至干,用提取溶剂定容至30 mL。置于-20 ℃冰箱保存,用于活性物质含量的测定。
1.3.3 细叶百合鳞茎中活性物含量的测定 多糖含量的测定采用硫酸-苯酚法[12],结果以每克百合鳞茎干粉中含有的葡萄糖质量(mg)表示;总酚含量的测定采用福林-肖卡法[13],结果以每克干粉中含有的没食子酸质量(mg)表示;皂苷含量的测定采用香草醛——冰醋酸显色法[14],结果以每克百合干粉中含有的薯蓣皂苷质量(mg)表示;生物碱含量的测定采用溴甲酚绿显色法[15],结果以每克百合干粉中含有的秋水仙碱质量(mg)表示。
1.3.4 土壤样品分析测定 土壤总有机碳含量的测定采用TOC 仪法;土壤全氮含量的测定采用全自动凯氏定氮仪法;土壤全磷含量的测定采用紫外分光光度比色法[16-18]。
根据每个采样点的地理坐标,利用中国气象科学网站,收集了1987—2017年30年的气象资料,主要包括年均温度、年平均最低温、年平均最高温、水蒸气压、年均降雨量、风速和太阳总辐射(见表1)。
表1 不同取样地气象数据
Table 1 Meteorological data from different sampling sites
注:编号1~8 表示不同采样地,按顺序依次为:镇北堡县滚钟口大寺沟、镇北堡县滚钟口娘娘庙、红寺堡区罗山绿化台沟、红寺堡区罗山石窑洞沟、红寺堡区罗山乱柴沟、西吉县火石寨、泾源县新民乡南庄村、泾源县新民乡西贤村,下同。
采样地 纬度/° 经度/° 海拔/m年均降雨/mm风速/m·s-1 1 38.61 105.94 1 426 225 8.98 18.80-6.90 197 703 6.40 33.00 2 38.61 105.93 1 510 230 8.55 18.47-7.03 197 250 6.27 33.50 3 37.28 106.27 2 070 317 7.34 16.80-6.63 189 903 7.70 32.50 4 37.28 106.28 2 434 334 6.13 15.67-7.30 188 755 7.32 34.40 5 37.27 106.28 2 313 332 6.74 16.23-6.93 188 600 7.50 33.40 6 36.11 105.75 2 119 407 5.69 14.10-6.43 180 550 8.76 28.60 7 35.33 106.41 2 053 561 7.09 15.13-5.07 174 590 9.99 27.20 8 35.33 106.41 2 061 561 7.09 15.13-5.07 174 590 9.99 27.20年均温度/℃年均最高温/℃年均最低温/℃太阳总辐射/kJ·m-2·d-1水蒸气压/kPa
所有试验均重复3 次,结果以“平均值±标准差” 表示,数据处理用Excel 2019 软件,运用Canoco 5.0 软件中的冗余分析(Redundancy analysis,RDA)方法,分析细叶百合鳞茎活性物质含量与生态因子之间的相互关系,显著度水平设为0.05。
细叶百合鳞茎中活性物质含量在不同地区间存在显著差异。如表2所示,不同采集地细叶百合鳞茎多酚类物质含量变化范围为1.77~2.64 mg/g,其中泾源县新民乡南庄村细叶百合鳞茎中多酚类物质含量最高,是含量最低的西吉县火石寨细叶百合的1.49 倍;泾源县新民乡南庄村的细叶百合鳞茎中多糖含量显著高于其它地区,达到26.81 mg/g,西吉县火石寨次之,红寺堡区罗山绿化台沟最低,仅为14.77 mg/g;皂苷含量在不同采集地百合鳞茎中含量较少,变化范围为1.24~1.86 mg/g;红寺堡区罗山乱柴沟采集的细叶百合鳞茎中生物碱含量最高,达到15.74 mg/g,是其它采集地细叶百合的的1.22~1.36 倍。
表2 不同采集地细叶百合鳞茎活性物质含量
Table 2 Active substances contents in L.pumilum bulbs from different collection sites
注:同列不同小写字母a~f 表示地区间活性物质含量差异显著(P<0.05)。
采样地 总酚/mg·g-1 多糖/mg·g-1 皂苷/mg·g-1 生物碱/mg·g-1?
各采集地活性物质含量数据变异系数均小于15%(见表3),在宁夏自然分布的细叶百合鳞茎活性物质中多糖含量最高,生物碱次之,皂苷含量最低,其平均含量从高到底依次为:多糖(19.95±0.94)mg/g,生物碱(12.57±0.57)mg/g,总酚(2.11±0.10)mg/g,皂苷(1.44±0.11)mg/g。
表3 宁夏细叶百合鳞茎活性物质含量特征
Table 3 Characteristics of active substances in bulb of Ningxia L.pumilum
?
如表4所示,不同采集地土壤中总有机碳含量变化范围为23.72~53.36 mg/g,其中泾源县新民乡南庄村细叶百合鳞茎的总有机碳含量最高,达到53.36 mg/g,其次为泾源县西贤村细叶百合鳞茎,西吉县火石寨细叶百合鳞茎总有机碳含量最低;土壤全氮含量变化范围为0.44~2.34 mg/g,其中西吉县火石寨土壤全氮含量最高,达到2.34 mg/g,是其它采集地土壤含量的1.13~5.32 倍;土壤全磷含量变化范围为0.17~0.33 mg/g,在各采集地土壤中含量均较低。
表4 不同采集地土壤碳、氮、磷特征
Table 4 Soil C,N,P contents in different collection sites
注:同列不同小写字母a~g 表示地区间土壤碳、氮、磷含量差异显著(P<0.05)。
采样地 总有机碳/mg·g-1 全氮/mg·g-1 全磷/mg·g-1 土壤碳氮比(C∶N)土壤氮磷比(N∶P)1 32.03 ± 1.24d 0.71 ± 0.04e 0.31 ± 0.02b 45.25 ± 3.98c 104.47 ± 5.05e 2.33 ± 0.25cd 2 31.10 ± 0.56d 0.71 ± 0.04e 0.25 ± 0.01e 44.05 ± 3.18c 124.31 ± 6.00d 2.84 ± 0.30bc 3 41.09 ± 1.18c 0.60 ± 0.03f 0.30 ± 0.02b 68.29 ± 5.57b 137.96 ± 6.90c 2.04 ± 0.25d 4 41.65 ± 0.19c 0.95 ± 0.05d 0.29 ± 0.02c 44.08 ± 2.58c 146.30 ± 8.34c 3.34 ± 0.37b 5 31.56 ± 1.09d 1.29 ± 0.07c 0.17 ± 0.02f 24.59 ± 1.98d 182.34 ± 14.02b 7.51 ± 0.15a 6 23.72 ± 0.11e 2.34 ± 0.12a 0.33 ± 0.02a 10.14 ± 0.58e 72.29 ± 3.74f 7.17 ± 0.75a 7 53.36 ± 0.91a 2.08 ± 0.11b 0.27 ± 0.01d 25.66 ± 1.26d 200.28 ± 10.59a 7.84 ± 0.77a 8 48.47 ± 0.37b 0.44 ± 0.03g 0.27 ± 0.02cd 109.69 ± 7.00a 177.18 ± 9.64b 1.63 ± 0.18d土壤碳磷比(C∶P)
不同种群细叶百合鳞茎活性物质含量与生态因子RDA 排序结果显示,生态因子对活性物质的总解释变量占61.6%(调整后的解释差异为10.5%)。图中箭头之间的角度代表了响应变量和解释变量间的相关性,箭头越长,生态因子对百合鳞茎活性物质含量的解释量越大。如图1所示,皂苷含量与水蒸气压、年均降雨量呈显著正相关关系,而与纬度、太阳总辐射呈显著负相关关系;多酚类物质含量与经度呈显著正相关关系;多糖含量与纬度、太阳总辐射呈显著负相关关系;生物碱含量与年均降雨量、年平均气温呈不显著负相关关系;多酚类物质含量与土壤总有机碳含量、土壤碳磷比呈极显著正相关关系,多糖、皂苷含量与土壤全氮含量呈极显著正相关关系,而与土壤氮磷比呈显著正相关关系,生物碱与土壤全磷含量呈显著负相关性。
图1 不同种群细叶百合鳞茎活性物质含量与生态因子RDA 排序图
Fig.1 RDA of active substance content in L.pumilum bulbs and environment variables in different populations
注:图中实心箭头为生态因子,空心箭头为活性物质含量。ALT为海拔,LAT 为纬度,LOG 为经度,MAP 为年均降雨量,MAT为年均温度,maxMAT 为年最高气温,minMAT 为年最低气温,WS 为风速,WVP 为水蒸气压,TSR 为太阳总辐射,TOC 为土壤总有机碳,TON 为土壤全氮,TOP 为土壤全磷,C∶N 为土壤碳氮比,C∶P 为土壤碳磷比,N∶P 为土壤氮磷比,Polyphe 为多酚类物质,Polysac 为多糖,Sap 为皂苷,Alk 为生物碱。
宁夏8 个自然分布区生态因子对细叶百合鳞茎活性物质含量的影响存在显著差异,其中宁夏六盘山地区细叶百合鳞茎活性物质含量均较高,细叶百合的主要活性成分有多糖、甾体皂苷、酚类化合物、黄酮类化合物和生物碱等,具有免疫调节、降血糖、抗肿瘤、抗真菌以及抗氧化等功能,是影响其药用价值的重要物质[19-21],因此,六盘山地区百合种质资源潜在的保健功能具有更高的开发和利用价值。
生态因素与植物体内化学物质形成和变化密切相关,对药用植物中有效成分的形成和积累起重要作用,光照、温度、水分等间接影响植物的生长及植物体内物质的含量[22-24]。本研究中RDA 分析表明,多糖含量与纬度呈显著负相关,随着纬度的升高,太阳辐射减少,使得温度降低,不利于多糖的富集,可能是因为多糖是一种能量物质,为抵御寒冷而被消耗,因此积累量少;多酚类物质含量在宁夏不同采集地差异较大,这可能与当地所处的环境条件有关,除了总酚含量与经度间呈极显著正相关外,其余相关性均未达到显著水平,这表明经度是影响细叶百合鳞茎多酚类物质含量的主导地理分布因子,在一定范围内,经度升高有利于细叶百合总酚含量的积累;皂苷含量与水蒸气压、年均降雨量呈显著正相关关系,在水分充足的环境条件下利于皂苷的积累,这与郭杰等[25]研究结果一致;而生物碱对气候因子的响应不明显。
土壤是植物生长的基础,与植物时刻进行着频繁的物质交换,因此土壤是影响植物体内化学成分的重要因素,其理化性质对药用植物的产量和质量有显著影响,土壤中的C、N、P 对细叶百合的生长发育有一定的影响,其中N、P 是极其重要的限制因子[26-28]。本研究通过RDA 分析发现,多酚类物质含量与土壤总有机碳含量、土壤的碳磷比呈显著正相关,说明土壤的碳磷比可能是影响细叶百合鳞茎多酚类物质含量的主要土壤因子,土壤的碳磷比越大,越容易促进多酚类物质的生成;鳞茎中生物碱含量与土壤全磷含量呈显著负相关,说明细叶百合鳞茎中生物碱积累主要受P 元素限制,施肥时适当减少P 肥的施加,有利于细叶百合鳞茎中生物碱的合成;皂苷和多糖含量与土壤全氮含量呈显著正相关,说明增加土壤中全氮的含量能够在不同程度上促进细叶百合鳞茎中活性物质的积累,这与王静等[29]在氮磷钾对桔梗次生代谢产物影响的研究结果相似。本研究结果可以用于指导百合土壤养分,合理开发和利用野生百合资源,为宁夏地区开展食用百合特色产业,更新传统食用百合种植结构,促进宁夏乃至我国百合产业的发展有着重要意义。
宁夏8 个自然分布区细叶百合鳞茎活性物质含量存在显著差异,其中六盘山地区细叶百合鳞茎中活性物质含量整体优于其它两区,可作为优质百合资源开发利用;通过RDA 分析探明了经度、年均降雨量、土壤全氮是其活性成分积累的主要生态因子。
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Correlation between the Contents of Active Substances in Bulbs of Lilium pumilum and Ecological Factors in Ningxia