傅里叶变换红外光谱 （Fourier transformation infrared spectroscopy，FT-IR） 技术主要是把干涉条纹的图像信息转换成离散的数字量，再进行傅里叶变换得到被测样品红外光谱的技术[1]，具有扫描速度快，分辨率和灵敏度较高的优点，广泛应用于定性、定量分析、性能表征、成分检测等众多领域[2]。许多研究者优化和调整了技术条件，并与其它分析技术联用获取被分析物质的综合信息[3-4]，采用更精准、有效的化学计量方法，建立适合分析目标的数学模型，提高技术的精度和准确度。比如Mourad 等[5]利用FT-IR 技术结合校正模型偏最小二乘回归法（PLSR）量化了酸度、储存材料、吸收度对油类储存期间新鲜程度的影响；Adiani 等[6]分别研究了两种获取食品化学指纹数据的方法，同样采用PLSR 统计分析，分别建立了单一GC-MS模型和基于FTIR 的补充模型，结果表明基于FTIR 的补充模型可以准确预测87%的样品，而GCMS 的准确预测为53%，为建立基于FT-IR 的随机食品样品质量预测模型提供了新的选择。此外，Naumanan 等[7]指出傅里叶变换红外光谱法具有判别、分类和鉴别微生物的能力。Rebuffo-scheer 等[8]利用傅里叶红外光谱技术为非结核分歧杆菌种属的高效鉴定提供了方法研究。王萍等[9]建立了4 种假单胞菌的光谱数据库和FT-IR 分类方法。
采用傅里叶红外光谱技术进行微生物种类鉴定较多集中在属内种间水平。如：Lefier 等[10]运用FT-IR 技术结合标准差分析 （Canonical variates analysis,CVA）方法，能够将默式李斯特菌与李斯特杆菌的其它6 个种区分开，同时对单核细胞增生李斯特菌的5 个血清型进行初步分类，为FTIR 技术在细菌亚种水平上分类的应用奠定基础。细菌亚种的分类依据主要是基于生物学特性方面的差别[11]。甲型、乙型、丙型是副伤寒沙门氏菌属内3 个不同的亚种或血清型，是水和食品的重要污染菌。许龙岩等[12]建立了基于TaqMan 探针的四重荧光PCR 检测方法，用于鉴定沙门氏菌的3 个亚种，比较而言，分子生物学检测方法对技术要求较高，操作复杂，成本较高。本文应用FT-IR 技术结合化学计量学方法建立光谱数据库，通过聚类分析建立快速、操作简单、稳定可靠的FT-IR 分类方法，旨在用于细菌亚种的鉴定研究。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 标准菌株 甲型副伤寒沙门氏菌（Salmonella paratyphi A，S.paratyphi A）CMCC 50001、乙型副伤寒沙门氏菌（Salmonella paratyphi B，S.paratyphi B）CMCC 50094、丙型副伤寒沙门氏菌（Salmonella paratyphi C，S.paratyphi C）CMCC 50095，菌株均从国家微生物菌种保藏中心（CMCC）采购。
1.1.2 加标材料 冷冻鲐鲅鱼购于当地市场 （大润发）。
1.1.3 试剂 营养肉汤和平板计数琼脂，广东环凯微生物科技有限公司；亚硫酸铋（Bismuth sulfite，BS）琼脂、木糖赖氨酸脱氧胆盐（Xylose lysine desoxycholate，XLD）琼脂，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。无水乙醇（分析纯），上海麦克林生化科技有限公司。
1.2 仪器与设备
傅里叶变换红外光谱仪，美国赛默飞世尔科技有限公司；核酸蛋白分析仪，美国宝腾国际有限公司；离心机（型号3K15），美国Sigma 公司；恒温恒湿培养箱，中仪国科（北京）科技有限公司；干燥箱，上海精宏实验设备有限公司。
1.3 方法
1.3.1 样品的制备 将-70 ℃保藏的3 株标准菌株分别接种于营养肉汤中，（36±1） ℃，180 r/min振荡培养18～24 h，备用。
挑取3 种活化菌液一环分别接种于100 mL营养肉汤中，（36±1）℃，180 r/min 振荡培养18～24 h。测定菌液浓度后，分别吸取3 种菌液各1 mL 于1.5 mL 离心管中，5 000×g 离心5 min，菌泥分别用1 mL 无菌生理盐水和1 mL 超纯水各洗涤2 次，最后用50 μL 超纯水悬浮菌泥沉淀，混匀，吸取不同稀释度的菌悬液各10 μL 于ZnSe 窗片（透过波长7 800～440 cm-1，透过率大于68%，厚度2 mm，直径25 mm）中心，置于45 ℃烘干，得到菌斑样品。每个菌株重复试验8 次，每次3 个样品重复。
1.3.2 光谱采集 利用傅里叶变换红外光谱仪对制备好的ZnSe 窗片样品进行光谱扫描，采集4 000～400 cm-1[13-16]波段范围内的光谱信息，分辨率4 cm-1，扫描64 次，取平均值[17]，仪器设置自动扣除大气背景。
1.3.3 标准光谱数据库的建立及聚类方法的建立 利用OPUS 6.5 软件对光谱数据进行预处理：首先进行自动基线校正，然后全光谱数据进行平滑去噪（一阶9 点平滑） 运算后再进行矢量归一处理，得到导数谱，最后转化为DPT 数据点格式到excel 数据格式，建立标准光谱的数据库，用于聚类方法的建立。
用Metlab 6.5 和Statistica 6.0 软件对3 种菌在1 805.3～977.9 cm-1 波数范围内的光谱数据进行主成分分析（Principal component analysis，PCA）和分级聚类分析（Hierarchical cluster analysis，HCA），得到甲型、乙型、丙型3 种菌FT-IR 光谱的HCA 和PCA 聚类分布图，建立3 种副伤寒沙门氏菌的分类鉴定方法。
PCA 和HCA 都是在细菌分类未知的情况下对光谱数据进行描述的方法，其中，PCA 在不降低光谱差异的前提下，减少变量维数，转化为少数几个综合变量[18]，而后将光谱进行比较，相同光谱归类画出散点图。HCA 是用光谱间的距离作为判定依据，根据数据本身所具有的定性或定量特征进行归类和内在结构分析[19]，本文采用的是皮尔森积矩相关系数计算距离，运用Ward's 算法，得到光谱簇间距离。
1.4 加标验证
1.4.1 供试样品制备 取解冻后的冷冻鲐鲅鱼500 g，剪碎均质后，向其中添加甲型副伤寒沙门氏菌CMCC 50001 溶液（5×102 CFU/mL）10 mL，搅拌混匀，冷冻备用。
1.4.2 细菌培养 将冷冻鲐鲅鱼供试样品解冻后，称取样品25 g，按照沙门氏菌检测标准进行增菌培养。
增菌后的培养液划线接种选择性培养基BS和XLD，分别置于（36±1） ℃培养24～48 h 后（BS培养48 h），用无菌接种环挑取可疑菌落一环，接种于盛有15 mL 营养肉汤的大试管中，（36±1）℃静置培养18～24 h，尽量控制OD600nm 值在0.45 左右。
1.4.3 硒化锌（ZnSe）窗片的制作 按照1.3.1 节的方法分别制作各菌的ZnSe 窗片样品。
1.4.4 光谱采集 按照1.3.2 节的方法分别采集各个样品的光谱数据。
1.4.5 数据处理及分析 可疑菌做3 个重复，结果取平均值。光谱预处理同1.3.3 节的方法。
将可疑菌光谱数据与1.3 节所建立的光谱信息数据库进行合并，并应用Metlab 6.5 和Statistica 6.0 对1 805.3～977.9 cm-1 范围内的光谱数据分别进行PCA 和HCA 分析，得到分类鉴定结果。甲型副伤寒沙门氏菌应聚类到数据库种对应的甲型副伤寒沙门氏菌聚类群中。
2 结果与分析
2.1 细菌浓度
（36±1）℃振荡培养18～24 h 后，菌液的吸光值及其对应的菌浓度见表1。
表1 培养后菌液吸光值（OD600nm）及其相应菌浓度
Table 1 OD600nm of bacteria and its corresponding concentration
细菌浓度/CFU·mL-1甲型副伤寒沙门氏菌 0.44 2.2×108乙型副伤寒沙门氏菌 0.69 3.5×108丙型副伤寒沙门氏菌 0.58 2.9×108标准菌株名称 OD600nm
2.2 光谱数据库的建立
红外光谱中的4 000～400 cm-1 波数范围能够对细菌进行较好的分类，其中1 800～900 cm-1 是细菌的特征指纹波段。根据试验结果，本文确定4 000～600 cm-1 为光谱采集波数范围，1 805.3～977.9 cm-1 为数据分析波段范围。对得到的原始光谱数据进行基线校正、归一化、一阶导数等预处理，得到导数谱，又对导数谱进行适量归一化，建立了3 种副伤寒沙门氏菌的FT-IR 导数谱数据库。
对各菌株的重复测量谱图取平均值，见图1。在1 805.3～977.9 cm-1 波数范围内，各菌株的光谱图具有相似性，难以直观辨别，乙型副伤寒沙门氏菌在992.8 cm-1 处的峰形与其它2 种菌略微有所不同，而肉眼难以区分，鉴定分类需要进一步借助计算机和化学计量学运算来分析[20]。
图1 3 种副伤寒沙门氏菌FTIR 光谱图
Fig.1 FTIR spectra of three subspecies of S.paratyphi
2.3 聚类分析结果
2.3.1 PCA 分析结果 PCA 方法通过简化变量实现线性降维，选取方差贡献率最大的前几个主成分构成空间分布图，可以对不同种属的关系远近进行判定，也可以揭示相同属、种以及不同生物特征亚种的相似性。以主成分1（PC1）和主成分2（PC2）作为聚类依据进行PCA 分析，得到甲型、乙型、丙型副伤寒沙门氏菌的PCA 聚类分布图，见图2。由图可知，3 种菌的散点图被分布在不同的象限内，说明FT-IR 结合PCA 分析能够将3 种菌进行较好的分类和鉴定。主成分PC1、PC2 的权重见图3，PC1 和PC2 的方差贡献率分别为39.6%和29.0%，说明这两个主成分可以解释原始数据68.6%的有效信息，用于PCA 分析具有代表性。
图2 3 种副伤寒沙门氏菌PCA 聚类分布图
Fig.2 PCA cluster results of three species of S.paratyphi
图3 3 种副伤寒沙门氏菌PCA 分析中的PC1、PC2 图
Fig.3 Loading plots of PC1 and PC2 obtained from PCA analysis of three species of S.paratyphi
2.3.2 HCA 分析结果 HCA 通常用来估计光谱之间的相似性，选择合适算法并描绘树状分支图对细菌进行判定。对甲型、乙型、丙型副伤寒沙门氏菌的光谱数据HCA 分析结果，见图4，可见3种菌都被单独聚为一类，说明通过HCA 分析可以将副伤寒沙门氏菌的3 个亚种进行较好聚类。
图4 3 种副伤寒沙门氏菌亚种的HCA 聚类分析图
Fig.4 HCA cluster results of three sub-species of S.paratyphi
2.3.3 加标验证结果 通过向冷冻鲐鲅鱼样品中添加标准菌株，验证所建立的3 种副伤寒沙门氏菌的FT-IR 光谱数据库及所建立的各菌的FT-IR分类鉴定方法，结果见图5、图6。由图可知，从样品中分离的甲型副伤寒沙门氏菌成功聚类到数据库中对应的甲型副伤寒沙门氏菌标准菌株聚类群中，因此可以对可疑目标菌的所属亚种做出初步判断。验证试验说明本文建立的3 种副伤寒沙门氏菌的标准菌株光谱数据库，能够实现对可疑目标菌的归类分析，也说明本文所建立的3 种副伤寒沙门氏菌的FT-IR 分类鉴定方法不仅准确、有效，而且方便、快速，可以在几分钟之内实现对可疑菌的分类鉴定。
图5 可疑甲型副伤寒沙门氏菌的PCA 聚类分布图
Fig.5 PCA cluster results of suspected S.paratyphi A
图6 可疑甲型副伤寒沙门氏菌的HCA 树状分布图
Fig.6 HCA cluster results of suspected S.paratyphi A
3 讨论
FT-IR 技术在鉴定细菌方面的作用越来越受到重视，其具有简单、快速、高效等优点，而且成本低廉，有助于在食品检测、临床医学等领域开展快速鉴定。同时，许多研究发现细菌的培养条件，样品制备的标准化，光谱扫描的参数设定，以及光谱分析方法对FTIR 结果的重复性有很大影响[21]，因此应确保可疑菌的所有操作及参数均与建立光谱数据库保持一致，即确保所有操作及数据处理的标准化。有研究者在试验中选用等量的干菌粉收集光谱后，重复性比菌斑效果更稳定[22]，可以在进一步研究中进行借鉴。也有研究发现在试验用量范围内，微生物量的变化对谱图无明显影响[23]。本文研究发现细菌的浓度对细菌种间鉴定存在一定的影响，应尽量保证浓度的统一，减少对后期分析的影响。
FT-IR 技术结合计量学应用于细菌分类的基础是通过光谱信息反映了菌体的生化组成成分的特征[24-25]，如同菌体的指纹信息，因此可以通过分析光谱的组成变化来研究不同菌体的分类，然而由于这些区别数据量较大，往往肉眼无法得到结果[6，26-27]。在应用FT-IR 技术时，常需要把FT-IR技术和化学计量分析方法相结合，分析获取的综合信息，利用包括PCA、HCA 等在内的数学计算模型，提高FT-IR 谱图分析的准确度[28]。
甲型、乙型、丙型3 种副伤寒沙门氏菌作为重要的食源性致病菌，采用常规生化方法、免疫学及分子生物学方法等操作，往往存在程序繁琐、耗时较长等缺点，因而易受干扰，常出现假阴性或者假阳性的结果[29]。相比较而言，FT-IR 技术在微生物分类鉴定上，具有操作简单，前处理少，分析速度快等优点[30]。本文利用FT-IR 技术，建立各菌的光谱数据库，通过PCA、HCA 分析方法，构建了3 种菌的分类鉴定方法，验证试验结果也表明FT-IR技术结合化学计量学方法用于副伤寒沙门氏菌亚种的分类鉴定是稳定有效的。
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