双酚A（Bisphenol A，BPA）是一种常见的环境内分泌干扰物，是合成聚碳酸酯、环氧树脂、聚砜树脂等多种高分子材料的前体物质，常用于食品包装、容器内壁涂层及婴儿奶瓶的生产中[1]。研究表明，双酚A 对人和动物的内分泌系统、神经系统、免疫系统及生殖系统有不良影响，甚至会诱发某些癌症[2-4]。BPA 暴露对人体健康的影响，已引起多国关注。欧盟、日本、加拿大、美国等对双酚A 在食品接触材料中的含量做出了严格规定[5]。2011年，我国卫生部公告第15 号中全面禁止生产、进口及销售含BPA 的婴幼儿奶瓶，其它食品包装材料、容器中允许使用BPA，然而BPA 含量要符合相关食品安全国家标准中的规定[6]。双酚F（BPF）和双酚S（BPS）作为双酚A 的结构类似物，具有类似于BPA 的结构和更强的酸性及稳定性，为满足市场需求，被广泛用于禁止或限制BPA 使用的日常用品的制造，被认为是双酚A 的“安全”替代物。然而，越来越多的研究表明双酚S 和双酚F 也具有与双酚A 相似的内分泌干扰活性[7]，如雷鹏辉等[8]发现双酚S 和双酚F 对斑马鱼胚胎及幼鱼早期发育有影响，对水生生物产生氧化压迫。
双酚类化合物污染饮用水、环境，并经土壤-植物系统进入食物链。奶牛食用了受污染的饲料后，牛奶中就可能会有双酚A、双酚F、双酚S 的残留；生乳储存、运输及加工过程中，可能会接触到塑料制品设备，牛奶及其制品的包装材料中也可能含有BPF、BPA、BPS，进而危害人体健康。牛奶是人们生活中的必需品，我国目前还没有对双酚A、双酚F、双酚S 的国标检测方法，同时缺乏对食品中双酚A、双酚F、双酚S 含量水平和污染情况的全面摸底和评估。研究牛奶中双酚A、双酚F、双酚S 的检测方法具有重要现实意义。
目前，国内外测定双酚类化合物的方法主要有气相色谱-质谱法[9]、液相色谱法[10]及液相色谱-串联质谱法等[11]。液相色谱仪的灵敏度不高，在检测过程中容易出现假阳性。气相色谱-质谱法前处理繁琐，样品测定时间较长，不适于大量样品的快速测定。高效液相色谱-串联质谱法具有前处理简单，抗干扰能力强，灵敏度较高等优点，被广泛应用。目前，利用液相色谱-质谱联用法测定牛奶中BPA 的研究较多，如张建莹等[12]通过优化牛奶中双酚A 的提取纯化和测定条件，建立牛奶中双酚A 的超高效液相色谱-串联质谱检测方法。然而，有关同时测定牛奶中双酚A、双酚F 和双酚S 含量的方法未见报道。本文采用氨水乙腈超声提取并去除蛋白，通过RiME HLB 固相萃取柱除去脂肪，氮吹富集，采用高效液相色谱-串联质谱法测定，内标法定量。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
牛奶，北京美廉美超市。
双酚A、双酚F、双酚S、双酚A-D4、双酚F-13C6 和双酚S-13C12（纯度≥99%），TRC 公司；乙腈、甲醇、氨水均为HPLC 级；Milli-Q 超纯水系统，上海摩速科学仪器有限公司；Oasis PRiME HLB 固相萃取柱（200 mg/6cc），美国Waters 公司；分析天平（XSE105），赛多利斯科学仪器有限公司。
Agilent 6470 三重四极杆液质联用系统：配有电喷雾离子源ESI 及Agilent1290Ⅱ型液相色谱仪，安捷伦科技（中国）有限公司；DL-120J 型超声波清洗仪，上海之信仪器有限公司；Multi real振荡器，厦门科睿特仪器有限公司；ucg-24c 圆形水浴氮吹仪，北京优晟联合科技有限公司。
1.2 标准溶液制备
标准和同位素内标储备液 （1 mg/mL）：双酚A、双酚F、双酚S、双酚A-D4、双酚F-13C6 和双酚S-13C12 标准品各约10 mg（精确至0.1 mg），用甲醇溶解定容至10 mL 棕色容量瓶中，配成质量浓度为1 mg/mL 的标准储备液，-18 ℃避光保存，有效期6 个月。
混合标准中间液（10 μg/mL）：准确吸取上述储备液1.0 mL，于100 mL 棕色容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配成质量浓度为10 μg/mL 的中间液，4 ℃保存，有效期1 个月。
1.3 样品的提取
取试样1.0 g，精确到0.01 g，放入10 mL 的比色管中，加入20 μL 内标工作液，氨水∶乙腈溶液（1∶9，体积比）溶解并定容至刻度，涡旋混匀，超声提取10 min，静置片刻，取2 mL 上清液，使用PRiME HLB 固相萃取柱进行净化。准确移取净化液1.5 mL 于离心管中，水浴氮气吹干，0.3 mL 乙腈溶解，过0.22 μm 的微孔尼龙滤膜至进样瓶，待测。
1.4 色谱-质谱条件
色谱条件：色谱柱：安捷伦Poroshell 120 PFP色谱柱 （2.0 mm×150 mm，5 μm）；流速：0.30 mL/min；进样体积：2 μL；流动相A：甲醇，流动相B：1‰氨水溶液。
质谱条件：电喷雾负离子源（ESI-）；多反应检测的检测方式（MRM）；雾化气压力为275.8 kPa；干燥气（N2）温度为300 ℃；鞘气温度为350 ℃；鞘气流速为11 L/min；毛细管电压为3 500 V；其它参数如表1所示。
表1 化合物的质谱分析参数
Table 1 Mass spectrometry parameters of the compounds
注：*.定量离子。
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2 结果与分析
2.1 优化的样品前处理方法
由于牛奶基质复杂，富含脂肪和蛋白质，因此应选取弱极性的溶剂作为提取溶剂，本试验分别比较了丙酮、乙腈、甲醇及氯仿对牛奶中蛋白质的去除效果。结果表明，乙腈去除蛋白的效果最好，同时又可以避免从样品中提取出大量其它干扰物质；双酚A、双酚F 及双酚S 都是负离子模式电离，为了提高离子化效率，本方法采用氨水∶乙腈（1∶9，体积比）溶液提取样品。
牛奶中的大部分蛋白质可通过氨水乙腈沉淀，而同时其它杂质也会被提取出来，为了避免影响目标物的分离效果，在使用氨水∶乙腈（1∶9，体积比）溶液提取样品后，还要进行必要的净化。分别比较了4 种固相萃取柱的净化效果，包括安杰尔PCX（6cc/200 mg）、PRiME HLB（6cc/200 mg）、Oasis HLB （6cc/200 mg） 及安杰尔C18（6cc/200 mg）。结果表明，PRiME HLB（6cc/200 mg）固相萃取柱能吸附牛奶中的非极性干扰物质，如脂肪和磷脂，去除效率达90%以上。为了提高目标化合物检测灵敏度，本方法采用氮吹进行富集。
2.2 优化的色谱条件
2.2.1 色谱柱 分别采用资生堂MGⅢ-C18 色谱柱 （150 mm×2.1 mm，5 μm）、Agilent ZORBAX SB-C18 色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）、Hypersil GOLD C18 色谱柱（50 mm×4.6 mm，1.9 μm）和Agilent Poroshell 120 PFP 色谱柱 （100 mm×4.6 mm，2.7 μm）对样品进行分离。试验发现，Agilent Poroshell 120 PFP 色谱柱 （50 mm×4.6 mm，1.9 μm）的分离效果较好，有利于目标化合物与杂质的分离。
2.2.2 色谱分离条件 双酚A、双酚F 和双酚S的极性不同，因此3 种化合物采用流动相梯度洗脱的方式进行分离，结果显示，双酚A 会出现假阳性的情况。基于以上试验结果，本试验采用流动相等度洗脱，流动相为甲醇和1‰氨水溶液。结果表明，当甲醇和1‰氨水溶液作为流动相时，双酚A、双酚F 及双酚S 能在7 min 内被有效分离。图1为双酚S、双酚F 和双酚A 的色谱图。
图1 双酚S、双酚F 和双酚A 的标准溶液MRM 色谱图
Fig.1 Standard solution MRM chromatogram of bisphenol S，bisphenol F and bisphenol A
注：a.双酚S；b.双酚F；c.双酚A。
2.2.3 进样量 试验发现，当进样量为2 μL 时，灵敏度能达到要求，而且可有效延长色谱柱的使用寿命。
2.3 定量方法
基质效应是指样品中分析物易受除分析物以外的组分干扰，从而影响测定结果的准确性。本文对比牛奶提取液及色谱乙腈分别配制的含双酚A、双酚F 及双酚S 标准曲线斜率的比值大小，评价双酚A、双酚F 及双酚S 的基质效应。结果显示，双酚A、双酚F 和双酚S 在牛奶中与乙腈中的标准曲线的斜率比值分别为0.65，0.70，0.36，证明牛奶中的其它基质对双酚A、双酚F 及双酚S 的定量存在电离抑制的基质效应。基于以上试验结果，采用同位素内标法校正基质效应对结果的影响，提高测定结果的准确性。本试验选择双酚AD4、双酚F-13C6 和双酚S-13C12 为相应的内标物质，采用内标法定量分析。
2.4 线性范围与检出限
配制标准系列混合工作液（双酚A、双酚F 和双酚S 的质量浓度依次为1.0，2.0，5.0，10.0，20.0 ng/mL，二者的内标质量浓度均为10.0 ng/mL）。以双酚A、双酚F、双酚S 和内标物的峰面积比（y）和对浓度比（x）绘制标准曲线。以信号与噪音的比值为3 时，对应的质量浓度为检出限，比值为10 时，对应的质量浓度为定量限。结果如表2所示。
表2 双酚A、双酚F 和双酚S 的线性参数和检出限
Table 2 Linearity parameters and detection limit of bisphenol A，bisphenol F and bisphenol S
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2.5 方法的回收率与精密度
称取18 份等量的空白样品，分为3 组，分别定量加入混合标准物质及对应的内标物质，使得双酚A、双酚F 和双酚S 的加标量质量浓度为2.0，4.0，10.0 μg/kg。
按以上试验方法提取后进行测定，测定结果见表3。结果表明，双酚A、双酚F 和双酚S 的平均方法回收率在90.4%～103.1%之间，平均相对标准偏差为2.76%～7.34%（n=6）。
表3 双酚A、双酚F 和双酚S 的加标回收率及精密度
Table 3 Standard addition recovery rate and relative standard deviation of bisphenol A，bisphenol F and bisphenol S
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2.6 实际样品检测
利用上述试验方法对市场销售的10 种牛奶样品进行检测，验证方法的可靠性和适用性。结果显示，双酚A、双酚S、双酚F 的测定值均低于方法检出限。
3 结论
本文建立了同时测定牛奶中双酚A、双酚F及双酚S 的液相色谱-串联质谱测定方法。该方法采用氨水∶乙腈溶液 （1∶9，体积比） 沉淀蛋白，PRiME HLB 固相萃取柱净化，采用负离子多反应监测模式监测，内标法定量；在不同添加水平下，平均方法回收率在90.4%～103.1%之间，平均相对标准偏差为2.76%～7.34%（n=6）。该方法具有样品前处理简单，测定快速，准确性和重复性良好，能为我国牛奶中双酚A、双酚F 和双酚S 污染物残留的监管与乳品流通过程中的安全问题提供技术支持。
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