酵母β-葡聚糖是酵母细胞壁的重要组成之一，由β-1，3-糖苷键为主链，β-1，6-糖苷键为支链连接而成[1]，具有抗肿瘤[2-6]、抗氧化[7-8]、降血糖[9]、调节免疫力[10-12]、抗菌消炎[13]等多种生物活性。然而，其独特的三股螺旋结构，导致溶解性极低，在食品、药品等领域的应用受限。为改善酵母β-葡聚糖的溶解性，国内外学者对酵母β-葡聚糖进行修饰改性，包括辐照[14]、热降解[15]、离子液体-高压微射流[16]等物理改性方法，磷酸酯化[17]、硫酸酯化[18]、酸解与碱解结合[19]等化学改性方法，以及酶解[20]等生物改性方法。生物改性方法主要通过酶切断多糖内部的键，使其分子质量降低，以提高其溶解性。与物理、化学改性方法相比，生物改性法具有对环境友好、作用条件温和、高效专一等优点。
蜗牛酶是由纤维素酶、半纤维酶、果胶酶等40 多种酶组成的混合酶[21]，在食品、化妆品等领域应用广泛。李悦等[22]使用蜗牛酶降解茯苓多糖，以提高其水溶性，降解率达40.20%；张涛等[23]采用蜗牛酶降解壳聚糖，寡糖得率可达64.74%。可见，蜗牛酶降解多糖是一种提高多糖溶解性较为理想的方法，而蜗牛酶降解酵母β-葡聚糖的研究尚未报道。本文使用蜗牛酶水解酵母β-葡聚糖，为水溶性酵母β-葡聚糖的工业化生产，以及扩大酵母β-葡聚糖的应用范围提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与设备
酵母β-葡聚糖，安琪酵母有限公司；蜗牛酶，北京索莱宝有限公司；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠，国药集团化学试剂有限公司（分析纯级）。
1.2 仪器与设备
HH-S4 恒温震荡水浴锅，余姚市金表仪器有限公司；Freezee zone 6 真空冷冻干燥机，美国Labconco 公司；YP5001 电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；LDO-9246A 烘箱，上海龙跃仪器设备有限公司；Seven Compact pH 计，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；HELEOS-Ⅱ十八角度激光光散射，美国Wyatt 公司；Mastersizer 3000 激光粒度分析仪，马尔文仪器有限公司；J-1500 圆二色谱仪，日本分光株式会社；Q50 热重分析仪，美国TA 公司。
1.3 试验方法
1.3.1 β-葡聚糖的酶解工艺 称取一定量的β-葡聚糖溶于水中，震荡水浴锅中预热5 min 后加入蜗牛酶，反应一段时间后沸水浴5 min 将酶灭活。试验初始条件为底物质量浓度10 mg/mL，酶添加量2%，温度37 ℃，反应时间60 min。在离心机中以4 800 r/min 转速离心15 min，取10 mL 上清液烘箱恒重法测总得率，剩余样品冻干备用。
保持其它条件不变，考察底物质量浓度（10，15，20，25，30 mg/mL）、温度（30，35，40，45，50 ℃）、时间（50，60，70，80，90 min）；酶添加量（1%，2%，3%，4%，5%）对水溶性β-葡聚糖得率的影响。
1.3.2 响应面试验 根据单因素实验结果，选择对水溶性β-葡聚糖得率影响较大的温度、时间和酶添加量进行响应面试验设计，表1为响应面设计的因素编码及水平。
表1 响应面试验设计因素及水平
Table 1 Factors and levels of response surface experiment
?
1.3.3 水溶性β-葡聚糖得率的测定 将冻干样品配制成适当浓度溶液测总糖和还原糖含量，计算水溶性β-葡聚糖得率，公式如下：
水溶性β-葡聚糖得率（%）=（m 总-m 还）/β-葡聚糖的质量×100
1.3.4 总糖含量测定 采用苯酚-硫酸法测定总糖含量[24]。
1.3.5 还原糖含量测定 采用3，5-二硝基水杨酸法测定还原糖含量[25]。
1.3.6 溶解度测定 参考白文强[26]的方法并略作修改。取适量酶解处理前、后的β-葡聚糖样品溶于水，搅拌30 min 后，4 000 r/min 离心15 min，取上清液放于恒重的带盖铝盒中，105 ℃烘至恒重。
溶解度（%）=上清液中物质质量/β-葡聚糖质量×100
1.3.7 粒径分布 分别将酶解前、后的β-葡聚糖配制成溶液，使用Matersizer-3000 测定酶解前、后β-葡聚糖的粒径分布。
1.3.8 分子质量测定 酶解前、后β-葡聚糖的分子质量测定所用的液相系统为Agilent 1260，色谱柱为PL-gel MIXED-C 5 μm，以0.1% NaCl 溶液为流动相和溶剂，将β-葡聚糖配制成1 mg/mL 溶液，0.45 μm 微膜过滤后进样。
1.3.9 热稳定性测定 参考范红梅[20]的方法并略作修改。采用热重分析仪研究酶解前、后β-葡聚糖的热稳定性变化。称取6 mg 左右的固体粉末置于微型坩埚中，N2 为吹扫气体。温度由30 ℃上升至500 ℃，加热速度为15 ℃/min，N2 流速为50 mL/min。
1.3.10 FT-IR 分析 将β-葡聚糖粉末与溴化钾混合、研磨并压片，在400～4 000 cm-1 范围对样品进行红外扫描，扫描次数为64 次。
1.3.11 圆二色谱 参考Forget 等[27]的方法并修改，将β-葡聚糖配制成1 mg/mL 溶液，在190～250 nm 的波长范围内，以100 nm/min 速度进行扫描，比色皿的光程为1 mm，每个样品连续扫描3 次。
1.3.12 扫描电镜 取适量样品，用导电胶分别将酶解前、后的β-葡聚糖固定到样品台上，在真空喷涂仪中进行喷金处理，在12.5 kV 电压下使用扫描电镜进行扫描观察，拍摄β-葡聚糖的形貌。
1.3.13 数据处理 每组试验做3 次平行，软件SPSS 26 对数据进行显著性分析，Design-expert 8.0.6 设计响应面试验，Origin 2019 进行作图。
2 结果与分析
2.1 单因素实验
分别考察底物质量浓度、时间、酶添加量和温度对水溶性β-葡聚糖得率的影响，如图1a所示，随底物质量浓度的增加，水溶性β-葡聚糖的得率先增加后降低，在底物质量浓度为15 mg/mL 时得率最高。这可能是在底物质量浓度较低时，酶在溶液中自由活动，与底物接触较容易，有利于水解反应的进行；当底物质量浓度继续增加，由于β-葡聚糖的吸水性，体系黏度增加，酶在体系中运动困难，与底物的接触受到阻碍[20]，反应很难进行。
如图1b所示，随时间的增加，水溶性β-葡聚糖的得率先缓慢升高后略有下降，在水解时间为80 min 时最高。这可能是由于水解时间较短时，蜗牛酶将β-葡聚糖的糖苷键断裂，使其水溶性增加；当水解时间继续增加时，蜗牛酶会进一步水解水溶性β-葡聚糖使其成为分子质量更小的糖[28]，水溶性β-葡聚糖的得率略有下降。
如图1c所示，随酶添加量的增加，水溶性β-葡聚糖的得率先增加后有所降低，在酶添加量为4%时得率最高。在酶添加量较低时，酶作用于酵母β-葡聚糖，水溶性β-葡聚糖的得率升高[29]；当酶添加量继续增加时，由于酶与底物达到饱和，多余的酶作用于水溶性β-葡聚糖使其分解成二糖或单糖。
如图1d所示，随温度的增加，水溶性β-葡聚糖的得率先增加后缓慢降低，在温度为45 ℃时得率最高。在温度低于45 ℃时，随温度增加，分子热运动增加，有利于底物与酶之间接触，水溶性β-葡聚糖的得率增加[8]；当温度高于45 ℃时，酶的活性受到影响，因此水溶性β-葡聚糖的得率降低。
图1 不同因素对水溶性β-葡聚糖得率的影响
Fig.1 Effects of different factors on water-soluble β-glucan yield
注：不同字母表示存在显著性差异（P＜0.05）。
2.2 工艺优化
2.2.1 响应面试验设计及结果 为确定水溶性β-葡聚糖的最优工艺，以水溶性β-葡聚糖的得率为响应值，时间、温度和酶添加量作为自变量进行Box-Benhnken 试验设计，试验设计及结果如表2所示。
表2 响应面试验设计及结果
Table 2 Experimental design and results for response surface analysis
序号 温度（A）/℃酶添加量（C）/%1 1 1 0 2 0 1-1 3 0 0 0 4 0-1 1 5 1 0-1 6 0-1-1 7 0 0 0 8-1 0-1 9 0 0 0时间（B）/min得率（Y）/%25.95 30.29 57.89 31.35 13.57 23.67 55.28 20.18 56.28序号10 11 12 13 14 15 16 17温度（A）/℃1-11-10-100时间（B）/min 0-1-1 10001酶添加量（C）/%10000101得率（Y）/%26.52 21.32 18.33 24.72 57.28 25.50 56.40 37.03
2.2.2 响应面回归模型及方差分析 利用Design-Expert 8.0.6 进行多元回归拟合，所得二次多项回归模型方程为：Y=56.63-0.92A+2.92B+4.09C+1.05AB+1.91AC-0.24BC-21.59A2-12.45B2-13.59C2。
由表3方差分析可知，该回归模型P＜0.0001，回归效果极显著；失拟项P=0.3911，差异不显著，模型相关系数R2=0.9955，调整后R2=0.9828，表明模型拟合度较好，在误差允许的范围内，可以用该模型预测水溶性β-葡聚糖的得率。此外，各项式中B、C、A2、B2、C2、AC 对水溶性β-葡聚糖的得率影响极显著，A 对水溶性β-葡聚糖的得率影响显著；各因素对水溶性β-葡聚糖得率影响的顺序是：酶添加量＞时间＞温度。
表3 回归模型方差分析
Table 3 Analysis of variance of regression model
来源 自由度 平方和 均方 F 值 P 值模型 9 3 983.55 442.84 392.43 ＜0.0001**A 16.75 6.75 5.98 0.0444*B 167.98 67.98 60.24 0.0001**133.58 133.58 118.37 ＜0.0001**AB 1 4.45 4.45 3.95 0.0874 AC 1 14.55 14.55 12.90 0.0088**BC 1 0.22 0.22 0.20 0.6715 A2 1 1 963.42 1 963.42 1 739.93 ＜0.0001**B2 1 652.83 652.83 578.52 ＜0.0001**C2 1 777.55 777.55 689.04 ＜0.0001**残差 7 7.90 1.33失拟项 3 3.89 1.30 1.29 0.3911纯误差 4 4.01 1.00 C 1
2.2.3 交互作用分析 各因素的交互作用如图2所示。图2a 中，水溶性β-葡聚糖的得率随酶添加量和时间的增加先增加后降低，且等高线图呈偏圆形，表明两因素的交互作用不显著；图2b 中，水溶性β-葡聚糖的得率随酶添加量与温度的增加先增加后降低，等高线图呈椭圆形，表明两因素间存在一定的相互作用；图2c 中，水溶性β-葡聚糖的得率随时间和温度的增加先增加后下降，等高图呈偏椭圆形但两条线之间间隔较大，表明交互作用影响较弱。2.2.4 验证试验 响应面预测最佳条件：温度44.88 ℃，时间82.29 min，酶添加量4.30%。结合试验条件，将优化条件修正为温度45 ℃，时间83 min，酶添加量为4.30%。该条件下得到的水溶性β-葡聚糖得率的平均值为56.12%，和预测值无显著性差异，这表明优化后的最佳条件是可靠的，可将该回归方程应用到实际。
图2 酶添加量、时间和温度交互作用对水溶性β-葡聚糖得率的影响
Fig.2 Interactive effects of enzyme addition amount，time and temperature on the yield of water-soluble β-glucan
2.3 溶解度
β-葡聚糖酶解前、后溶解性变化如图3所示，β-葡聚糖几乎不溶于水中，经过酶解处理，水溶性β-葡聚糖的溶解性可达（89.74±0.62）%，显著高于β-葡聚糖的溶解性；白文强[26]通过离子液体与微射流协同作用酵母β-葡聚糖使其溶解性提高到至（85.01±0.45）%，石继奎等[30]通过机械活化使酵母β-葡聚糖的溶解性提高到37%。
图3 酶解前、后β-葡聚糖的溶解度
Fig.3 The solubility of β-glucan before and after enzymatic hydrolysis
2.4 分子质量分布
基于本课题组前期研究，β-葡聚糖的分子质量为6.09×106 u，Mw/Mn 为1.38[31]。经过酶解后，β-葡聚糖分解成不同片段，其分子质量分别为2.99×106，6.68×104 u 和1.40×104 u，Mw/Mn 分别为2.71，1.31 和1.54，这表明酶作用于β-1，3-糖苷键降低β-葡聚糖的分子质量。与本文提高溶解性方式相同，段会轲[32]使用β-1，3-葡聚糖酶水解酵母β-葡聚糖，所得到的酶解产物分子质量降至6.38×105 u和4.78×104 u 且大分子产物具有抗癌作用；也有辐照处理提高溶解性的研究，辐照处理后酵母β-葡聚糖的分子质量由175 ku 降至27.9 ku，且产物具有更好的抗氧化性和抗菌活性[33]。
2.5 粒径
β-葡聚糖的粒径变化如图5所示，与β-葡聚糖的粒径相比，水溶性β-葡聚糖的粒径向左移动，D[4，3]由67.49 μm 降低至38.25 μm，表明酶解可以减少颗粒尺寸。与Liu 等[34]研究的酶修饰猴头菇多糖结果相似，猴头菇多糖经过酶解处理粒径由396 nm 降低至122 nm。多糖的粒径与分子质量、内在黏度和物理稳定性有关，粒径降低，分子质量和黏度也会降低[35]，物理稳定性提高[36]。
图5 酶解前、后β-葡聚糖的粒径
Fig.5 Partical size of β-glucan before and after enzymatic hydrolysis
2.6 热稳定性
使用热重分析仪比较酶解前、后β-葡聚糖的热稳定性变化。由图6可知，热损失分为2 个阶段：第1 阶段为200 ℃以下，葡聚糖发生9.82%的质量损失和水溶性β-葡聚糖发生6.54%的质量损失，这是由于水分的蒸发或者水分中氢键的解析；第2 阶段为200～500 ℃，该阶段质量损失较大，β-葡聚糖和水溶性β-葡聚糖的热分解温度分别开始于249.8 ℃和241.0 ℃，而当温度达到500 ℃时，β-葡聚糖和水溶性β-葡聚糖的质量损失分别达到88.98%和69.50%。与范红梅[20]和Xu 等[37]的研究结果相似，这部分的质量损失源自β-葡聚糖和水溶性β-葡聚糖的降解。
图6 酶解前、后β-葡聚糖的热重分析
Fig.6 Thermogravimetric analysis of β-glucan before and after enzymatic hydrolysis
2.7 二级结构分析
酶解前、后的酵母β-葡聚糖红外光谱图如图7所示。样品在1 030，1 369，1 651，2 924，3 423 cm-1 处的吸收峰均为多糖特征吸收峰[38]，1 030 cm-1 处吸收峰是-COO 的C=O 的伸缩振动[39]；1 369 cm-1 和2 924 cm-1 分别属于C-H 的变角振动[39]、伸缩振动[40]；3 423 cm-1 处的宽峰是O-H 的伸缩振动[28]。2 924 cm-1 和1 369 cm-1 处的吸收峰可表明酶解后β-葡聚糖仍以β-（1，3）-糖苷键连接[26，41]。
图4 水溶性β-葡聚糖分子质量图谱
Fig.4 The molecular weight of water-soluble β-glucan
图7 酶解前、后β-葡聚糖的红外光谱图
Fig.7 FT-IR of β-glucan before and after enzymatic hydrolysis
圆二色谱是研究生物大分子结构改变的一种快速、灵敏的手段，与蛋白质的α-螺旋、β-折叠等结构有所不同，多糖多以无规卷曲等灵活的结构存在。图8显示了酶解处理前、后β-葡聚糖的结构变化，水溶性β-葡聚糖较未处理的β-葡聚糖不对称性增加，且存在正负科顿效应，表明水溶性β-葡聚糖具有高度有序的结构[42]。Forget 等[27]在比较琼脂糖与羧甲基琼脂糖时发现，羧甲基化后琼脂糖在183 nm 处的正吸收峰移动到在191 nm处，该吸收峰为α 螺旋结构，在203 nm 处出现一个新的吸收峰，与蛋白质在217 nm 处的β-折叠结构相似。在水溶性β-葡聚糖中，可看到在190 nm 和210 nm 处分别存在正吸收峰和负吸收峰，这表明其存在α-螺旋结构和类β-折叠结构。
图8 酶解前、后β-葡聚糖的圆二色谱图
Fig.8 Circular dichroism spectra of β-glucan before and after enzymatic hydrolysis
2.8 显微结构
酶解前、后β-葡聚糖得微观形态如图9所示。经过酶解处理后，β-葡聚糖得微观形态变化明显，酶解前β-葡聚糖表面较光滑，呈球状；酶解后β-葡聚糖颗粒变小，呈大小不均且杂乱无章的片状结构，这有利于其与水分子的接触，改善溶解性。
图9 酶解前、后β-葡聚糖的扫描电镜图
Fig.9 Scanning electron microscope images of β-glucan before and after enzymatic hydrolysis
3 结论
本文研究了蜗牛酶改善β-葡聚糖溶解性的工艺、产物溶解性、热稳定性与结构变化。通过单因素实验和响应面试验，得到水溶性β-葡聚糖的最佳工艺为：底物质量浓度15 mg/mL，温度45℃，时间83 min，酶添加量4.30%，该条件下水溶性β-葡聚糖的得率最高。水溶性β-葡聚糖较β-葡聚糖的溶解性显著提高，分子质量降低，热稳定性增加；红外光谱分析表明，水溶性β-葡聚糖与β-葡聚糖图谱相似，仍以β-1，3-糖苷键连接，圆二色谱表明，水溶性β-葡聚糖的不对称性增加；SEM表明β-葡聚糖经过酶解后表面遭到破坏，更利于与水分子的接触。β-葡聚糖溶解性的改善为其在食品、药品、化妆品中的应用提供理论基础。
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