近年来，食品领域相关检测技术不断发展，其中无损检测技术因检测时不会对被测物品造成损伤，且具有高效、经济等特点而得以广泛应用[1]。目前常用的光学无损检测技术包括近红外光谱技术、振动光谱技术、高光谱成像技术、拉曼光谱技术等[2]。从应用现状来看，上述技术均存在一定的局限性，例如近红外光谱技术因仪器零件不精密、缺少一致性设计而难以建立稳定模型[3]；振动光谱技术灵敏度较低，需要较多的校准装置才可准确检测食品质量[4]；高光谱成像技术对检测环境要求较高、仪器不便携，难以用于现场快速检测，且所得数据冗余，不能及时获取有效信息[5]；拉曼光谱技术在光谱预处理和建立数学模型等方面仍需结合化学计量学才能达到检测效果[6]。
生物散斑技术作为一种新兴的无损检测技术，因其设备简单，能够实时处理并定性或定量地反映被测物品的生物或物理信息，故在食品领域有广泛应用。本文介绍生物散斑技术的原理及散斑图像分析方法，综述该技术在食品领域中的应用及未来面对的挑战，为生物散斑技术的进一步开发及应用提供参考。
1 生物散斑技术概述
生物散斑技术检测过程高效、经济，成像装置简单[7]，与其它光学技术相比，生物散斑技术的主要优势在于能通过测量光照射被测物品后所发生的变化来描述被测物品的生物活性区域，提供多光谱技术难以观察获得的信息[8]。在激光波长、观察距离、统计方法等参数相同的条件下，生物散斑图像的强度、对比度和斑点颗粒大小（亮斑大小）取决于被测物品表面及内部的状态[9]。因此，生物散斑图像可以看作是被测物品组织表面及内部的指纹图谱[10]。
1.1 基本原理
生物散斑技术是一种由激光照射到被测物品，从而发生折射与反射来反映被测物品各种信息的光学无损检测技术[11]。当激光照射到生物组织时，它会随机发生向各个方向的散射、吸收或透射等现象，如图1所示。这些现象取决于入射光的波长和被测物品的材料特性[12]，据此形成高对比度的颗粒状图像，称为生物散斑图像[13]。根据散斑图像将生物散斑技术分为两类[14]：一是，只获取一幅图像，经图像分析得出结果的称为静态生物散斑，如图2a 所示；二是，以拍摄视频的形式获取图像序列并对其进行定性或定量分析的称为动态生物散斑，如图2b 所示。常规图像处理方式都可采用静态生物散斑进行分析，而动态散斑的视觉外观类似于沸腾液体的表面，其复杂的现象可通过量化散斑图像随时间变化的方法来表征生物变化。生物散斑图像的变化被定义为生物散斑活性，其与被测物品表面及内部组织状态密切相关[15]。
图1 激光与被测物品间的相互作用
Fig.1 The interaction between the laser and the object
图2 生物散斑图像
Fig.2 Images of biological speckles
1.2 技术装置
生物散斑技术的装置结构相对简单，主要包括激光发射器、相机及计算机（图像处理系统）。如图3所示，根据激光发射装置与相机的位置，可分为反射型和透射型两种[16]：反射型装置中激光发射器与相机在同侧，相机接收由物体反射的光线。另外，根据检测情况可加入镜子、扩束镜等装置以获取较佳的图像效果[17]。反射型装置多用于固态或半固态样品的检测，如苹果[18]、种子[19]等；而透射型装置中相机置于样品后侧，可以接受激光穿透样品的光线，因此待测样品的厚度越小透射成像效果会越好[20]。透射型装置应用相对较少，主要用于非固态样品的检测，如鉴定液体培养基中微生物的种类[21]、监测种子根部生长情况[22]等。检测前需对激光波长、样品与相机的距离、角度及相机光圈等进行设置，一般静态散斑图像会受光入射角度的直接影响，而动态散斑图像则与该角度无关[23]。
图3 生物散斑技术装置
Fig.3 Biological speckle technology devices
1.3 生物散斑图像分析方法
分析生物散斑图像的方法分为定性分析和定量分析，其中定性分析方法包括Fujii 法、时间差分法（TD）、激光散斑空间对比分析法（LASCA）、激光散斑时间对比分析法（LASTCA）等；定量分析方法包括惯性矩阵法（IM）、绝对值差分法（AVD）、广义差分法（GD）等。
1.3.1 Fujii 法 Fujii 法是通过计算相邻时间的图像间各点灰度值强度差的加权和，反映不同点强度差的变化[24]，计算公式如下：
式中：D（n）——强度差的和；I——某一帧的灰度值，如It（i1）为t 时刻i1 点的灰度值；n——生物散斑图像总帧数；t——不同的帧数，取值范围为1～n。
1.3.2 时间差分法（TD） TD 法可按照时间顺序记录生物散斑图像，通过计算连续时间内图像的绝对差值得到处理图[25]，计算公式如下：
式中：It （x，y）——t 时刻（x，y） 位置的像素值；n——总帧数；t——不同帧数，取值范围为1～（n-1）。
1.3.3 激光散斑空间对比分析法（LASCA） 多图像分析会降低图像的分辨率，而LASCA 法可进行单图像分析并快速地绘制出生物散斑图像，因此其主要优点是所需数据量较少，仅由一幅图像即可获得处理图；其缺点是一旦相机的曝光时间设置不当则很难得到效果较好的处理图，且处理图清晰度不高[26]。
1.3.4 激光散斑时间对比分析法（LASTCA） LASTCA 法是分析生物散斑图像中的所有像素点在一段时间内的变化从而获得对比图象，且所得图像分辨率是LASCA 的5 倍[27]。
1.3.5 惯性矩阵法（IM） IM 法是对一幅时间序列生物散斑图像形成共生矩阵，计算公式如下：
式中：N——I1 值后面接着出现I2 值的次数；I1、I2——像素点的灰度值。时间序列生物散斑图像反映的是生物散斑中的局部信息，如某一行/列的散斑随时间的变化，在此基础上形成的共生矩阵则通过将N 值赋给其中第I1 行、第I2 列元素的计算来表征生物活性[29]。
1.3.6 绝对差分法（AVD） AVD 法通常可替代IM 法，基于差异总和作为主要信息，再结合IM 法能够放大时间的历史变化[28]，计算公式如下：
式中：I1、I2——像素点的灰度值；COM[I1，I2]——对应的共生矩阵。
1.3.7 广义差分法（GD） GD 法是对图像中所有像素点进行统计处理，不同帧数下各点灰度值变化越大，则强度差越大，计算强度差的和就能得到各点之间强度变化的差异[18]，计算公式如下：
式中：DG——强度差的和；i1、i2——图中像素点的顺序编号；xi1、xi2——i1、i2 像素点的坐标，取值范围为0～（n-1）；n——生物散斑图像的总帧数。
2 生物散斑技术在食品领域中的应用
2.1 水果品质评价
利用相关图像分析方法分析随时间变化形成的生物散斑图像即可对水果进行无损质量评价[30-31]。Vega 等[32]采用生物散斑技术在1 min 内对30 个具有损伤的苹果和梨的样本进行检测，并分析了生物散斑图像的变化。结果表明，苹果和梨损伤前生物散斑活性较高，损伤后散斑活性即刻降低；Yan 等[33]采用生物散斑技术对苹果的受损部位进行检测，采用了Fujii、GD、LSTCA 3 种方法对散斑图像进行分析。结果表明，3 种分析方法获得的散斑强度均随受损时间的延长而减小，说明受损部位的生物散斑活性随受损时间的推移而降低。Blotta 等[34]用钢球撞击苹果模拟苹果所受的机械损伤，根据生物散斑技术所获得的散斑图像可知，苹果样品损伤部位呈高强度灰色，而未受损伤的部位呈中强度灰色，灰色强度越高说明该部位生物散斑活性越高。Ansari 等[35]也采用生物散斑技术测定并计算了苹果贮藏过程中果实新鲜度和生物散斑活性的相关系数，结果表明苹果样品的新鲜度与生物散斑活性有较强的相关性，其相关系数为0.98。因此，生物散斑技术能够用于水果品质的评价。另外，Szymanska 等[36]利用生物散斑技术对收获前的苹果进行监测，并且测定了苹果的硬度、酸度、淀粉和可溶性固形物含量。结果表明，随着苹果不断成熟，其中的可溶固形物增加，淀粉和硬度略有下降，生物散斑活性增加。苹果的生物散斑活性与可溶性固形物含量、淀粉含量和硬度的相关系数分别为0.91，-0.80，-0.89，该结果表明生物散斑活性与可溶性固形物含量、淀粉含量和硬度存在较强的相关性。该方法有潜力用于收获前期对苹果品质的无损评价，并且可用于对苹果采收日期的预测。刘家玮等[37]利用生物散斑技术研究了无损鲜枣和损伤枣的图像散斑活性随时间变化的规律，结果表明，枣的生物散斑活性不仅随贮藏时间发生较大变化，而且无损鲜枣和损伤枣的变化趋势存在显著差异。因此该法可用于枣的品质分级，并有望用来对其它类果蔬进行品质分级。
变粉是水果后熟过程中品质劣变的现象之一，通常表现为咀嚼时口感柔软、口干、粒状或粉状[38]。Arefi 等[39]利用生物散斑技术对苹果的粉状度进行检测，他们将540 个苹果样品在（0±1）℃、相对湿度（85±5）%条件下贮藏，然后分别于第0，30，60，120，150 天在680 nm 和780 nm 的波长处对样品进行生物散斑图像的采集，并且对苹果硬度和多汁性进行测定。结果表明在680 nm 波长所获得的生物散斑活性更高，并且新鲜苹果的生物散斑活性高于粉状或半粉状苹果的生物散斑活性。贮藏5 个月后的苹果，其酸味和硬度也显著降低，据此建立了生物散斑技术在水果粉状度检测的方法。
2.2 肉类成熟过程中品质评价
生物散斑技术可作为肉类成熟过程中品质评价的有效工具，特别是在嫩度和色泽方面具有很大的潜力。Maksymenko 等[40]采用生物散斑技术对屠宰后猪肉及鸡肉的肌肉组织结构变化进行了评估，研究了在-4～4 ℃贮藏条件下猪肉（贮藏144 h）和鸡肉（贮藏48 h）生物散斑活性以及肌肉组织的降解情况。结果表明，生物散斑活性的降低与肌纤维断裂、核变形、核染色质减少及线粒体受损有关，生物散斑活性系数可作为肌肉组织结构变化的定量指标。Amaral 等[41]采用生物散斑技术对月龄为21 d 的牛胸长肌样品进行检测并测定其剪切力和颜色，结果表明剪切力与生物散斑激光具有相关性，其相关系数为0.6146。此外，牛肉样品在空气中暴露30 min 后测得生物散斑图像与其中高铁肌红蛋白含量变化的相关系数为-0.9119，说明生物散斑技术具有评价肉色品质的潜力。由于不同解剖学部位的肌肉质构特性差异较大，因此不能用同一个生物散斑活性模型对所有肉质进行分析。针对此问题，董庆利等[42]分别采用斜率/截距法（S/B）和Kennard-Stone（K-S）样本添加法来改进已建立的一种预测模型，并将所得模型应用于牛里脊肉和牛腱子肉的质构分析。结果表明，基于K-S 样本添加法改进的模型能够提高生物散斑技术对肌肉质构特性的分析精度。该团队的研究同时说明可采用不同方法来强化生物散斑技术的分析结果，例如金曼等[43]在使用生物散斑技术的同时结合了三维成像来分析牛肉的硬度、咀嚼性等质构特性，其预测相关系数分别可达到0.9444 和0.9288，增强了生物散斑技术的预测效果。
2.3 水果蔬菜成熟度检测
果实成熟过程中的细胞质流动、细胞器运动、细胞生长和分裂以及生化反应等过程都会对生物散斑活性产生影响[44]，因此生物散斑技术可应用于水果蔬菜成熟度的检测。例如Romero 等[45]探讨了生物散斑技术在测定不同品系番茄成熟度的有效性，通过分析随时间变化的生物散斑图像、散射光的强度以及散斑图像的平均灰度确定各品系番茄成熟度的差异。此外，基于生物散斑活性与水果硬度、淀粉含量、总可溶性固形物含量间的高度相关性，并结合其它成熟度指标可以建立水果蔬菜成熟度的无损检测方法，确定其最佳的采收期[46]。Nassif 等[47]通过建立散斑图像反映绿梨内部葡萄糖水平，结果表明葡萄糖浓度越高图像中斑点越小。Rabelo 等[48]通过对柑橘果实的散斑图像分析，并对其进行量化，然后研究其与总可溶性固形物、总酸度、穿透力和贮藏期等参数的相关性。结果表明，在成熟过程中，这些数值均呈下降趋势，证明量化后数值可以作为果实品质和成熟度的指标。吴海伦[49]基于生物散斑技术建立对中熟品种和晚熟品种苹果采摘后和贮藏期间硬度、可溶性固形物等品质指标的预测模型，确定650 nm 波长、20 mW 功率的半导体激光光源所得散斑效果最好。同时，借助生物散斑技术建立的模型，研制出一种苹果无损检测分级仪器，这对采后苹果分级、保证苹果质量以及提高苹果经济效益等方面都有着重要意义。此外，生物散斑技术可检测水果的整体情况，对确定贮藏条件和货架期也具有一定的指导作用[50]。
2.4 微生物检测
生物散斑技术还可应用于微生物的检测。Pieczywek 等[51]分别用生物散斑、高光谱成像和叶绿素荧光3 种方法对苹果在贮藏过程中假单胞菌污染情况进行检测，可视化的生物散斑活动空间揭示了苹果中假单胞菌的变化情况，且比超光谱成像更加精细，比叶绿体荧光法更早地检测出微生物的污染。采用惯性矩阵频率值分析能够加强生物散斑技术在微生物检测的应用，Rabelo 等[52]结合了惯性矩阵和时空散斑信号的频率值对黄孢杆菌、稻瘟菌及刺孢杆菌污染的大豆种子的生物散斑图像进行分析，通过频率分析能够使生物散斑技术所提供的大豆种子微生物污染的相关信息更加完整。此外，Viana 等[53]在监测苹果醋发酵过程时也采用了该技术，不仅很好的检测出相关微生物的数量，而且减少了混合接种发酵过程中检测微生物时原有的繁琐步骤。可见，生物散斑技术在微生物检测环节中可节约能源和减少投资。
3 结语
生物散斑技术作为一种新型无损检测技术以其快速、实时、低成本等优势被广泛应用于农业、医学等领域，特别是在水果品质评价、肉类成熟过程中品质评价、水果蔬菜的成熟度检测以及微生物检测等食品领域的应用也日益增多。生物散斑活性与生物组织密切相关，利用该技术进行定性或定量的无损检测，快速确定农产品的采收期，对食品进行品质分级，实现生产和贮藏全程实时控制等，这些对保证食品的质量及安全具有重要意义。
目前生物散斑技术还存在一定的局限性：1）生物散斑激光光源选择不当会导致系统光路冗余，测量结果误差较大，若能减少系统光路则有利于系统可移植性的提高[54]。常见的激光发射器有氦氖激光器，该设备具有工作性质稳定、使用寿命较长的特点，但传输性能较差；另有二极管激光器，该设备具有多种波长，且体积小、可节约成本，但其输出功率小，线性差、单色性不太好。因此，激光发射器是获得优质生物散斑图像及分析结果的关键，选择适当的激光发射器是提高生物散斑技术在不同产品中适用性的根本。2）此外，生物散斑图像会因试验所选相关参数的不同而产生较大差异，因此在使用生物散斑技术过程中相关参数需要进行优化[55]，加强该项技术的稳健性及动态性能有利于提高其检测准确度。3）虽然生物散斑技术适用性相对较强，但缺乏标准仍是限制其应用的主要因素。目前为止还没有一种通用的检测方法或独立稳定、便于携带的设备能应用到食品领域中的各项检测。4）被测物品自身特性会影响生物散斑激光的穿透力从而限制其检测深度，这就导致一些果实核心的生物散斑图像难以绘制。图像分析技术的改进和数据处理能力的提升均有利于最大限度地避免相关干扰，因此需要从硬件和软件进行双向优化以突破生物散斑技术的局限性，从而进一步推动生物散斑技术在食品领域以及其它更多潜在领域中的应用。
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