植物油容易发生氧化，导致油脂变质。植物油品质劣变的主要原因是自动氧化，其被公认为是一种由自由基引发的链式反应。根据自由基理论，整个氧化过程中伴随着自由基的传递、引发以及含量的变化[1-4]。在自由基链式反应进程中，先生成烷基自由基 （R·），R·与O2 反应生成过氧化自由基（ROO·），ROO·传递链反应，形成大量氢过氧化物（ROOH），ROOH 容易发生氧化分解反应形成次级氧化产物（醇、酸、酮和醛等），从而导致油脂酸败变质[5-8]。
电子顺磁共振 （Electron paramagnetic resonance，EPR）是一种可直接测定自由基种类和含量的方法[9-11]。油脂氧化产生的自由基特别活泼，周期性短暂，需通过自旋加合物（自旋捕获剂与自由基反应所生成）来测定，常用的捕获剂有N-叔丁基-α-苯基硝酮（PBN）和5，5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物（DMPO）[11-13]。目前，EPR 在食品领域主要用于食用油的自由基监测[11-15]，以及食品抗氧化能力的评价等[16-18]。Raitio 等[11]通过EPR 方法研究半固态棕榈油早期氧化的特点。结果表明，半固态棕榈油在50 ℃下贮藏7 d 的过程中，产生的自由基与次级氧化产物的形成呈正相关。李培等[13]研究了花生油加速氧化过程的自由基变化，结果表明，加速氧化过程中自由基含量由大到小为R·>RO·>ROO·。Chen 等[14]利用EPR 研究了温度对棕榈酸热氧化的影响。采用烷基和烷氧基自旋加合物模拟试验光谱，发现棕榈酸从175 ℃到180 ℃的氧化速率迅速增加，表明棕榈酸在一定温度下的热氧化是由自由基生成所致。Ottaviani 等[15]采用EPR 方法研究黑孜然籽油、芫荽籽油和小葵籽油中不同组分对自由基的清除能力，评估3 种油脂中不同成分的抗氧化能力。核磁共振氢谱（1H NMR） 能够提供油脂脂肪酸中不同质子氢的化学位移，它利用不同的质子氢与相应的脂肪酸建立起对应关系，可快速、准确测定油脂样品中各质子氢的含量[19-20]。这项技术提供了关于油在热变质过程中产生的许多变化的信息，不仅涉及酰基的降解，而且涉及各种氧化产物的形成和降解。
本文以4 种常见的植物油为研究对象，采用EPR 结合1H NMR 技术研究其在室温氧化过程中产生的自由基种类、总量以及各类自由基的变化情况。同时解析不同植物油中不饱和脂肪酸的1H NMR 在氧化前、后的变化，以期为植物油的自动氧化自由基变化提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
4 种植物油分别购于国内4 家油脂生产企业，均声称未添加任何抗氧化剂，具体信息如表1所示，主要脂肪酸组成如表2所示。不同油脂的主要脂肪酸组成不同，其中亚麻籽油中主要脂肪酸是亚麻酸；花生油中主要是油酸和亚油酸；葵花籽油中主要是亚油酸；油茶籽油中主要是油酸。
表1 样品信息
Table 1 Information of oil samples
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表2 4 种植物油主要脂肪酸组成（%）
Table 2 Composition of fatty acid in 4 vegetable oils （%）
注：“-”为未检出。
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异辛烷、冰乙酸、碘化钾、硫代硫酸钠、氢氧化钾、四甲基硅烷（TMS）、氘代氯仿（CDCl3）、DMPO（纯度97%）等均为分析纯级，天津科密欧化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
EMX plus-10/12 电子自旋共振波谱仪，德国布鲁克（Bruker）公司。主要技术参数：磁场强度为磁极距72 mm 时，最大1.45 T；扫场分辨率为128 000 点；微波频率为X-波段，9.2～9.8 GHz；灵敏度为1.5×109 自旋数/G；液氮变温为100～700 K；液氦变温为1.8～300 K。
Bruker Avance Ⅲ型核磁共振波谱仪，瑞士布鲁克（Bruker）公司。规格：500 MHz；技术参数：1H分辨率为0.45 Hz。
1.3 试验方法
1.3.1 EPR 分析 准确称量一定的DMPO，采用甲苯溶解，使其终浓度为2.0 mol/L，置于-20 ℃中避光密封保存，待用。
分别取3 mL 的亚麻籽油、葵花籽油、花生油和茶籽油于50 mL 小烧杯中，使其暴露在空气中，在室温下自然氧化，每隔1 d 取200 μL 样品置于核磁管中，加入20 μL 配好的DMPO 溶液，置于EPR 仪器谐振腔内，采用如下检测参数模式进行检测。
EPR 仪器的检测参数：中心磁场为3 350.00 G，扫场宽度为100.00 G，扫场时间为20.0 s，微波功率为3.99 mW，调制幅度为1.000 G，转换时间为10.00 ms，加热温度为373.15 K。然后打开高纯氮气流并开始加热，待谐振腔温度稳定后，将核磁管置于谐振腔中，同时开始计时，每隔24 h 测定1次。
1.3.2 NMR 分析 将亚麻籽油、葵花籽油、花生油和油茶籽油暴露在空气中 （模拟家用存储条件），在室温下自然氧化，取氧化前和氧化10 d 后的样品进行1H NMR 谱测定。分别取20～50 μL 的亚麻籽油、葵花籽油、花生油和茶籽油置于直径5 mm 核磁管，以500 μL 氘代氯仿溶解，溶剂内含0.03%四甲基硅烷作为内标，混合均匀进行检测[21-22]。
1H NMR 测定条件参考杨登辉等[19]方法。具体参数为：每次测定都进行调谐和匀场，温度为297.3 K，工作频率为400.13 MHz，采集时间为4.0895 s，光谱宽度为8 012.82 Hz，扫描16 次，空扫2 次。
1.3.3 过氧化值的测定 过氧化值的测定参考GB 5009.227-2016 《食品安全国家标准食品中过氧化值的测定》[23]。
1.4 数据处理与分析
EPR 谱分析：自由基的自旋朗德因子（g 值）为自由基谱图中心点，通过Xenon 软件点击谱图中心点可以直接读出g 值，脂类自由基的g 值都在2.0 附近。然后对样品的自由基谱图进行基线校正，校正后进行二次积分，使用Xenon 软件自带的自旋定量功能，可得到该样品的自旋总数和自由基浓度。通过Xenon 软件中的自旋拟合（Spin fit）功能对样品的试验谱图进行计算机拟合，得到与试验结果相匹配的拟合结果，并以此为根据判定样品中自由基的种类并进行相对定量。
1H NMR 谱图使用Topspin 软件进行处理，以四甲基硅烷内标物的峰作为化学位移零点，谱图处理时以TMS 定位，谱图经校正零点后标峰，并读出峰面积。
所有试验均重复3 次，结果用“平均值±标准差”表示。采用SPSS 20.0 软件进行数据分析，Origin 9.0 软件绘图。
2 结果与分析
2.1 4 种植物油室温氧化过程中过氧化值变化分析
过氧化值表示油脂和脂肪酸等被氧化程度的一种指标，过氧化值越高其酸败就越严重。在自由基链式反应中，一般来说，多不饱和脂肪酸比单不饱和脂肪酸的反应性更强。根据经典的润滑脂理论，亚油酸的自氧化率约为油酸的10 倍，在0 ℃或更低的温度下，亚油酸酯可被空气氧化。4 种植物油室温氧化过程中过氧化值变化结果见图1。
图1 4 种食用油室温氧化中的过氧化值变化情况
Fig.1 Peroxide values changes of 4 vegetable oils at room temperature
由图1可知，这4 种植物油按氧化速率排序为：亚麻籽油＞花生油＞葵花籽油＞油茶籽油。从自由基生成的角度来看，虽然亚油酸产生自由基的速度比油酸快，但两者之间的差异小于10 倍。在4 种油中，葵花籽油和茶籽油的过氧化值变化趋势相对较小。在油脂的自动氧化过程中，R·主要存在于自动氧化的链传递阶段，在这一阶段不饱和脂肪酸中双键旁亚甲基上的氢被夺取，形成大量的R·，由此，脂肪酸中的不饱和碳碳双键越多，氧化时生成R·就越多，油脂就越容易氧化。
2.2 4 种植物油室温氧化过程中自由基分析
2.2.1 植物油室温氧化过程中自由基种类分析4 种植物油室温氧化的谱图如图2所示，从上到下依次是试验谱图（Exp）、拟合谱图（Simu）及4 种拟合出的自由基谱图。
图2 4 种植物油室温氧化的EPR 图谱
Fig.2 EPR Spectra of four kinds of vegetable oils oxidized at room temperature
由图2可以看出，4 种植物油EPR 试验谱图与拟合谱图二者基本一致，拟合效果良好。进一步拟合分析得出4 种自由基加合物分别是烷基自由基加合物（Alkyl radical adducts，ARA）、烷氧自由基加合物（Alkoxyl radical adducts，AORA）、烷过氧自由基加合物 （Alkyl peroxyl radical adducts，APRA）以及DMPO-X（一般被认为是DMPO 发生氧化后产生的自由基）。
如表3所示，根据4 种植物油的超精细耦合分裂常数（αN，αH），确定这些加合物分别是DMPO-X、R·、RO·、ROO·。
由图2和表3可知，4 种植物油在室温氧化过程中除油茶籽油外，其它植物油均产生了4 种自由基。而油茶籽油中只检测到3 种自由基，分别是DMPO-X、RO·、ROO·。油茶籽油中可能含有极少量的R·，由于其含量过低与基线无异，难以拟合。Novakov 等[24]研究了体内测定大鼠肝和肺提取物中的烷基自由基（R·），而未观察到可检测的烷基自由基，这是由它们的低稳态浓度所致[25]。
表3 DMPO 捕获的自由基EPR 参数
Table 3 EPR parameters of radical adducts to DMPO
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2.2.2 4 种植物油室温氧化过程中自由基含量变化分析 4 种植物油的自旋总数随时间的变化见图3。
由图3a 可以看出，容易氧化的亚麻籽油在第1 天时信号强度是4 种油中最低的，到第5 天时，信号强度降到最低。可能是由于亚麻籽油中最主要的脂肪酸是亚麻酸，相对活跃，引发的自由基在短时间内相互结合转化为氧化产物，导致DMPO捕获到的自由基的量偏少[12]。花生油在第5 天时其信号强度处于最低，这和亚麻籽油比较相似。而葵花籽油和油茶籽油的波动幅度总体处于一个较低的水平。4 种植物油初始信号强度的变化趋势不同，这是由于植物油中的脂肪酸种类和含量不同所致。4 种植物油中自由基含量在贮藏过程中是不断变化和波动的，说明油脂氧化在不断进行[26]。
由图3b 可以看出，亚麻籽油中波动最明显的自由基是DMPO-X，含量最多的也是DMPO-X。在0～6 d 时其自旋总量不同，样品的自旋总量基本保持在较低水平。在6～7 d 时，所有自由基的自旋总量突然急剧增加。这可能是由于DMPO 容易受到O2 影响，不断发生反应表现出波动的状态。到第10 天时均略有下降，这可能是由于新形成的自由基可以与稳定的自旋加合物发生反应，从而导致信号强度减弱[27]。而烷氧基在整个氧化过程中都是在一个比较低的范围内波动。由图3c 可以看出，葵花籽油中含量最多的自由基是RO·，而且在氧化第1 天后含量急剧增加，在第2 天时又下降，处于一个不稳定的状态，这可能是由于氧化反应进一步加深，氢过氧化物不断分解所导致[9，28]。其它3 种自由基一直维持在一个较低的水平上。由图3d 可以看出，花生油中自由基按相对含量从高到低排序为DMPO-X＞RO·＞R·＞ROO·。而且在氧化过程中RO·的数量在大幅度波动，在1～2 d急剧上升，在3～4 d 时又呈下降趋势。RO·在第4天之后一直呈现缓慢上升的趋势，表明花生油正处于氢过氧化物二次引发阶段[28]。由图3e 可以看出，油茶籽油中的自由基主要是由R·组成，DMPO-X 的量次之，ROO·的量最少，而且在氧化前期R·的含量非常少以至于无法拟合，这与之前的EPR 图谱相吻合。RO·一直处于动态变化中，可能原因是链式反应中氢过氧化物的分解。仅在氧化第9 天开始出现R·且含量与ROO·相差无几，基本处于同一水平。
图3 4 种植物油自旋总数随时间的变化
Fig.3 Changes of the total amounts of spins of four vegetable oils with time
2.3 4 种植物油室温氧化前、后的1H NMR 分析
核磁共振氢谱1H NMR 是阐明脂质初级和二级氧化产物分子结构最常用的方法，它能提供化合物分子中氢原子的信息，可以分析油脂组成成分，探讨油脂氧化过程中脂肪酸的变化等[29]，这对于全面认识氧化过程和氧化机理意义重大。通过在氧化过程中监测脂质分子反应位点的质子峰，1H NMR 可用于评估脂质氧化状态，解析主要1H NMR 谱的化学位移信号的归属信息，见表4[30]。
表4 食用油核磁共振氢谱中各峰的归属
Table 4 Signals of the 1H NMR spectra edible oil
峰符号 化学位移/ppm 氢核 质子的功能基团A?0.75～0.95 -CH3 除亚麻酸甘油酯基以外的所有端甲基B 0.95～1.03 -CH3 亚麻酸甘油酯中的端甲基C 1.10～1.52 -（CH2）n- 酯链中其余的亚甲基D 1.52～1.70 -OCO-CH2-CH2- 羰基β 位质子基E 1.90～2.24 -CH2-CH＝CH- 烯丙基质子（所有不饱和脂肪酸）F 2.24～2.50 -OCO-CH2- 羰基α 位质子基G 2.60～2.96 CH＝HC-CH2-CH＝CH 双烯丙基质子氢（多不饱和脂肪酸）H 4.00～4.50 -CH2OCOR 甘油骨架的sn-1 位置I 5.23～5.28 ＞CHOCOR 甘油骨架的sn-2 位置J 5.28～5.60 -CH＝CH- 所有不饱和脂肪酸（烯烃氢）
2.3.1 亚麻籽油氧化前、后1H NMR 谱 亚麻籽油氧化前、后1H NMR 谱见图4。
亚麻籽油和花生油的NMR 图谱变化趋势基本一致，以亚麻籽油的NMR 图谱为例，如图4所示。光谱在信号B 处是亚麻酸末端-CH3 上的H，信号A、C、E 和A、G 分别与油酸、亚油酸含量有关[31]。结果表明，样品的烯丙基质子（E）、二烯丙基质子（G）和烯质子（J）的信号强度都有衰减。据报道，烯烃质子与样品中不饱和酯的含量有关。表明在室温氧化降解过程中不饱和酯含量减少。同时，烯烃脂肪酸链与氧分子反应良好，证实了样品的降解[32]。同时花生油的不饱和脂肪酸（G）的信号积分区域明显低于亚麻籽油的，由此可知，花生油相比于亚麻籽油具有较高的稳定性。在室温氧化10 d后，两种油中并未检测到主要的二级氧化产物醛（δ=9.2～9.9）的特征信号峰，说明氧化正处于初级阶段。
图4 亚麻籽油氧化前（a）和室温氧化10 d 后（b）的1H NMR 谱
Fig. 4 1H NMR spectra of linseed oil before oxidation （a） and after 10 d oxidation at room temperature （b）
2.3.2 葵花籽油氧化前、后1H NMR 谱 葵花籽油氧化前、后1H NMR 谱见图5。
葵花籽油和油茶籽油的NMR 图谱变化趋势基本一致，以葵花籽油的NMR 图谱为例，如图5所示。与亚麻籽油和花生油相比，葵花籽油整体信号强度均有降低。可以看出，随着氧化时间延长，亚油基酰基（A 和G）对应的信号强度减弱。因此，在图5可观察到以δ=1.90～2.24 为中心的双烯丙基质子信号强度的下降，这主要是由于亚油基酰基所致[33]。根据María 等[34]的研究表明，亚油基酰基的降解速度略高于油酸的降解速率，PV 值的增长趋势也符合这一规律。同时在油茶籽油中，信号强度在δ=1.5 附近增加，这可能是由于与叔碳结合的氢原子浓度增加所致；后者可在交联反应中产生，在不同的酰基链之间形成碳碳键，导致聚合物的形成[34]。样品的烯丙基质子、二烯丙基质子和烯质子的信号强度变化都很小，说明氧化降解的速率和产量都很低。同样的，在这两种油中也没有检测到氢过氧质子和二级氧化产物的特征信号，氧化处于初级阶段，比较缓慢。
图5 葵花籽油氧化前（a）和室温氧化10 d 后（b）的1H NMR 谱
Fig. 5 1H NMR spectra of sunflower seed oil before oxidation （a） and after 10 d oxidation at room temperature （b）
3 结论
亚麻籽油是4 种植物油中最易氧化的，其在室温氧化时主要形成4 种自由基，按含量排序为DMPO-X＞RO·＞R·＞ROO·。花生油的氧化速度仅次于亚麻籽油，且其氧化自由基含量排序与亚麻籽油相似。葵花籽油的氧化速度略慢于花生油，其自由基含量排序为RO·＞DMPO-X＞R·＞ROO·，且在氧化前期主要是烷氧自由基的含量在大幅度波动，其它3 种自由基一直维持在一个较低的水平。油茶籽油稳定性最高，其氧化自由基组成类似葵花籽油，主要是RO·，DMPO-X 次之，ROO·的量最少，且在氧化前期R·的量少以至于无法拟合。总得来说，通过1H NMR 对4 种植物油的室温氧化自由基进行分析，得出氧化前、后氢质子化学位移信号并没有发生变化，而氧化前、后各特征峰的峰面积所占比例均有不同程度的变化。这与自由基链式反应的引发、传递阶段变化情况一致。并且通过EMR 和1H NMR 分析，发现自由基种类和含量与脂肪酸组成相关，且自由基增长速度差别较大，与油脂的脂肪酸组成特征相吻合。在后续研究中，还需要结合自由基链式反应的不同阶段，探究自由基变化与氧化产物的关系。
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