扇贝又名海扇，是我国沿海主要养殖贝类之一，属于典型的高蛋白质生物资源[1]。其较为明显的腥味影响大部分消费者的接受度，也不利于精深加工。扇贝采用滤食性捕食方式，能富集生长环境中大量复杂的微生物菌群，其中超过50%丰度的细菌未被鉴定出来[1]，这是扇贝养殖、贮藏、加工等环节潜在的生物性安全隐患。臭氧被证实是一种高效的经济型灭菌方式，可在较短时间内明显减少菌量或抑制贮藏期间的微生物增殖[2]。水产品的腥味物质主要由内源酶降解、脂质氧化、微生物生长、饮食或环境污染等产生[3]，如碱性氨基酸在酶催化和转化作用下生成具有异味的δ-2 氨基戊酸、δ-2 氨基戊醛和六氢吡啶等成分[4]。脂肪氧合酶降解多不饱和脂肪酸产生2，4-癸二烯醛、2，4，7-癸三烯醛等不良气味[5]，而不同水产品的嗅觉腥味与其挥发性物质组成及其含量密切相关。脱腥处理可分为物理法、化学法及生物法等，物理和化学方法成本较高，对风味等品质损害较大或存在安全隐患；生物脱腥是利用微生物代谢或微生物酶作用，对小分子异味物质进行分子结构修饰或转化成其它物质，实现有效脱除异味[6]。乳酸菌及酵母菌都有良好的生物脱腥作用，是常用的生物脱腥菌种。适宜的乳酸菌应具有良好的产酸性，且具有脱羧酶阴性、明胶液化阴性、胺氧化酶阳性、产H2S 及H2O2 阴性、能产生良好风味等基本特征[7]。不同微生物的代谢路径及机制不同，其发酵脱腥效果及风味也存在差异。现有研究大多应用在鱼类及其制品上，如用安琪酵母[8-9]和植物乳杆菌[10-11]对鱼类产品进行发酵脱腥，主要是脱除辛醛、庚醛、苯甲醛、庚醛、己醛、1-辛烯-3-醇等醛类物质，尤其是去除烯醛类、二烯醛类物质作用，而具有奶香气味的己酸、2，3-丁二酮、乙偶姻、3-甲基-1-丁醇、十二酸乙酯、十四酸乙酯等物质含量增加，从而实现生物脱腥效果。目前鲜有针对扇贝进行脱腥处理及挥发性风味成分的报道。本课题组前期采用混菌发酵技术对海带进行脱腥处理，取得良好效果[12]。本文利用臭氧进行减菌预处理，联合乳杆菌和酿酒酵母对扇贝进行复合发酵生物脱腥，研究微生物发酵脱腥对扇贝原料挥发性风味的影响，为扇贝精深加工提供技术参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 原料
1.1.1.1 菌种 副干酪乳杆菌副干酪亚种RP38（Lactobacillus paracasei subsp.paracasei）和酿酒酵母JJ4（Saccharomyces cerevisia），福建省农产品（食品）加工重点实验室分离并保藏。
1.1.1.2 扇贝 养殖于漳州海域，收获后速冻至-18 ℃，由福建乐隆隆食品科技有限公司提供。
1.1.2 培养基
1.1.2.1 MRS 液体培养基 用于乳酸菌活化、扩培。
1.1.2.2 糖蜜培养基 将糖蜜稀释至可溶性固形物至5%，用柠檬酸调节pH 值至5.0±0.2，115 ℃高压灭菌30 min。用于酵母菌活化、扩培。
1.2 仪器与设备
GC-2010 气相色谱、GCMS-TQ 8040 质谱，日本岛津公司；KMSY-5G 臭氧发生器 （臭氧产量5 g/h，出气量10 L/min），青岛科美力创净化设备有限公司；SPME 装置手柄、固定搭载装置、50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取头，美国Supelco 公司；SYG-2 数显恒温水浴锅，常州朗越仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 种子液制备[12] 乳酸菌RP38 和酿酒酵母JJ4 经两次活化，分别扩培至菌量达1.0×109 CFU/mL 和5.0×108 CFU/mL 以上，以4 800 r/min、4 ℃离心5 min，取菌坭洗脱2 次，备用。将菌种RP38 用等体积无菌水振荡悬浮，成为乳酸菌种子液。将菌种RP38 和JJ4 按3 ∶1 比例用等体积无菌水振荡悬浮，成为混菌种子液。
1.3.2 脱腥处理 配制1%糖水，用柠檬酸调节至pH 4.5，115 ℃高压灭菌20 min，制备成发酵基液，备用。扇贝原料解冻，清洗后沥干，加水浸没，通臭氧预处理20 min，捞出沥干10 min，取100 g 加入发酵基液50 g，按总质量的1%分别接入乳酸菌种子液和混菌种子液，充CO2 密封，于30 ℃下隔氧发酵6 h，分别进行感官评价并取样检测臭氧预处理后（C 组）及发酵后（乳酸菌单菌为R 组，混菌组为RJ 组）的扇贝挥发性风味物质成分。试验重复3 次。
1.4 检测方法
1.4.1 菌落总数 采用GB 4789.2-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》中的方法。
1.4.2 挥发性盐基氮 采用GB 5009.228-2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》中的方法。
1.4.3 硫代巴比妥酸（TBA） 采用GB/T 35252-2017 《动植物油脂2-硫代巴比妥酸值的测定 直接法》中的方法。
1.4.4 挥发性风味物质测定
1.4.4.1 固相微萃取（SPME）条件 样品沥干后打浆。将萃取头250 ℃老化60 min，备用。取5.0 g 粉碎均匀的待测样品于20 mL 萃取瓶中，封口，置60 ℃水浴加热10 min 达到平衡，插入老化的萃取头，萃取30 min 后，转移至250 ℃进样口中热解析3 min，插入GC-MS 进样口。
1.4.4.2 GC-MS 分析条件
1） GC 条件 毛细管柱Rtx-5Sil MS （30 m×0.25 mm，膜厚0.25 μm）。程序升温方式：起始温度35 ℃，保持2 min；以3 ℃/min 速率升至90 ℃，保持1 min；以5 ℃/min 速率升至140 ℃，保持1 min；以8 ℃/min 速率上升至250 ℃，保持5 min。载气为He，纯度99.999%，流速1.0 mL/min，不分流进样。
2） MS 条件 EI 模式，电压为70 eV，离子源温度230 ℃，扫描速率2.88 scan/s，质谱检测范围35～550 m/z，发射电流100 μA。
1.4.4.3 化合物定性和半定量分析[8，12]
1） 定性分析 将气相色谱-质谱联用仪所得数据通过NIST2014 谱库检索，选择RTE 积分器积分，选择质量数大于80 的化合物，结合保留指数（Retention index，RI）做定性分析。
2） 半定量分析 扣除色谱图中的硅氧烷类杂峰及其它非嗅感物质杂峰，计算挥发性风味物质的总峰面积，采用面积归一化法计算各化合物的相对含量。以C7～C30 正构烷烃（质量浓度为20 μg/mL，溶于二氯甲烷溶剂）为标准品，采用保留指数的线性升温公式：RI=100n+100（tx-tn）/ （tn+1-tn），计算各挥发性组分的RI 值，其中 tx、tn、tn+1 分别为被分析组分和碳原子处于n 和n+1 之间的正构烷烃混标标准品流出峰的保留时间。
1.4.5 感官评价 根据GB/T 10220-2012 《感官分析 方法学 总论》及GB/T 16861-1997《感官分析 通过多元分析方法鉴定和选择用于建立感官剖面的描述词》进行剖面描述。评价小组由10 位经过培训的感官评定员组成，选定海腥味、泥土味、鲜甜味、醇香味、花草味和奶酪味为气味感官描述词，要求评价员采用标度“0～5”定量描述感受到的风味强度，采用雷达图法对原料组（CK 组）、臭氧处理组（C 组）、乳酸菌RP38 发酵组（R 组）、混菌RP38+JJ4 发酵组（RJ 组）进行分析与评价。
1.4.6 关键风味活性成分的评价方法[13] 采用相对气味活度值（ROAV）评价各化合物对样品风味的贡献。对样品总体风味贡献最大的组分定义为：ROAVstan=100，其它挥发性风味活性成分的ROAV 计算公式：ROAVi≈100×Cri/Crstan×Tstan/Ti。式中，Cri 和Ti 分别是各挥发性风味物质的含量（%）和感觉阈值（μg/kg）；Crstan、Tstan 分别是对样品总体风味贡献最大（OAV 值最高）组分的含量（%）和感觉阈值（μg/kg），ROAV 值越大的组分对样品总体风味的贡献越大。
1.5 数据分析
运用SPSS 19.0 软件进行ANOVA 方差分析，采用Origin 2019 绘图并计算均值标准误SEM，数据用（
±s）表示。采用SIMCA 14.1 软件进行主成分PCA 分析。
2 结果与分析
2.1 臭氧处理对扇贝鲜度的影响
臭氧是水产品减菌处理常见的方式[14]。挥发性盐基氮（TVB-N）是蛋白质分解产生的氨和胺类碱性物质，是食品安全和评价水产品鲜度的重要标准[15]。硫代巴比妥酸（TBA）是与脂肪氧化密切相关[16]，可用菌落总数、挥发性盐基氮和硫代巴比妥酸代表原料的新鲜度。扇贝臭氧水处理前、后的结果见图1。臭氧处理能降低菌落总数约1 个数量级，并减少48.4%的TVB-N，差异均达极显著水平（P<0.01）。TBA 略有上升，差异不显著。TVB-N 是蛋白质在内源酶和微生物作用下分解产生的氨和胺类碱性物质，臭氧处理能快速减少杂菌并破坏相关内源酶活性，因此有利于降低TVB-N 含量。
图1 臭氧处理对菌落总数、TVB-N 和TBA 的影响
Fig.1 Effects of ozone treatment on the total number of colonies，TVB-N and TBA
注：小写字母表示显著水平P=0.05；大写字母表示显著水平P=0.01。
2.2 扇贝生物脱腥处理前、后的风味
原料组（CK 组）、臭氧处理组（C 组）、乳酸菌RP38 发酵组（R 组）和混菌RP38+JJ4 发酵组（RJ组）的感官评价结果见图2。CK 组和C 组的扇贝风味接近，带有典型的海腥味和泥土味，R 组和RJ组的生物发酵都脱除了大部分腥味和土味，R 组具有典型的乳酸发酵特点和花果香，RJ 组则增加了酵母发酵的醇香味和鲜甜味。综上，臭氧处理没有显著改变对扇贝的风味，即脱腥效果不明显，而生物发酵改变了扇贝风味特征且脱腥效果显著。
图2 扇贝生物脱腥感官剖面图
Fig.2 The sensory section of biological deodorization of the kelp
2.3 生物脱腥前、后的挥发性成分
分别将C 组、R 组和RJ 组进行HS-SPMEGC-MS 解析，GC-MS 总离子流图见图3。3 个处理组图谱各不相同，说明生物发酵对扇贝挥发性成分组成影响较大。从韦恩图（图4）也可看出，各处理组的共有成分占58%，单菌发酵和混菌发酵分别新增成分20 个和22 个。
图3 不同处理组挥发性成分的GC-MS 总离子流图
Fig.3 GC-MS total ion flow diagram of volatile flavor components in different treatment groups
图4 各处理组的韦恩图
Fig.4 Venn diagram in different samples
共检测出112 种成分（表1），3 个处理组的主要挥发性成分分别是醛类 （26.67%～34.64%）、醇类（19.09%～33.10%）、酮类（9.79%～11.59%）和烯炔类（6.41%～11.41%）。各处理组挥发性共有成分以醇类、醛类和酮类为主，占比较大的是：壬醛、2-乙基-己醇、正辛醛、庚醛、（+）-柠檬烯、正辛醇、3-癸烯-2-酮、2-十一酮、3-十二炔、1-壬醇、2-壬酮、癸醛等。各处理组中的酸类成分少且含量低，也未检出乙醇等酵母代谢产物，这可能与本试验采用的弱极性毛细管柱有关。也有报道认为HPSPME 技术对于强极性成分的萃取效果较差[17]。
/%RJ 组/%R 组1.24±0.12-0.64±0.01 0.57±0.07 0.17±0.02 0.21±0.01 1.71±0.37 0.71±0.07 0.23±0.07-1.01±0.02 1.09±0.10---6.42±0.38 6.26±0.26-1.41±0.04 1.44±0.06 4.86±0.17 7.27±0.17 6.51±0.20 7.22±0.08 0.22±0.03 0.30±0.04 4.82±0.33 6.64±0.12 0.56±0.01-0.05±0.02 0.08±0.01 0.40±0.03 0.59±0.05 1.23±0.05 1.72±0.07 0.13±0.02 0.15±0.00--0.09±0.01 0.1±0.01-0.09±0.00 27.74±0.81 33.10±0.38 0.04±0.01-1.71±0.02 2.08±0.04 1.09±0.01 1.19±0.02 0.29±0.01 0.28±0.01--0.18±0.03 0.18±0.01）（n=3果结析解GC-MS的分成性发挥组理处各1表）（n=3 Volatile flavor components in different samples by GC-MS analysis Table 1 /%C 组式子分RI CAS称名文英0.25±0.12 NO2 H9 C8 945 2941-78-8 2-Amino-5-methylbenzoic acid 0.63±0.08 O2 H12 C6 1 265 88-09-5 2-Ethylbutanoic acid-O2 H22 C11 1 294 33933-81-2 7-Methyl-4-octanyl acetate 1.54±0.72-O H12 C5 786 71-41-0 1-Pentanol 0.54±0.09 O H14 C6 884 111-27-3 Hexanol 0.71±0.09 O H14 C7 996 591-23-1 3-Methylcyclohexanol 0.45±0.12 O H16 C7 1 001 111-70-6 1-Heptanol-O H12 C5 1 002 137-32-6 2-Methyl-1-butanol 1.80±0.43 O H16 C8 1 010 3391-86-4 1-Octen-3-ol 7.68±0.53 O H18 C8 1 064 104-76-7 2-Ethyl hexanol 3.71±0.50 O H18 C8 1 109 111-87-5 1-Octanol 0.23±0.01 O H32 C18 1 149 506-44-5（9Z，12Z，15Z）-Octadecatrien-1-ol-1-烯三2.12±0.35 O H20 C9 1 217 143-08-8 1-Nonanol-O H16 C9 1 241 53544-48-2 2-Methylene-cyclopentanepropanol 0.07±0.04 O H22 C10 1 261 10042-59-8 2-Propylheptanol 0.20±0.02 O H22 C10 1 321 112-30-1 1-Decanol 1.60±0.02 O H20 C10 1 331 51100-54-0 1-Decen-3-ol 0.18±0.01 O H26 C12 1 443 112-53-8 1-Dodecanol 0.05±0.02 O H42 C20 1 489 629-96-9 1-Eicosanol-O H28 C13 1 535 112-70-9 1-Tridecanol-O H26 C15 1 688 515-69-5 α-Bisabolol 19.09±1.39 0.09±0.04 O H16 C8 978 928-68-7，6-methyl-2-Heptanone 2.11±0.09 O H18 C9 1 127 821-55-6 2-Nonanone 1.04±0.11 O H12 C8 1 129 38284-27-4，5-Octadien-2-one 3酮-2--O H14 C9 1 155 78-59-1 Isophorone 0.38±0.04 O H36 C18 1 236 502-69-2 Hexahydrofarnesyl acetone-O H18 C10 1 328 56606-79-2 1-Decen-3-one称名质物酸甲苯基甲-5-基氨2-酸丁基乙2-酸乙-醇辛-4-基甲7-醇戊1-醇己正醇己环基甲3-醇庚正醇丁基2-甲醇-3-烯辛1-醇己基乙2-醇辛正碳八（9Z，12Z，15Z）-十醇醇壬1-醇丙烷戊环基-甲亚2-醇庚-1-基丙2-醇癸1--3-醇烯1-癸醇二十醇十二1-醇三十1-醇药没红酮庚-2基甲6-酮壬2-烯二，5--3辛）-，5E（3E酮尔佛异酮植酮-3-癸1-号序1 2 3类酸1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12 13 14 15 16 17 18类醇1 2 3 4 5 6
/%组RJ/%组R/%组C 0.16±0.01 0.16±0.02-2.48±0.25 2.74±0.19 2.77±0.03 0.23±0.01 0.29±0.03-2.09±0.17 2.59±0.20 2.51±0.14 1.01±0.01 1.30±0.05 1.31±0.04 0.30±0.02 0.37±0.01 0.39±0.03 0.20±0.02 0.31±0.01 0.30±0.02 0.03±0.02--0.06±0.01 0.10±0.01 0.09±0.01 9.79±0.46 11.59±0.38 10.86±0.23 0.46±0.13 0.29±0.03 0.62±0.15 0.53±0.09 0.17±0.01 0.26±0.00 2.42±0.02 2.58±0.12 4.43±0.31 0.32±0.06 0.24±0.02-0.98±0.06 0.88±0.08 0.55±0.00 3.75±0.18 4.52±0.27 7.37±0.66 0.88±0.14 0.73±0.04 0.18±0.04 0.46±0.10 0.26±0.04 0.24±0.07 9.22±0.11 12.51±1.15 15.45±1.37 0.76±0.07 0.84±0.01 0.63±0.04 0.40±0.03 0.46±0.02 0.35±0.06 0.31±0.05 0.33±0.01 0.27±0.04 0.57±0.04 0.99±0.11 1.85±0.38-0.12±0.00-0.61±0.06 0.59±0.01 0.44±0.04 0.32±0.07--0.16±0.03--0.91±0.16--0.36±0.02 0.49±0.04 0.71±0.09 0.28±0.02 0.27±0.01 0.30±0.02 0.08±0.01-0.10±0.01 0.27±0.01 0.27±0.02 0.28±0.02-0.04±0.01 0.06±0.01式子分RI CAS O H22 C11 1 336 2216-87-7 O H22 C11 1 341 112-12-9 O2 H12 C9 1 366 16473-11-3 O H18 C10 1 391 10519-33-2 O H20 C11 1 437 16587-71-6 O H20 C13 1 474 127-41-3 O H20 C13 1 539 79-77-6 O2 H28 C16 1 546 7779-50-2 O H26 C13 1 555 593-08-8 O H12 C6 809 66-25-1 O H10 C6 864 6728-26-3 O H14 C7 917 111-71-7 O H12 C7 981 57266-86-1 O H6 C7 985 100-52-7 O H16 C8 1 033 124-13-0 O H10 C7 1 042 4313-03-5 O H14 C8 1 096 2548-87-0 O H18 C9 1 141 124-19-6 O H14 C9 1 191 557-48-2 O H16 C9 1 199 18829-56-6 O H24 C12 1 204 110-41-8 O H18 C10 1 499 65405-70-1 O H20 C10 1 251 112-31-2 O H18 C10 1 307 3913-81-3 O H16 C10 1 368 25152-84-5 O H22 C12 1 420 4826-62-4 O2 H22 C13 1 445 31906-04-4 O H24 C12 1 461 112-54-9 O H30 C15 1 571 75853-51-9 O H28 C14 1 639 124-25-4 O H30 C15 1 678 2765-11-9 O H26 C13 1 755 10486-19-8）1称名文英称名质物3-Undecanone酮一十3-Undecan-2-one酮一十2-，6-dione）nonane-2（3.3.1 Bicyclo酮二，6--2烷壬[3.3.1]环二3-Decen-2-one酮-2-烯癸3-4-Tert-pentylcyclohexanone酮己）环基丙基甲4-（1，1-二α-Ionone酮罗紫α-β-Ionone酮罗紫β-酮 Oxacycloheptadec-7-en-2-one-2-烯-7-碳七十环代氧）-（Z 2-Tridecanone酮烷三十2-Hexanal醛己（2E）-2-Hexenal醛烯2-已Heptanal醛庚）-2-Heptenal（2Z醛烯庚）-2-（2Z Benzaldehyde醛甲苯Octanal醛辛正，4-Heptadienal）-2，E（E醛烯二庚，4-）-2，E（E）-2-Octenal（2E醛烯辛-2-反Nonanal醛壬（2E，6Z）-2，6-Nonadienal醛烯二（2E，6Z）-2，6-壬）-2-Nonenal（2E醛壬）-2-（2E 2-Methylundecanal醛一十基甲2-）-4-Decenal（4E醛癸-4-反Capraldehyde醛癸）-2-Decenal（2E醛烯癸）-2-（2E，4-Decadienal）-2，4E（2E醛烯二癸，4-）-2，4E（2E 2-Dodecenal醛烯二2-十Lyral醛兰铃新Dodecanal醛二十13-Methyltetradecanal醛蔻豆肉基甲13-1-Tetradecanal醛蔻豆肉pentadecanal醛五十Tridecanal醛三十表（续号序7 8 9 1 0 11 12 13 14 15类酮1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
/%组RJ/%组R/%组C 1.23±0.14 0.49±0.04 0.58±0.05 0.61±0.06 0.61±0.02 0.32±0.03 0.39±0.05 0.2±0.02-0.86±0.05 0.5±0.03-26.67±1.00 27.97±1.33 34.64±2.94 0.26±0.02 0.23±0.04 0.34±0.07-0.89±0.03-0.22±0.05--/0.55±0.12 0.60±0.16 0.91±0.10 0.60±0.04 0.51±0.12 0.19±0.02 0.19±0.00 0.20±0.00 0.07±0.01 0.08±0.04 0.09±0.01-0.24±0.02 0.30±0.05 0.06±0.01----0.05±0.00 1.61±0.07 2.49±0.35 1.97±0.25--4.10±0.81 1.77±0.09 2.79±0.21 3.86±0.45 0.48±0.01 0.49±0.01 0.32±0.11 2.64±0.06 2.70±0.01 2.30±0.08 0.28±0.07 0.28±0.01 0.24±0.02 0.36±0.01 0.34±0.03-0.05±0.02 0.12±0.00 0.10±0.01 0.20±0.01 0.30±0.01 0.28±0.02 0.13±0.02 0.13±0.00 0.20±0.03 0.10±0.01 0.11±0.02 0.12±0.01 0.14±0.02 0.14±0.04 0.18±0.03 0.27±0.02 0.27±0.01 0.25±0.00--0.41±0.05式子分RI CAS O H32 C16 1 785 629-80-1 O H36 C18 1 893 638-66-4 O H34 C17 1 955 629-90-3 O H40 C20 2 001 2400-66-0 O2 H12 C6 785 638-49-3 O3 H10 C6 1 112 599-04-2 FO4 H5 C6 1 137 32486-23-0 O2 H20 C10 1 242 106-32-1 O2 H14 C8 1 285 3050-69-9 O4 H20 C12 1 324 10412-78-9 O2 H24 C12 1 370 25415-84-3 O4 H30 C16 1 651 6846-50-0 O2 H32 C16 1 867 124-06-1 O4 H22 C16 2 042 84-74-2 H18 C9 1 002 4316-65-8 H16 C10 1 058 5989-27-5 H16 C9 1 105 19447-29-1 H22 C12 1 315 6790-27-8 H16 C11 1 416 33156-93-3 H26 C15 1 453 74744-49-3 H44 C22 1 496 1599-67-3 H24 C15 1 549 17066-67-0 H34 C17 1 552 6765-39-5 H24 C15 1 569 495-61-4 H24 C15 1 599 6753-98-6 H28 C17 1 621 71046-96-3 H38 C20 2 002 504-96-1称名文英1-Hexadecanal Octadecanal Heptadecanal Icosanal Pentyl formate DL-Pantolactone）（5H）-2-oxoethyl]-2（Fluorooxy 5-[2--furanone Ethyl caprylate Vinyl caproate，4-Cyclohexylenedimethylene trans-1 diacetate 2-Ethylhexyl butanoate，3-pentanediol di-，4-Trimethyl-1，2 2 i sobutyrate Ethyl tetradecanoate Dibutyl phthalate，5-Trimethyl-1-hexene，5 3）-limonene（R）-（+2-Nonyne 3-Dodecyne）-But-1-Enyl]Cyclohep-（E）-6-[（6R，4-Diene ta-1）-7-Pentadecen-5-yne（Z 1-Docosene β-Selinene 1-Heptadecene）-β-Bisabolene（S α-Caryophyllene，14-Heptadecatetraene，11，8 1 N eophytadiene 1）表称名质物醛六十醛八十）醛（碳七十醛烷十二酯戊酸甲酯内酰泛）-（-D-）基-2-喃呋-2H-代氧（5-2-氟酯酸乙酯乙酸辛酯烯乙酸己正酸乙二醇甲二，4--1烷己环-反酯酯酸丁基辛酯丁异醇二戊基甲三，4-，2 2酯乙酸四十酯丁二酸甲二苯邻烯己-1-基甲三，5-，5 3烯檬柠）-（+炔壬2-炔二十3-庚环]基烯-1-丁）-（E）-6-[（6R烯二，4--1并炔烯五十）-7-（Z烯二十二1-烯林瑟β-烯七十亚-1-基甲（5--4-基甲）-1-（S烯己）环基烯己-4-基甲烯草律α-烯四烷七十，14-，11，8 1烯二植新（续号序2 4 25 26 27类醛1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0类酯1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12 13
/%组RJ/%组R 6.41±0.24 7.25±0.09---2.17±0.24 1.13±0.16 0.86±0.25 0.32±0.07-0.31±0.05 0.42±0.02 0.17±0.03 0.2±0.01 0.52±0.09 0.73±0.07--0.18±0.03 0.36±0.04 0.10±0.02 0.17±0.00 0.09±0.02--0.78±0.01 0.45±0.12 0.66±0.02---0.10±0.01 0.33±0.02 0.44±0.01 0.16±0.02 0.19±0.00-0.20±0.01 0.23±0.02 0.27±0.01 3.98±0.54 6.83±0.51 0.27±0.01 0.51±0.03 0.25±0.05 0.30±0.03 0.40±0.03 0.52±0.02 0.15±0.01 0.16±0.00-0.17±0.01 0.18±0.03 0.24±0.02 0.30±0.03 0.14±0.02 1.44±0.16 2.04±0.04/%组C 11.41±1.09 0.98±0.21--0.52±0.28 0.36±0.17 0.19±0.06 0.74±0.15 0.23±0.02 0.17±0.02 0.07±0.03 0.54±0.23 0.67±0.02 0.25±0.10--0.16±0.01-0.29±0.04 5.19±0.99 0.33±0.01 0.22±0.12 0.63±0.05 0.13±0.01-0.25±0.02 0.11±0.01 1.67±0.10式子分RI CAS H22 C10 1 029 124-18-5 H22 C10 1 014 2051-30-1 H24 C11 1 028 1120-21-4 H26 C12 1 083 17302-37-3 H26 C12 1 211 1002-43-3 H24 C12 1 228 71138-64-2 H26 C12 1 245 112-40-3 NO2 H13 C6 1 294 646-14-0 H20 C11 1 346 74663-93-7 H28 C13 1 349 629-50-5 H38 C18 1 384 20959-33-5 Br H25 C12 1 420 13187-99-0 H30 C14 1 451 629-59-4 H20 C12 1 454 27723-50-8 H32 C15 1 513 25117-24-2 H32 C15 1 560 629-62-9 H52 C25 1 617 1560-78-7 H38 C18 1 664 593-45-3 H40 C19 1 773 1921-70-6 O N2 H10 C7 1 054 79352-72-0 H8 C10 1 223 91-20-3 NO H9 C6 1 291 10412-98-3 O3 H22 C12 1 304 63169-61-9 H22 C14 1 337 1014-60-4 O H24 C15 1 564 128-37-0 N Cl2 H5 C9 1 960 21617-18-5称名文英Decane，6-dimethyloctane 2 U ndecane，2-Dimethyldecane 2 3-Methyl-Undecane 3-Methyleneundecane Dodecane 1-Nitrohexane）bicyclo[2.2.1]hep-（1-Methylpropyl 2-tane Tridecane 7-Methylheptadecane 2-Bromododecane Tetradecane 1-Methylenespiro[5.5]undecane 4-Methyltetradecane Pentadecane 2-Methyltetracosane Octadecane Pristane 4-Amino-2-aminomethylphenol Naphthalene 5-Ketohexanenitrile 2-Methylpentanoic anhydride）-Ben-，1-Dimethylethyl（1，3-Bis 1 z ene Butylated Hydroxytoluene 4，5-Dichloroquinoline 1）表称名质物烷癸烷辛基甲二，6-2烷一十烷癸基甲二，2-2烷一十基甲3-烷一十基甲亚3-烷二十烷己基硝1-烷庚）-[2.2.1]基丙甲（1-2-烷三十烷七十基7-甲烷二十溴2-烷四十烷一十-基甲亚1-烷四十基甲4-烷五十正）烷（碳四十二基甲2-烷八十正烷鲛姥酚苯基氨-4-基甲基氨2-萘腈已基酮5-酐酸戊基甲2-苯-基丁叔二，3-1酚甲对基丁叔二，6-2啉喹氯4，5-二（续号序类炔烯1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12 13 14 15 16 17 18 19类烃烷1 2 3 4 5 6 7它其
C 组挥发性成分含量最高的类型依次是醛类、醇类和烯烃类，两个生物发酵组则是醇类、醛类和酮类，说明生物发酵主要降解了醛类和烯炔类，增强了醇类和酮类物质。扇贝脱腥前挥发性成分含量较高的依次是：壬醛、2-乙基-己醇、正辛醛、庚醛、3，5，5-三甲基-1-己烯、（+）-柠檬烯、正辛醇、2-十一酮、3-癸烯-2-酮、3-十二炔、1-壬醇、2-壬酮、癸醛、1-辛烯-3-醇、1-癸烯-3-醇等。单菌发酵的R 组则是：壬醛、2-乙基-己醇、正辛醇、1-壬醇、正庚醇、正辛醛、（+）-柠檬烯、2-十一酮、3-十二炔、3-癸烯-2-酮、庚醛、2，6-二甲基辛烷、2-壬酮、1-癸烯-3-醇、1-辛烯-3-醇等。混菌发酵的RJ 组是：壬醛、正辛醇、2-甲基丁醇、2-乙基-己醇、1-壬醇、正辛醛、3-十二炔、2-十一酮、庚醛、3-癸烯-2-酮、（+）-柠檬烯、2-壬酮、1-辛烯-3-醇、十六醛、1-癸烯-3-醇等。
2.4 生物脱腥对挥发性成分类型的影响
8 类成分的方差分析及其含量对比见图5。方差齐性分析显示，除烯炔类，其它7 类成分均为方差齐性。对齐性成分做方差分析，醇类和醛类的差异达极显著水平，是构成生物脱腥前、后挥发性风味的差异主体。醛类对挥发性风味贡献较大，在生物发酵前、后都是最重要的主体成分；醇类产生品质柔和的气味，是鱼肉等水产品的重要贡献因素；饱和酮类物质是不饱和脂肪酸氧化形成的稳定羟过氧化物，气味阈值较高，对嗅觉影响不大；烷烃类通常阈值较高，对挥发性风味影响较小[18]。
图5 各类物质的相对含量
Fig.5 Relative content of various substances
注：# 代表方差不齐性（P<0.05）；* 代表ANOVA 分析差异显著（P<0.05），** 代表ANOVA 分析差异极显著（P<0.01）。
C 组含量显著高于其它两个发酵组的主要有：3-甲基环己醇、2-乙基-己醇、十二醇、2-壬酮、植酮、己醛、庚醛、正辛醛、壬醛、癸醛、十三醛、肉豆蔻醛、3，5，5-三甲基-1-己烯、新植二烯、癸烷、1-硝基己烷、1-亚甲基-十一烷，这些成分可以认为是被生物发酵降解的成分，以醇类和低级醛为主。低级碳醛往往是扇贝中脂质降解或氧化的产物[19]。短链饱和脂肪醛大多具有刺鼻气味，如壬醛、正辛醛、庚醛和癸醛，不饱和酮与醛类往往有加和作用，对腥味物质起增强作用[20]。
R 组新增或增加较多的成分可认为是乳杆菌RP38 的特征代谢产物，有7-甲基-4-辛醇-乙酸、正庚醇、正辛醇、1-壬醇、异佛尔酮、1-癸-3-酮、3-十一酮、二环[3.3.1]壬烷-2，6-二酮、（2Z）-2-庚烯醛、十七（碳）醛、二十烷醛、（Z）-7-十五烯炔、2，6-二甲基辛烷、十一烷、正十五烷。与C 组和R 组相比，RJ 组新增或增加较多的可能是酿酒酵母JJ4 的特征代谢产物：2-氨基-5-甲基苯甲酸、1-戊醇、2-甲基丁醇、2-亚甲基-环戊烷丙醇、反式-2，4-癸二烯醛、2-十二烯醛、新铃兰醛、氟2-（5-氧代-2H-呋喃-2-基）乙酸酯。两个生物发酵组含量较高的是醇类、不饱和醛类和酮类，说明生物发酵主要降解饱和脂肪醛类和烯炔类，增加不饱和醛、醇类和酮类物质。短链不饱和醛多有愉快的较浓郁的果香，醇类大多产生品质柔和的气味，酮类是不饱和脂肪酸受热氧化和降解的产物，常带有花香和果香，并随碳链增加而呈现出更加明显的花香芬芳[21]。
2.5 4 类挥发性骨架风味的主成分分析
将占比最高的醛类、醇类、酮类及烯炔类进行主成分分析，以明确影响各处理组风味的重要挥发性成分。采用散点载荷双标图解释样品间组分不同维度的显著差异，3 个处理组载荷分析结果见图6。3 个样品分别处于不同象限，说明样品间差异较明显，C 组与两个生物发酵组分别处于Y轴两侧，这说明生物发酵对扇贝挥发性风味影响较大，各成分与样品间的距离可视为影响样品风味特性的重要程度。结合表1进行综合分析，可以找到各组样品的特征风味成分。
图6 生物脱腥前、后挥发性风味的散点载荷双标图
Fig.6 Scatter load double plot of the volatile flavor compounds in microbiological deodorization
注：方形为样品，菱形为挥发性成分。
C 组特征风味成分有3-甲基环己醇、十二醇、6-甲基-2 庚酮、植酮、己醛、庚醛、正辛醛、癸醛、十二醛、3，5，5-三甲基-1-己烯等，其中饱和醛类相对含量高，己醛、正辛醛、庚醛和癸醛被证实大量存在于贝类[22-23]、鱼类[11]和海带[12]等水产品中，高浓度时有酸败和令人作呕的气味，是腥味重要来源，而在低浓度时则呈现青草香味、果香味[24]。
R 组特征成分较为简单，有正庚醇、（9Z，12Z，15Z）-9，12，15-十八碳三烯-1-醇、红没药醇、反-4-癸醛、（2E）-2-壬醛等，红没药醇具有花草清香[24]，正庚醇具有淡奶油香气[25]，反-4-癸醛则具有香草青辛味。RJ 组特征是以支链不饱和醛类成分为主，如1-戊醇、苯甲醛、反-2-辛烯醛、反式-2，4-癸二烯醛、2-十二烯醛、新铃兰醛、十六醛、2-甲基丁醇、2-亚甲基-环戊烷丙醇、2-已烯醛等，除了2-已烯醛和反-2-辛烯醛，其它成分均为RJ 组新增成分，说明这些成分是酿酒酵母JJ4 的代谢产物。其中，1-戊醇具有鲜糯果香[26]，2-甲基丁醇是酵母菌的主要代谢副产物[27]，2-十二烯醛和新铃兰醛具有清淡而甜润的花香气息[28]。混菌发酵能赋予扇贝更丰富多样的良好风味组成。
2.6 关键风味活性成分的贡献评价
为进一步评价影响嗅觉的特征风味活性成分，基于可查阅到的感官阈值，综合表1和图5、图6的分析，选取含量占比高、变化幅度大及主成分分析特征显著的成分进行ROAV 计算，结果见表2。根据ROAV 法获得3 种样品中均以正辛醛的OAV 值最高，定义正辛醛的ROAV 值为100，所有成分均满足0 表2 主要特征成分的ROAV 值 注：“-”表示未检出，或ROVA<0.0001。 ? 臭氧水被证实具有高效杀菌功效，扇贝解冻后经臭氧处理可降低菌落总数约1 个数量级，减少48.4%的TVB-N，达到显著减菌与保持原料鲜度的目的，然而，无脱除腥味的效果。扇贝挥发性风味成分以醇类、醛类和酮类为主，脱腥前、后的醛类和醇类物质差异达极显著水平，壬醛、正辛醛、庚醛、癸醛等低级饱和醛占比大且阈值低，是扇贝的主要腥味来源[30]，生物脱腥主要路径是减少具有典型腥臭味的低分子碳链醛类腥味物质，增加支链脂肪醛物质和醇类。单菌发酵及复合发酵均有显著的生物脱腥效果，分别新增成分20 个和22 个，R 组中正庚醇和1-壬醇、2，6-二甲基辛烷等优势成分在RJ 组中大幅减少甚至消失，这可能是因为这些成分是酿酒酵母JJ4 的代谢底物，或者某些代谢路径受到不同菌属间的互作效应。 主成分分析显示，乳杆菌RP38 代谢产生的特征风味产物是正庚醇、红没药醇、（2E）-2-壬醛、反-4-癸醛等，酿酒酵母JJ4 的代谢特征风味产物包括1-戊醇、2-甲基丁醇、2-亚甲基-环戊烷丙醇、2-已烯醛、苯甲醛、反-2-辛烯醛、反式-2，4-癸二烯醛、2-十二烯醛、新铃兰醛、十六醛等，如采用混菌发酵能产生更复杂丰富的良好风味，实现脱腥增效。ROVA 分析显示：正辛醛、（2E）-2-壬醛、壬醛、1-壬醇、庚醛、癸醛是扇贝脱腥前、后的主体风味活性成分，正庚醇、2-壬酮、（2Z）-2-庚烯醛和反-2-辛烯醛是生物脱腥后的重要修饰性风味成分，生物脱腥通过改变影响嗅觉的主体风味及修饰风味成分的含量和比例，实现减少腥味和掩盖腥味的目的。 GC-MS 分析方法是现在最常见的挥发性风味物质解析手段，然而，不同化合物在同一时间洗脱出来，无法有效分离挥发性物质[31]。后续可借助现在兴起的气相色谱-嗅觉测量法（GC-O）和全二维气相色谱-飞行时间质谱法（GC×GC-TOFMS），前者能从大量挥发性物质中挑选出气味活性成分并衡量其贡献，后者具有分辨率高、灵敏度高、峰容量大、分离速度快、定性定量准确性好等特点。 [1]邹建威，曹善茂，李晓雨，等.岩扇贝原种和繁育后代肠道和内脏团细菌多样性分析[J].大连海洋大学学报，2019，34（3）：323-331. 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Table 2 ROAV values of the main characteristic components
3 结论与讨论