葡萄酒中的单宁是一类由非常活跃的基本分子通过缩合或聚合作用形成的酚类化合物[1]。根据单宁化学结构的不同，可将其分为2 类：一类是来自于葡萄浆果中的缩合单宁；另一类是来自于橡木桶中的水解单宁。其中，缩合单宁又称原花青素，是由黄烷-3-醇单体通过C-C 键缩合而成的低聚物或多聚物。这些单体在葡萄皮和葡萄籽中的存在略有不同，籽中的缩合单宁主要由（+）-儿茶素 （Catechin，C）、（-）-表儿茶素（Epicatechin，EC）和（-）-表儿茶素没食子酸酯（Epicatechin gallate，ECG）组成[2]，而果皮中的缩合单宁主要有（+）-棓酸儿茶素 （Gallocatechin，GC）、（-）-表棓儿茶素（Epigallocatechin，EGC）和（-）-表棓儿茶素没食子酸酯（Epigallocatechin gallate，EGCG）[3]。
不同的结构单元对葡萄酒的涩感影响存在差异，如表儿茶素的涩感较儿茶素强，在口腔中持续的时间更久[4]。Scharbert 等[5]研究发现，与其它黄烷-3-醇单体相比，人们似乎对表棓儿茶素没食子酸酯的感官阈值较低。研究表明，没食子酰基的存在会增加酒的涩感，在延伸亚基较高比例的表儿茶素和末端亚基中较高比例的棓酸儿茶素均会增加酒的涩感，且延伸亚基和末端亚基中的表棓儿茶素含量与涩感负相关[6]。除单宁的结构组成及其立体化学会影响葡萄酒的涩感外，单宁的聚合度也是影响涩感的关键因素，单宁的涩感强度随着聚合度的增加而显著增加，并且单宁的聚合度越高，疏水基团越多，单宁和蛋白质之间的结合亲和力越高，涩感就越强[7]。此外，葡萄酒中的涩感强度与单宁含量间也呈显著正相关[8]。
目前，对单宁结构的测定，通常是以其分离纯化后产物的结构单元组成、末端单元和延伸单元组成、连接方式及平均聚合度等的研究为主，常用的分析方法有色谱技术、质谱技术、核磁共振技术及各种分析方法的联用等。其中，色谱技术因操作简便、数据准确等优点，而广泛用于植物单宁的结构分析中，如凝胶渗透色谱常用于单宁分子质量的测定[9]，而高效液相色谱可用于单宁纯度[10]、聚合度[11]、含量[9]等的检测，以及与质谱联用以分析单宁的结构类型[12]。李辉等[13]利用超高效液相色谱-电喷雾多级质谱（UHPLC-ESI-MS）测定葡萄酒中游离态C、EC、EGC 单体及二聚体、三聚体含量，通过对酒样的感官评价，建立酚类物质与涩感间的相关关系。Chira 等[14]利用高效液相色谱测定不同年份赤霞珠葡萄酒的单宁含量、平均聚合度、原翠雀素占比、没食子酰化程度及涩感强度，揭示其随陈酿时间延长的变化规律。然而，对于不同陈酿年份葡萄酒中单宁含量及其游离态和聚合态结构组分的系统研究较少。
本文以内蒙古产区不同年份的赤霞珠和蛇龙珠干红葡萄酒为材料，对其总单宁含量、游离态黄烷-3-醇单体含量、缩合单宁结构组分和涩感强度进行分析与评价，旨在揭示不同陈酿年份酒样间单宁含量与结构差异及其与涩感间的关系，为葡萄酒的陈酿技术提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
酒样来自内蒙古乌海产区汉森酒庄不同年份的赤霞珠（Cabernet Sauvignon，CS）葡萄酒和蛇龙珠（Cabernet Gernischt，CG）葡萄酒，且同一品种、不同年份的葡萄酒均采用相同的酿造工艺生产，在相同的环境条件下储存，具体酒样信息及其涩感强度见表1。
表1 8 种供试干红葡萄酒的品种、年份及涩感强度
Table 1 Grape cultivar，vintage and astringency
intensity of 8 kinds of dry red wines
?
（+）-儿茶素、（-）-表儿茶素、（-）-表儿茶素没食子酸酯、（+）-棓酸儿茶素、（-）-表棓儿茶素、（-）-表棓儿茶素没食子酸酯（纯度>98%），上海源叶生物科技有限公司；Toyopearl HW-40C 凝胶树脂，日本TOSOH 公司；牛血清蛋白（纯度>98%），美国Amresco 公司；甲醇、乙腈（色谱纯级），美国Tedia 公司；间苯三酚，山东西亚化学股份有限公司；乙酸钠，天津博迪化工股份有限公司；福林酚，北京索莱宝科技有限公司；三氟乙酸、乙酸乙酯、丙酮、磷酸（分析纯级），四川西陇化工有限公司。
1.2 仪器与设备
UPLC I-Class 超高效液相色谱仪，美国Waters 公司；Cray-60 紫外-可见分光光度计，美国安
捷伦公司；RE-52A 旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；FD-1C-50 冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司；TGL-18M 高速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司。
1.3 酒样常规理化指标的测定
酒样中的可滴定酸（酒石酸计）、pH 值及酒度的测定参照《葡萄酒分析检验》[15]的方法，所有指标均重复测定3 次，下同。
1.4 酚类物质的测定
葡萄酒中总酚和花色苷含量的测定均参照苏鹏飞[16]的方法。
1.5 总单宁含量的测定
总单宁含量的测定采用胡立志等[17]的蛋白-单宁沉淀法。
1.6 游离态黄烷-3-醇单体含量的测定
取10 mL 酒样加入等体积乙酸乙酯，漩涡振荡2 min，3 500 r/min、4 ℃离心3 min，重复萃取3次收集有机相于旋转蒸发仪35 ℃蒸干，用色谱甲醇溶解残渣，经0.22 μm 有机滤膜过滤后，于-20℃冰箱中保存，待UPLC 分析。
UPLC 色谱条件：采用ACQUITY UPLC BEH HILIC C18 色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）。流动相A 为体积分数为0.2%磷酸的水溶液，流动相B为体积比为4∶1 的乙腈：0.2%磷酸水溶液。梯度洗脱程序：0～6 min，10% B；6～9 min，10%～15% B；9～12 min，15%～20% B；12～13 min，20%～30% B；13～15 min，30%～10% B。流速0.2 mL/min；柱温：25 ℃；样品温：4 ℃；检测波长：280 nm；进样量：0.5 μL。标准曲线见表2。
表2 六种黄烷-3-醇单体的标准曲线方程
Table 2 Regression equations for six kinds of flavan-3-ols monomers
?
1.7 缩合单宁结构组分的测定
将50 mL 酒样上样至Toyopearl HW-40C 凝胶柱（30 mm×250 mm），依次经300 mL 0.05%的三氟乙酸溶液、300 mL 甲醇/水 （体积比1 ∶1）和150 mL 丙酮/水（体积比2 ∶1）洗脱，收集丙酮部分，在38 ℃下减压浓缩以除去丙酮，最后用冷冻干燥机冻干，于-20 ℃冰箱中保存。
将上述干粉溶于10 mL 色谱甲醇中，取1 mL加入等体积的间苯三酚溶液（含有0.1 mol/L 盐酸的甲醇溶液，50 g/L 的间苯三酚和10 g/L 的抗坏血酸），将反应混合物于50 ℃放置20 min，然后加入5 倍体积的40 mmol/L 乙酸钠溶液以终止反应。所形成的产物经0.22 μm 滤膜过滤后，经UPLC 分析聚合态缩合单宁的结构组分。色谱条件同上，定性参考Kennedy[18]的方法。
1.8 涩感评价
涩感评价小组由11 名具有葡萄酒品尝基础且经过专业训练的成员组成。在评价酒样前，系统培训了小组成员涩感的相关知识，并利用不同溶液区分涩感（3 g/L 单宁）与酸（3 g/L 酒石酸）、甜（15 g/L 蔗糖）、苦味（15 mg/L 硫酸奎宁）之间的差异。之后，对质量浓度范围为1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 g/L 的单宁模拟酒溶液进行反复定位。在对酒样进行评价时，采用五点标度法对涩感强度进行评价，5 分为最强，4 分较强，3 分为中等强度，2 分较弱，1 分为最弱，几乎感觉不到。每评价完一款酒样后，用去离子水漱口2 次，并咀嚼苏打饼干使味觉得到恢复，且在对下一酒样进行评价前至少等待30 s，每个酒样的评价在5 min 内完成[19]。
1.9 数据处理
采用Microsoft Office Excel 2013 和Origin 9进行数据处理和图形绘制，利用IBM SPSS Statistics 20.0 进行显著性分析和主成分分析。
2 结果与分析
2.1 常规理化指标和酚类物质含量分析
表3给出了葡萄酒样品的常规理化指标和酚类物质含量。其中，赤霞珠葡萄酒的总酸含量在5.73～6.06 g/L 之间，pH 值在3.76～4.07 之间，酒度在11.51%Vol～13.69%Vol 之间；蛇龙珠葡萄酒的总酸在4.89～6.58 g/L 之间，pH 值在3.85～4.17 之间，酒度在10.07%Vol～11.75%Vol 之间。对于酚类物质而言，赤霞珠葡萄酒的总酚含量在1 368.65～1 847.84 mg/L 之间，蛇龙珠葡萄酒的总酚含量在1 012.99～1 567.95 mg/L 之间，不同年份间总酚含量存在显著差异，这可能是不同年份间的气候条件差异所导致的。此外，赤霞珠葡萄酒的花色苷含量在35.39～250.77 mg/L 之间，蛇龙珠的花色苷含量在31.41～223.53 mg/L 之间，且其含量随着陈酿时间的延长，呈显著降低的趋势，这与Chira 等[20]研究结果相同。
表3 常规理化指标和酚类物质含量
Table 3 Phyto-chemical indicators and polyphenols contents
注：结果表示为“平均值±标准差”；同列不同小写字母表示差异性显著（P<0.05），下同。
酒样 常规理化指标 酚类物质总酸/g·L-1 pH 值 酒度/%Vol 总酚/mg·L-1 花色苷/mg·L-1赤霞珠2011 6.06±0.00a 3.82±0.01c 13.30±0.00a 1 847.84±34.10a 40.44±1.99c 2012 5.79±0.13b 3.76±0.01d 13.34±0.01b 1 670.32±18.04b 35.39±4.56c 2017 5.90±0.03ab 4.02±0.01b 13.69±0.06b 1 368.65±13.42d 163.20±0.02b 2018 5.73±0.00b 4.07±0.01a 11.51±0.01c 1 479.89±62.05c 250.77±1.67a蛇龙珠2010 5.33±0.00b 3.85±0.03c 11.24±0.01b 1 567.95±43.12a 31.41±2.57c 2011 6.58±0.05a 3.87±0.01c 11.75±0.03a 1 288.37±35.86b 34.74±3.49c 2017 5.42±0.13b 4.08±0.02b 10.07±0.05c 1 195.95±31.46c 140.14±3.94b 2018 4.89±0.10c 4.17±0.03a 11.03±0.14b 1 012.99±15.18d 223.53±6.03a
2.2 总单宁含量分析
由图1可知，不同葡萄酒样品的总单宁含量在20.28～75.50 mg/L 之间，蛇龙珠葡萄酒的总单宁含量明显低于赤霞珠葡萄酒，说明葡萄酒中总单宁含量受葡萄品种的影响。大体而言，新酒中的总单宁含量显著高于陈酿酒，这与前人的研究结果一致[13-14]。陈酿酒中较低的单宁和花色苷含量主要是由于葡萄酒在陈酿过程中，两者之间相互结合，不仅形成橘黄色的产物，也使得两者的含量逐渐降低[21]。
图1 不同葡萄酒样品的总单宁含量
Fig.1 Total tannin content of different wines
2.3 游离态黄烷-3-醇单体含量分析
温鹏飞等[22]采用HPLC 法同时测定了葡萄酒中C、EC、ECG、EGC 和EGCG 5 种单体含量，其中，在干红葡萄酒中，C（33.81～51.04 mg/L）和EC（37.60～50.89 mg/L）含量相对较高，EGC（3.68～5.87 mg/L）和EGCG（1.45～6.22 mg/L）次之，ECG（0～2.39 mg/L）含量最低。Quijadamorín 等[6]采用HPLC-DAD/ESI/MS 测定了不同产区和年份的丹魄葡萄酒中C、EC、ECG、EGC 和GC 5 种黄烷-3-醇单体的含量，其中，在不同酒样中，C 含量最高（占37%～51%），GC（22%～34%）和EC（16%～28%）次之，EGC（4%～9%）和ECG（<1%）含量相对较低。而本研究在此基础上，利用UPLC 同时测定了葡萄酒中C、EC、GC、ECG、EGC 和EGCG 6 种黄烷-3-醇单体的含量，具有简单、高效、准确的优点。
由图2可知，在不同酒样中，C 含量占比（30.75%～53.69%）最高，EC（24.55%～38.93%）和EGC（5.15%～25.71%）次之，GC（4.16%～13.90%）、EGCG（2.92%～11.04%）和ECG（0.33%～1.90%）含量较少，与温鹏飞等[22]研究结果一致，而与Quijadamorín 等[6]的研究结果存在差异，文献报道GC含量在C、EC、ECG、EGC、GC 5 种黄烷-3-醇单体中占比22%～34%，而本研究中GC 含量相对较低，这可能是由品种和产地差异造成的。此外，新酒中的黄烷-3-醇单体含量大体上高于陈酿酒。对比不同单体，新酒中的C 和ECG 含量较高，陈酿酒中的EGC 和GC 含量较高，而EC 和EGCG 在新酒和陈酿酒中的含量差异不大。
图2 不同葡萄酒样品游离态黄烷-3-醇单体的含量
Fig.2 Flavan-3-ols monomers content of different wines
2.4 聚合态缩合单宁结构组分分析
表4显示，在各酒样的末端单元中，C 含量占比最高（16.80%～27.34%），EC 次之（9.66%～22.44%），ECG 占比最低（0.58%～2.68%）；而在延伸单元中，EC 含量占比最高（37.66%～54.88%），EGC（4.45%～9.11%）和ECG（1.70%～10.85%） 占比次之，C 含量占比最低（0.85%～1.99%），这与Hanlin 等[23]和Gonzalo-Diago 等[24]的研究结果一致。蛇龙珠葡萄酒末端单元中C 和EC 的占比均高于赤霞珠葡萄酒，而延伸单元中EC 和ECG 占比却低于赤霞珠葡萄酒，表明缩合单宁的结构组成在不同品种间存在差异。
度合聚其及分组构结的宁单合缩品样酒萄葡同不4表，main structural characteristics and mDP of condensed tannin from different wines Compositon Table 4 /%元单伸延/%元单端末mDP %G %PD %PC样酒ECG EC C EGC ECG EC C珠霞赤b 3.16±0.03 c 0.75±0.06 a c 21.87±0.22 77.38±0.28 c 4.62±0.40 b 49.68±0.71 a 1.20±0.08 b 8.59±0.08 c 0.80±0.14 a a 15.38±0.01 19.74±0.27 2011 b 3.22±0.07 c 0.74±0.07 a c 22.61±0.19 76.65±0.12 c 4.58±0.37 b ab 49.92±0.53 1.04±0.07 a 8.92±0.11 c 0.90±0.05 a a 15.44±0.38 19.22±1.20 2012 a 3.49±0.04 a 2.36±0.07 b b 18.50±0.31 a 79.13±0.24 b 10.85±0.28 50.95±0.40 b 1.00±0.08 c 6.73±0.14 b 1.46±0.01 c 9.66±0.04 a 19.38±0.13 2017 a 3.48±0.00 b 1.93±0.05 c a 14.58±0.29 83.49±0.24 b 8.27±0.16 a 54.88±0.11 b 0.85±0.00 d 5.26±0.12 a 1.99±0.00 b b 11.97±0.17 16.80±0.03 2018珠龙蛇a 2.95±0.01 a 0.03±0.01 a c 22.77±0.35 77.20±0.34 b 1.70±0.02 a 48.60±0.22 b 1.07±0.14 a 9.11±0.16 c 0.83±0.01 d c 16.05±0.02 22.64±0.05 2010 c 2.37±0.01 a 0.07±0.01 a c 22.28±0.47 77.65±0.46 a 3.30±0.02 d 37.66±0.48 a 1.99±0.09 b 8.43±0.22 a 2.68±0.31 b a 18.77±0.03 27.18±0.49 2011 b 2.48±0.01 a 0.11±0.08 b b 16.03±0.84 83.86±0.77 b 1.97±0.30 b 46.30±0.40 b 1.24±0.10 c 6.19±0.36 c 0.58±0.00 c b 17.84±0.00 25.90±0.25 2017 d 2.05±0.02 a 0.08±0.03 c a 11.97±0.18 87.94±0.15 a 3.20±0.16 c 39.29±0.30 a 1.95±0.03 d 4.45±0.07 b 1.33±0.09 a a 22.44±0.34 27.34±0.06 2018，%度程化酰子食：没；%G量的质物总量/的质物EGC元单伸延及元单端末，%PD=比占素雀翠：原；%PD量的质物总量/的质物、EC C元单伸延及、EC C元单端末，%PC=比占素青花：原：%PC注。量的质物总元单端末量/的质物总，mDP=度合聚均：平；mDP量的质物总/量的质物G=ECG
就缩合单宁的结构特性而言，在不同酒样中，原花青素占比（%PC）最高，原翠雀素占比（%PD）次之，没食子酰化程度占比（%G）最低，与Gonzalo-Diago 等[24]的研究结果一致。随着陈酿时间的延长，%PC 呈降低的趋势，而%PD 则呈升高的趋势。此外，2011年和2012年的赤霞珠葡萄酒间及2010年和2011年的蛇龙珠葡萄酒间，%PC、%PD 和%G 差异不显著，说明陈酿8～9年的干红葡萄酒，其单宁的结构逐渐趋于稳定。在所研究酒样中，其平均聚合度在2.05～3.49 之间，表明二聚体和三聚体可能是缩合单宁聚合物的主要存在形式，与Quijadamorín等[6]研究结果相近（2.9～4.3），而略低于Gonzalo-Diago 等[24]关于丹魄葡萄酒平均聚合度的研究结果（4.62～6.38），这可能与所研究的葡萄酒的产地及品种有关。
2.5 涩感强度与葡萄酒组分间的关系分析
将葡萄酒中的各组分与涩感强度进行主成分分析，结果见图3。涩感强度位于第1 主成分的正方向，与总单宁、平均聚合度、延伸单元EC、ECG、单体EGCG 及%G 关联度较强，说明涩感强度受这些因素的影响较大。其中，与Gawel 等[25]和Gonzalo-Diago 等[24]的研究结果相同，总单宁含量升高，葡萄酒的涩感强度也会增强，这是因为干燥等涩味感受通常是由单宁与唾液蛋白相互作用引起的。此外，涩感强度与平均聚合度（mDP）间也呈正相关关系，其强度随酒样平均聚合度的升高而增强，这与Chira 等[7]和Mcrae 等[26]研究结果一致。在各结构组分中，延伸单元中较高含量的EC、ECG 及游离态单体EGCG 会使涩感强度增加，而末端单元C、EC 和延伸单元C 则与涩感强度负相关，酒样中较高比例的此类组分，则会使涩感强度降低。第2主成分代表了pH 值、%PC 和花色苷等信息，而%PD、延伸单元EGC 与其负相关，涩感强度受这些因素的影响相对较少。
同时，由图3也可知，研究的8 款酒样两两聚为一类，其中，赤霞珠葡萄酒位于第1 主成分的正半轴，说明其涩感强度较大，且新酒和陈酿酒分别位于第2 主成分的正负半轴。而蛇龙珠葡萄酒位于第1 主成分的负半轴，说明其涩感强度相对较低，且新酒与陈酿酒的分布同赤霞珠葡萄酒相同，分别位于第2 主成分的正负半轴，说明利用这些指标可以对葡萄酒的品种及陈酿年份进行一定的划分。
图3 前两个主成分上的葡萄酒组分、涩感强度与酒样分布
Fig.3 Loadings of wine components，astringency intensity and wine sample distribution in the first two PCs
3 结论
对内蒙古产区不同年份赤霞珠和蛇龙珠葡萄酒单宁测定的结果表明，总单宁含量会受葡萄品种的影响，且新酒中的含量显著高于陈酿酒。儿茶素和表儿茶素是葡萄酒中最主要的两种游离态黄烷-3-醇单体，且新酒中的黄烷-3-醇单体含量高于陈酿酒，对于不同单体，新酒中的儿茶素和表儿茶素没食子酸酯含量较高，陈酿酒中的表棓儿茶素和棓酸儿茶素含量较高，而表儿茶素和表棓儿茶素没食子酸酯在新酒和陈酿酒中的含量差异不大。此外，所研究酒样的聚合态缩合单宁主要以二聚体和三聚体的形式存在，儿茶素和表儿茶素分别是末端单元和延伸单元中含量最丰富的单体，在其结构特性中，原花青素占比（%PC）最高，原翠雀素占比（%PD）次之，没食子酰化程度占比（%G）最低，且新酒中的%PC 占比较高，而陈酿酒中的%PD 占比较高，陈酿8～9年的干红葡萄酒，单宁的结构趋于稳定。
葡萄酒中各组分和涩感强度间的主成分分析表明，葡萄酒的涩感会随总单宁含量的升高或平均聚合度的增大而强度增大。同时，其受游离态单体表棓儿茶素没食子酸酯、延伸单元表儿茶素和表儿茶素没食子酸酯的影响也较大，而末端单元中较高含量的儿茶素和表儿茶素及延伸单元较高含量的儿茶素，则会使涩感强度降低。此外，葡萄酒的总酸、pH 值、酒度、总酚、花色苷及游离态单体对涩感的影响相对较小。
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