叶酸是一类人体必需的B 族维生素，在碳代谢、氨基酸代谢和细胞增殖生长中起着重要作用[1-2]。叶酸缺乏会导致一些健康问题，例如衰老过程中出现的认知障碍可能与体内低叶酸水平有关[3]，孕妇摄入的叶酸不足会导致胎儿出现神经管缺陷[4-5]和腭裂[6]，叶酸缺乏甚至还会导致一些癌症的发生[7]。可见，补充叶酸对于人体健康是十分重要的，然而，天然食品中叶酸种类多，含量低且不稳定[8]，人体通过摄食天然食品获取叶酸很有限。
L-5-甲基四氢叶酸钙（calcium L-5-methyltetrahydrofolate，L-5-MTHF-Ca） 是一种可以代替叶酸的新型营养补充剂，与叶酸相比，L-5-MTHF-Ca 具有更稳定且成本更低的优势[9]。有研究发现，这两种化合物在等摩尔剂量下具有相当的生理活性、生物利用度和吸收率[10-12]，甚至在某些方面摄取L-5-MTHFCa 比摄取叶酸的效果可能会更好[13-14]。目前生产L-5-MTHF-Ca 的方法多为人工合成，也有人通过基因工程的方法生产L-5-甲基四氢叶酸[15-16]，然而，无论哪种方法，最终得到的产品中都会含有少量的D-5-甲基四氢叶酸钙 （calcium D-5-methyltetrahydrofolate，D-5-MTHF-Ca），而对于D 型异构体的安全性目前尚无相关报道。建立一种可以对L-5-MTHF-Ca 进行分离、定量的检测方法意义重大。目前的检测方法多为高效液相色谱法和液相色谱串联质谱法[17-19]，这类检测方法虽可以测定5-甲基四氢叶酸的含量，但无法检测其中L-5-MTHF-Ca 的含量。针对这类问题，Gill 等[20]利用手性色谱法成功分离出RRR-α-生育酚。江锋等[21]采用手性高效液相色谱法成功测出白酒中D-乳酸和L-乳酸的含量。黄晓婉等[22]应用配位交换手性柱对L-硒-甲基硒代半胱氨酸进行分离与测定。
本文应用手性色谱法对L-5-MTHF-Ca 与其D 型异构体进行分离，并研究L-5-MTHF-Ca 的定量方法，同时进行方法学验证的相关指标测定，旨在为L-5-MTHF-Ca 含量的测定提供一个高效、可靠的方法。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
L-5-MTHF-Ca 对照品（纯度≥98.6%），Merck公司；D，L-5-MTHF-Ca 对照品 （纯度≥98.8%，L 型=49.8%），美国USP；乙腈 （纯度≤100%），Merck 公司；磷酸二氢钠（纯度≥99.5%），天津科密欧化学试剂有限公司；氢氧化钠 （纯度≥96.0%），国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
1260 Infinity II 型高效液相色谱系统，美国Agilent 公司；FA224 型电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；CHIRALPAK HSA 手性色谱柱（4 mm×150 mm，5 μm），上海大赛璐药物手性技术有限公司；PHS-3C 酸度计，郑州宝晶电子科技有限公司；MV-100 型涡旋混匀仪，武汉塞维尔生物科技有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 色谱条件 色谱柱：CHIRALPAK HSA 手性色谱柱（4 mm×150 mm，5 μm）；流动相：按照磷酸二氢钠缓冲溶液（称取4.54 g 磷酸二氢钠，用水溶解定容至1 000 mL）：乙腈=90∶10（V/V）的比例混合，用32%的氢氧化钠溶液调节pH 值至6.8 后过滤脱气；柱温：30 ℃；流速：0.6 mL/min；进样量：5 μL；检测器：VWD 紫外检测器；检测波长：280 nm。
1.3.2 L-5-MTHF-Ca 含量计算 根据试样溶液的色谱峰面积与标准曲线方程计算得到的L-5-MTHF-Ca 质量分数W，数值以%表示，计算公式如下：
式中：f （A）——通过将试样溶液的色谱峰面积代入标准曲线方程得到的L-5-MTHF-Ca 的质量，mg；m——样品的质量，mg。
1.3.3 专属性检测 准确称取D，L-5-MTHF-Ca对照品5 mg 于25 mL 容量瓶中，用水定容后超声溶解得到混标溶液。准确称取L-5-MTHF-Ca 对照品2.5 mg 于25 mL 容量瓶中，用水定容后超声溶解得到单标溶液。对这两种标准溶液分别进样，记录色谱图，确定各物质保留时间与分离度。
1.3.4 标准曲线的绘制 准确称取10 mg 的D，L-5-MTHF-Ca 对照品，置于50 mL 容量瓶中，用水定容至刻度后超声溶解。准确吸取0.6，1.2，1.8，3.0，5.0 mL 的上述溶液至5 mL 容量瓶中，用水定容至刻度后超声溶解。色谱进样前用0.45 μm 孔径的水相滤膜对样液进行过滤处理，进样5 μL，记录色谱图。以L-5-MTHF-Ca 的峰面积为纵坐标Y，每次所进样液中L-5-MTHF-Ca 的质量（μg）为横坐标X，绘制得到标准曲线。
1.3.5 定量限与检出限的检测 准确配制质量浓度为0.1 mg/mL 的D，L-5-MTHF-Ca 对照品溶液，用水成比例依次稀释得到一系列浓度梯度的待测溶液，将这些待测溶液依次进样，根据色谱图中L型峰的信噪比S/N≥10 和S/N≥3 为依据，得到该色谱条件下L-5-MTHF-Ca 的定量限与检出限。
1.3.6 精密度检测 配制线性关系下质量浓度为0.16 mg/mL 的D，L-5-MTHF-Ca 对照品溶液，重复进样6 次，以L-5-MTHF-Ca 的百分含量计算相对标准偏差（RSD）。
1.3.7 稳定性检测 配制线性关系下质量浓度为0.1 mg/mL 的L-5-MTHF-Ca 对照品溶液，分别在0，2，4，6，8，10 和12 min 时进样，以各时刻得到的色谱图中L-5-MTHF-Ca 的峰面积计算相对标准偏差（RSD）。
1.3.8 回收率检测 配制加标回收率检测溶液，将1 mg 的D，L-5-MTHF-Ca 对照品与0.75 mg 的L-5-MTHF-Ca 对照品混合置于5 mL 容量瓶，用水溶解定容至刻度得到检测溶液（1）；将1 mg 的D，L-5-MTHF-Ca 对照品与1 mg 的L-5-MTHFCa 对照品混合置于5 mL 容量瓶，用水溶解定容至刻度得到检测溶液 （2）；将1 mg 的D，L-5-MTHF-Ca 对照品与1.25 mg 的L-5-MTHF-Ca 对照品混合后置于5 mL 容量瓶，用水溶解定容至刻度得到检测溶液（3）；将1 mg 的D，L-5-MTHF-Ca对照品置于5 mL 容量瓶，用水溶解定容至刻度得到标准溶液。将检测溶液的L 型峰面积减去标准
溶液的L 型峰面积后再代入线性回归方程求得各检测溶液的L 型物测定加入量，从而计算得到加标回收率。
1.3.9 系统适用性检测 配制0.2 mg/mL 的D，L-5-MTHF-Ca 混标溶液与0.1 mg/mL 的L-5-MTHF-Ca 单标溶液，取1 mL 混标溶液，用单标溶液稀释到50 mL，进样记录色谱图得到D-5-MTHF-Ca 与L-5-MTHF-Ca 的分离度。
1.3.10 统计分析 本文中重复测定的结果以平均值±标准差表示。使用SPSS 统计分析软件进行数据分析。
2 结果与分析
2.1 专属性检测
由图1（A）L-5-MTHF-Ca 单标色谱图可知，L-5-MTHF-Ca 的保留时间为15.026 min，由图1（B） 可得，D-5-MTHF-Ca 的保留时间为10.052 min。D，L-5-MTHF-Ca 的分离度为3.24，不小于1.5，说明在此色谱条件下这两种手性物质可以得到较好的分离。
图1 L-5-MTHF-Ca 专属性检测图谱
Fig.1 Chromatograms to determine the specificity for L-5-MTHF-Ca
2.2 标准曲线的绘制
按照1.3.4 节配制标准曲线检测溶液，依次进样后记录色谱图，以L-5-MTHF-Ca 的峰面积为纵坐标Y，每次所进溶液中L-5-MTHF-Ca 的质量（μg）为横坐标X，绘制得到标准曲线（图2），得到的曲线方程为Y=4 289.28X-100.81，R2=0.9997，线性质量浓度范围为0.016～0.100 mg/mL，在此范围内线性关系良好。
图2 L-5-MTHF-Ca 标准曲线
Fig.2 Standard curve of L-5-MTHF-Ca
2.3 定量限与检出限的检测
按照1.3.5 节配制定量限与检出限待测溶液，依次稀释后进样，以信噪比S/N≥3 为检出限，信噪比S/N≥10 为定量限，测得在此色谱条件下L-5-MTHF-Ca 的检出限和定量限分别为3.11 μg/mL 和4.98 μg/mL。
2.4 精密度检测
按照1.3.6 节配制精密度检测溶液，取6 份检测溶液依次进样并记录色谱，以L-5-MTHF-Ca的百分含量进行计算，计算结果见表1，可知相对标准偏差（RSD）为0.36%，不大于2%，说明在此色谱条件下测定的精密度良好。
表1 L-5-MTHF-Ca 精密度检测试验结果表
Table 1 Experimental results of L-5-MTHF-Ca precision detection
?
2.5 稳定性检测
由图3可知，L-5-MTHF-Ca 的峰面积 （含量）随着时间的推移不断减少，杂质的峰面积（含量） 则随着时间的推移不断增加，说明L-5-MTHF-Ca 在放置过程会缓慢降解从而转变为其它杂质物质。相较于0 min 时L-5-MTHF-Ca 的峰面积，由12 min 时的峰面积计算得到的相对标准偏差（RSD）为0.66%，小于2%，而由2 min时的峰面积计算得到的相对标准偏差 （RSD）为0.13%，远小于2%，这也说明了虽然L-5-MTHF-Ca 会随时间缓慢降解，但只要在制样完成后尽快进样分析，那么由于物质降解造成的误差就可以忽略不计。
图3 L-5-MTHF-Ca 稳定性检测试验结果图
Fig.3 Experimental results of L-5-MTHF-Ca stability test
2.6 回收率检测
按照1.3.8 节配制3 组回收率检测溶液，分别进样后记录色谱图。回收率测定结果见表2，计算得到的加标平均回收率为103.71%，在80%～120%之间，说明在此色谱条件下测定的回收率良好。
表2 L-5-MTHF-Ca 回收率检测试验结果表
Table 2 Experimental results of L-5-MTHF-Ca recovery detection
?
2.7 系统适用性检测
按照1.3.9 节配制系统适用性溶液，进样后记录色谱图。由测定得到的谱图（图4）可知，D，L-5-MTHF-Ca 的分离度为3.0，不小于1.5，说明溶液中D-5-MTHF-Ca 在约0.002 mg/mL 的低质量浓度下也能与L-5-MTHF-Ca 很好地分离开来。
图4 L-5-MTHF-Ca 系统适用性检测谱图
Fig.4 Chromatogram for testing the applicability of L-5-MTHF-Ca system
3 结论
研究应用手性色谱法分离测定L-5-MTHFCa 的含量，测定方法使用高效液相色谱系统，色谱柱为CHIRALPAK HSA 手性色谱柱，检测波长为280 nm，流动相为磷酸二氢钠缓冲溶液∶乙腈=90∶10 的混合溶液，流速0.6 mL/min，进样量5 μL，柱温30 ℃。方法学验证结果表明，应用手性色谱法可以很好地分离D，L-5-MTHF-Ca 这一对手性物质，分离度达到3.24，并且在D 型物微量的情况下分离度也能达到3.0，L-5-MTHF-Ca 在0.016～0.100 mg/mL 质量浓度范围内线性关系良好，相关系数为0.9997，测得的检出限与定量限分别为3.11 μg/mL 和4.98 μg/mL，精密度测定的RSD 为0.38%，稳定性检测结果表明L-5-MTHF-Ca 会随时间缓慢降解需尽快进样测定，测得的加标平均回收率为103.71%。试验结果表明手性色谱法测定L-5-MTHF-Ca 含量的方法具有分离度高、精密度高、回收率高的优点，可以应用于各种食品与保健品中L-5-MTHF-Ca 的含量测定，也可以为其它手性物质的分离测定提供参考。
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