马瑟兰（Marselan）是一种原产于法国，由“赤霞珠”和“歌海娜”杂交获得的红色酿酒葡萄品种，兼具歌海娜的耐热性和赤霞珠的细致感，2001 年首次由怀来中法庄园引入，目前我国已成为世界上马瑟兰最大的产区之一[1-2]。河北怀来昼夜温差大，光照充足，无霜期可达到180～270 d，是我国最大的县级酿酒葡萄种植加工基地，特殊的地理气候条件造就了优质的马瑟兰酿酒葡萄，用其酿造的单品种和混酿葡萄酒风味独特，具有广阔的市场前景[3-4]。
葡萄酒酿造是酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、非酿酒酵母（Non-Saccharomyces cerevisiae）和多种微生物共同作用的结果[5]。目前，商业酿酒酵母的广泛使用导致葡萄酒同质化现象日益严重[6]。在自然发酵过程中丰富的非酿酒酵母有助于提高葡萄酒的复杂度和芳香性[7]。近年来，非酿酒酵母与酿酒酵母混合发酵受到葡萄酒行业的广泛关注[8]。非酿酒酵母如戴尔有孢圆酵母（Torulaspora delbrueckii）、发酵毕赤酵母（Pichia fermentans）、有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）等被报道用于葡萄酒酿造[9-11]。其中，戴尔有孢圆酵母（T.delbrueckii）在酿酒条件下具有高代谢活性以及对乙醇和SO2 的抗性，是葡萄酒酿造中最常使用的商业非酿酒酵母之一[12-13]。有研究表明，戴尔有孢圆酵母与酿酒酵母顺序发酵可促进脂肪酸乙酯的合成，尤其是己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯，对葡萄酒的香气具有积极影响[14]。然而，戴尔有孢圆酵母与酿酒酵母混合发酵对马瑟兰葡萄酒风味品质的影响鲜有报道。
本文以河北怀来产区马瑟兰酿酒葡萄为原料，研究戴尔有孢圆酵母与酿酒酵母同时接种和顺序接种发酵对马瑟兰葡萄酒基本理化指标、有机酸和挥发性风味物质的影响，并进行感官品评，以期为戴尔有孢圆酵母改善马瑟兰干红葡萄酒风味品质提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
马瑟兰葡萄：2021 年10 月从河北张家口中粮长城葡萄酒（怀来）有限公司葡萄园采摘，葡萄果实含糖量（以葡萄糖计）为251.73 g/L，含酸量（以酒石酸计）为5.33 g/L，pH 值为3.49。
酿酒酵母（S.cerevisiae）XR，LAMOTHE ABIET 公司；非酿酒酵母（T.delbrueckii）NS-D，安琪酵母股份有限公司。
3-辛醇（标准品），美国Sigma-Aldrich 公司；果胶酶（食品级），法国LAFFORT 公司；氯化钠（分析纯）、偏亚硫酸钾（食品级），国药集团有限公司；柠檬酸（分析纯）、磷酸（分析纯），天津市北辰方正试剂厂；磷酸氢二钠（分析纯），天津市科密欧化学试剂有限公司；有机酸混合标准品（苹果酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、富马酸），坛墨质检科技股份有限公司；甲醇（色谱纯），北京迪科马科技有限公司。
1.2 仪器与设备
7890B-5977A 气相色谱质谱联用仪，美国Agilent 公司；57328-u 顶空固相微萃取纤维头，Supelco 公 司；HP-INNOWAX 毛细管 色谱柱（60 m×250 μm，0.25 μm），美国Agilent 公司；Autosampler2707 高效液 相色谱 仪，Waters 公 司；Wine Scan FT 120 FOSS 仪，丹麦FOSS 公司；T6 新世纪紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司。
1.3 试验方法
发酵工艺流程：马瑟兰葡萄→穗选与粒选→除梗破碎→葡萄浆（果胶酶50 mg/L）→焦亚硫酸钾处理（100 mg/L）→冷浸渍24 h→接种戴尔有孢圆酵母（200 mg/L）和酿酒酵母（100 mg/L）→25 ℃发酵→发酵结束→皮渣分离、调硫→稳定澄清→马瑟兰干红葡萄酒。
酵母的活化：将商业非酿酒酵母NS-D 活性干粉按200 mg/L 置于无菌蒸馏水中，于30 ℃水浴锅活化15 min。将商业酿酒酵母XR 活性干粉按100 mg/L 置于无菌蒸馏水中，于30 ℃水浴锅活化15 min。
本试验设3 个处理组，1）SE：先接种戴尔有孢圆酵母，24 h 后接种XR；2）CO：同时接种XR 和戴尔有孢圆酵母；3）XR：只接种酿酒酵母XR。将除梗破碎后的葡萄果浆分别置于9 个5 L 发酵罐内（每处理3 个罐，每罐4 L 葡萄浆）。发酵过程中，每天记录发酵液的比重，直到比重小于0.996，残糖小于4 g/L 后，进行皮渣分离。将发酵前、后的样品放入100 mL 塑料瓶中，密封后置于-80 ℃冰箱贮存，用于理化指标、有机酸含量、挥发性风味物质测定及感官评价。
1.4 测定方法
1.4.1 理化指标的测定 利用FOSS 仪从波数926 cm-1 到5 012 cm-1 进行透射扫描，测定葡萄酒的pH 值、残糖、总酸和酒精度等基本理化指标。
色度、色调值：参照梁冬梅等[15]方法测定，酒样经0.45 μm 水系膜过滤，用与酒样pH 值一致的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（0.2 mol/L 磷酸氢二钠溶液，0.1 mol/L 柠檬酸溶液）将酒样稀释10 倍，用1 cm 比色皿用紫外分光光度计在波长420，520，620 nm 处测定其吸光值，其中：色度=A420nm+A520nm+A620nm，色调=A420nm/A520nm。
1.4.2 挥发性化合物的测定 参照夏亚男等[16]方法并稍加改进。顶空固相微萃取：样品解冻后，吸取7.5 mL 葡萄酒，加入20 mL 顶空瓶中，同时加入10 μL 3-辛醇（300 mg/L）和1 g NaCl，40 ℃水浴预平衡15 min 后，插入萃取头吸附40 min，于GC 进样口解析6 min。
色谱分析条件：柱温箱的升温程序为：50 ℃保持2 min，然后以3 ℃/min 的速率升至80 ℃，再以5 ℃/min 速率升至230 ℃，持续6 min。采用不分流进样，进样口温度240 ℃，载气He，流量1 mL/min。质谱条件：EI 电离源，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃。溶剂延迟时间8 min，总离子流扫描范围m/z 35～550。
定性分析：利用质谱扫描图谱与NIST14.L 谱库进行比对定性，对匹配度80%以上的组分进行分析。
定量分析：各成分的含量采用内标法进行半定量，计算样品中各香气组分含量。
1.4.3 有机酸测含量的测定 参照GB/T 5009.157-2003《食品中有机酸的测定》[17]，并稍作修改。色谱柱：C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：A为纯甲醇，B 为0.1%磷酸溶液；流速：1.0 mL/min；进样量：20 μL；检测器（Agilent DAD）波长：220 nm；柱温：40 ℃；梯度洗脱程序：0～4 min，90%B；4～5 min，90%～40%B；5～7 min，40%～10%B；7～9 min，10%B；9～10 min，10%～90%B。
1.4.4 感官评价 专家组成员为葡萄酒生产企业中具有品酒师资质的人员和研发人员共11 人组成（女性7 人，男性4 人，年龄29～65 岁，平均40岁）。分别从酒样的外观（颜色、澄清度）、口感（酸度、甜度）、香气（浓郁度、典型性、氧化味）和总体评分4 个方面对各葡萄酒样品进行感官评价，评分范围从0（弱）到10（最大强度），结果为所有评估小组成员得分的平均值。
1.5 试验结果统计分析方法
采用SPSS26.0 统计分析软件对数据进行差异显著性分析，采用单因素方差分析Dun-can 检验两两比较，显著性水平P〈0.05。使用Origin 2021 软件进行图形绘制和主成分分析。
2 结果与分析
2.1 基本理化指标测定结果
酒精发酵前、后的主要理化指标见表1。酒精发酵后各处理组残糖含量范围为2.77～3.23 g/L，均低于4 g/L。CO 残糖含量显著低于其它处理组（P〈0.05），酒精度显著高于XR 和SE（P〈0.05），发酵最为彻底，这与尹雪林等[9]研究的戴尔有孢圆酵母混菌发酵猕猴桃酒的结果一致。与XR 相比，SE和CO 总酸含量显著降低，pH 显著增加（P〈0.05），总酸和pH 值的变化一般是由发酵过程有机酸的产生和降解介导[18]。XR 色度显著高于SE 和CO（P〈0.05），CO 色调显著高于XR 和SE（P〈0.05），后者之间无显著差异。色调值越高，表明葡萄酒黄色比例越高，红色比例越低，这可能与戴尔有孢圆酵母与葡萄酒中儿茶素直接缩合生成锦葵苷二聚体有关[19-20]。
表1 混合发酵对马瑟兰干红葡萄酒主要理化指标的影响
Table 1 Effect of mixed fermentation on main physical and chemical indexes of Marselan dry red wine
注：不同字母代表差异性显著（P〈0.05）。
2.2 混合发酵对马瑟兰干红葡萄酒有机酸含量的影响
混合发酵对马瑟兰干红葡萄酒有机酸含量的影响如图1 所示。葡萄汁中主要有机酸含量依次为苹果酸、酒石酸、琥珀酸和柠檬酸。混合发酵样品中苹果酸和酒石酸含量显著低于XR（P〈0.05），表明戴尔有孢圆酵母具有较强的降解苹果酸和酒石酸能力，这与Belda 等[21]的研究结果一致。混合发酵酒样中琥珀酸和柠檬酸含量显著高于XR（P〈0.05），与Martín-García 等[22]关于戴尔有孢圆酵母琥珀酸和柠檬酸的报道相异，可能与使用的菌株和发酵条件有关。有机酸可赋予葡萄酒清新爽快的口感、平衡饱满的酒体，并与醇类化合物作用生成酯，发酵过程中有机酸消长对葡萄酒的香气、颜色、风味和口感会产生重要影响[23-24]。
图1 混合发酵对马瑟兰干红葡萄酒有机酸含量的影响
Fig.1 Effect of mixed fermentation on organic acid content of Marselan dry red wine
注：不同字母代表差异性显著（P〈0.05）。
2.3 混合发酵对马瑟兰干红葡萄酒挥发性成分的影响
混合发酵对马瑟兰干红葡萄酒挥发性成分的影响见表2。从马瑟兰干红葡萄酒中共检出38 种挥发性香气化合物，包括16 种酯、14 种醇、4 种脂肪酸和4 种其它化合物。方差分析结果表明，不同处理对马瑟兰干红葡萄酒挥发性成分的影响差异显著（P〈0.05），SE 挥发性成分含量显著高于CO和XR（P〈0.05）。
2.3.1 混合发酵对酯类物质含量的影响 顺序接种和同时接种的酯类含量分别比对照组高出145.06 μg/L 和84.64 μg/L，表明混合发酵有助于提高葡萄酒中酯类含量，这与宋茹茹等[14]的研究结果一致。酯类化合物包括乙酸酯和脂肪酸乙酯两种重要的香气化合物，对葡萄酒中水果香气特征具有积极贡献[25]。本试验共检出4 种乙酸酯，其中SE 乙酸异戊酯含量显著高于其它处理组（P〈0.05），且超过其阈值，赋予葡萄酒愉悦的水果味。耿仕瑾等[26]研究发现戴尔有孢圆酵母与酿酒酵母顺序接种，可显著提高小芒森葡萄酒乙酸异戊酯的含量（P〈0.05）。本试验中检出的9 种脂肪酸乙酯中辛酸乙酯（白兰地、果香）、癸酸乙酯（果香、脂香）、己酸乙酯（香蕉、青苹果）OAV〉1，十二酸乙酯（花香）OAV〉0.2，对葡萄酒香气有积极的贡献[27]。同时接种的马瑟兰葡萄酒具有较强的产脂肪酸乙酯能力，辛酸乙酯、癸酸乙酯、庚酸乙酯、己酸乙酯和9-癸烯酸乙酯含量较高。其中辛酸乙酯是所有脂肪酸酯中含量最高的化合物，会产生令人愉悦的水果风味[28]。有研究表明，戴尔有孢圆酵母与酿酒酵母顺序发酵可增加龙眼葡萄酒丁酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯的含量[29]。原苗苗等[30]研究表明，戴尔有孢圆酵母明显提高了赤霞珠脂肪酸乙酯的含量，提高了乙酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯的含量。综上所述，辛酸乙酯和癸酸乙酯有可能是戴尔有孢圆酵母的特征香气。
2.3.2 混合发酵对醇类物质含量的影响 醇类也是构成葡萄酒香气的基本化合物。在氨基酸或糖的作用下，通过Ehrlich 途径由酵母代谢产生高级醇[31]。高级醇与有机酸反应生成芳香的酯类，而过量可能会导致难闻的酒精味[32]。不同处理对马瑟兰干红葡萄酒醇类物质含量的影响差异显著（P〈0.05），混合发酵的葡萄酒醇类含量高于对照组（P〈0.05）。祝霞等[33]研究发现，戴尔有孢圆酵母顺序接种发酵可显著增加醇类化合物含量，提高酒体的层次感。本试验结果表明SE 醇类化合物的含量最高，主要有正己醇、异戊醇、苯乙醇和异丁醇等物质，其中异戊醇是高级醇中含量占比最高，达到2 969.75 μg/L，比含量最低的对照组高出989.25 μg，给葡萄酒带来酒精味、溶剂味和指甲油的气味[34]。苯乙醇赋予葡萄酒令人愉悦的果香，顺序接种的苯乙醇含量显著高于其它处理组（P〈0.05），苯乙醇含量的增加可能与戴尔有孢圆酵母中β-葡萄糖苷酶的活性有关，也有可能是酵母中β-葡萄糖苷酶与L-苯丙氨酸共同作用的结果[30]。C6 醇为葡萄酒提供了青草和植物味道，正己醇含量占C6 醇90%以上。正己醇在不同处理组差异显著，顺序接种的含量最高（603.71 μg/L），同时接种的含量最低（532.28 μg/L）。
2.3.3 混合发酵对脂肪酸类物质含量的影响 脂肪酸是葡萄酒复杂性和水果香气平衡的重要挥发性物质，也是发酵过程中酵母和乳酸菌代谢产生的副产物。本试验中检测到4 种酸类：乙酸、辛酸、癸酸和己酸，顺序接种与对照组脂肪酸含量差异不大，同时接种含量最少，这与Azzolini 等[35]的报道一致，即戴尔有孢圆酵母与酿酒酵母混合发酵后，脂肪酸含量显著降低。乙酸是发酵食品中特有的风味化合物，具有刺鼻的醋酸味，其中同时接种的含量最高达到16.5 μg/L。各处理组中酸类含量均低于阈值，降低了不良风味的影响。
2.4 主成分分析
不同接种方式香气物质的主成分分析如图2所示。其中PC1 和PC2 分别占57.1%和29.3%，累计贡献达到86.4%。根据不同接种方式，可以将其分为3 类。
图2 香气化合物主成分分析的因子载荷图
Fig.2 Factor load diagram of principal component analysis of aroma compounds
葡萄汁分布在PC1 负极和PC2 正极，棕榈酸乙酯（Y13）、反式-2-己烯-1-醇（Y20）、1-辛烯-3-醇（Y30）和正己醛（Y37）在汁中含量较高。SE 分布在PC1 正极和PC2 的负极，与乙酸苯乙酯（Y3）、辛酸乙酯（Y5）、丁酸乙酯（Y8）、辛酸3-甲基丁酯（Y14）、正己醇（Y17）、苯乙醇（Y24）、异戊醇（Y25）、异丁醇（Y26）、D-香茅醇（Y27）、2，3-丁二醇（Y28）和己酸（Y34）等物质的相关性强，主要是为葡萄酒贡献比较浓郁的果香和花香。XR 和CO 分布在PC1 和PC2 的正极，同时接种葡萄酒中一些重要酯类如己酸乙酯（Y9）、十二酸乙酯（Y10）、丁酸香茅酯（Y15）和乙酸（Y31）的含量较高；而XR 中乙酸己酯（Y1）、乙酸庚酯（Y4）、（E）-3-己烯-1-醇（Y18）、3-己烯-1-醇（Y19）、1-壬醇（Y22）、1-癸醇（Y23）、1-辛醇（Y29）、癸酸（Y33）含量较高。以上表明不同接种方式发酵可以改变葡萄酒的香气轮廓，提升葡萄酒香气的复杂性。
2.5 混合发酵对马瑟兰干红葡萄酒感官品质的影响
马瑟兰干红葡萄酒感官评价如图3 所示。各处理澄清度、色泽和甜度无明显差异，颜色主要呈带紫色调的深宝石红色。在口感方面，处理组酸度略低于对照组，CO 的得分略低于SE，说明同时接种的降酸效果明显。在香气方面，SE 的香气典型性略高于CO 和XR，表明顺序接种方式能够增加葡萄酒的典型性。XR 具有较强烈的氧化味，明显高于SE 和CO。挥发性成分和理化指标测定结果与感官品评结果基本相符。在总体评价方面，SE风味接受度略高于其它处理组，具有良好的口感和较为浓郁的果香。
图3 马瑟兰干红葡萄酒感官雷达图
Fig.3 Sensory radar of Marselan dry red wine
3 结论
本文主要研究戴尔有孢圆酵母与酿酒酵母顺序和同时接种对马瑟兰葡萄酒品质的影响。3 个试验组的葡萄酒均能完成酒精发酵，残糖、总酸、酒精度均达到国家标准。戴尔有孢圆酵母混合发酵较对照组显著降低了苹果酸和酒石酸含量，增加了琥珀酸和柠檬酸含量。在香气方面，戴尔有孢圆酵母与酿酒酵母混合发酵显著提高了马瑟兰葡萄酒中酯类和醇类含量。同时接种处理组的脂肪酸乙酯类含量最高，顺序接种乙酸酯和醇类含量明显高于其它处理组，尤其是乙酸异戊酯、正己醇、苯乙醇、异戊醇和异丁醇等物质，赋予马瑟兰葡萄酒花果香味。感官评价表明顺序发酵能够增加葡萄酒香气，改善葡萄酒口感。综上所述，戴尔有孢圆酵母和酿酒酵母顺序接种发酵能够有效改善马瑟兰葡萄酒的风味品质，为其在马瑟兰葡萄酒生产中的应用提供理论依据[1]。
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