低聚半乳糖（Galactooligosaccharides，GOS）是人乳中含量较多的低聚糖[1]，由半乳糖残基和末端葡萄糖通过β-糖苷键连接而成的低聚糖。目前的商业GOS 是含有大量单糖和双糖的混合低聚糖；不同供应商的GOS 的连接类型和聚合程度差异很大[2]。GOS 具有优良的益生功能，抵抗近端胃肠道消化的能力极强，能够促进双歧杆菌的定殖。人体摄入一定量的GOS 可以提高肠道吸收镁和铁元素的能力，在改善儿童缺铁性贫血方面具有积极作用[3]。此外，GOS 还具有降低龋齿发生率、促进脂质代谢、保护肝脏、预防结肠癌等功能[4-5]。
大部分双歧杆菌（Bifidobacterium）是从婴儿粪便中分离得到的，它是一种对人体肠道极其重要的微生物[6]。双歧杆菌不仅可以促进机体生长发育，抑制肿瘤和衰老，还可以调节肠道动态平衡，促进肠道屏障的完整性，减轻结肠炎症状，增强机体免疫力[7-11]。双歧杆菌可以分解各种饮食来源和宿主肠道内的碳水化合物，从而显著促进宿主的新陈代谢，这一特征不仅保证其在肠道中的定殖，而且通过交叉喂养策略为宿主和其它肠道微生物提供营养[12-13]。
双歧杆菌发酵GOS 的能力依赖于GOS 的聚合度和糖苷键类型。有研究证明双歧杆菌更加倾向于分解利用高聚合度的GOS[14]。Taskwan 等[15]分析双歧杆菌与乳酸菌利用的GOS 的情况，发现婴儿双歧杆菌M63 和婴儿双歧杆菌ATCC 15697 能够很好地利用短链低聚半乳糖（Short chain galacto-oligosaccharides，SC-GOS）。SC-GOS 可以调节肠道微生物组成，增加双歧杆菌的丰度，改善乳糖不耐受症[16]。Xiao 等[17]给小鼠喂食含2’-岩藻糖基乳糖、SC-GOS 和长链低聚果糖（Long chain fructo-oligosaccharides，LC-FOS）的混合物，发现小鼠的肠道微生物区系组成发生变化，并且代谢功能和免疫系统功能得到改善。有研究证实给婴儿食用SC-GOS、LC-FOS 与短双歧杆菌M-16V的混合物，可使其粪便变软，粪便中双歧杆菌的数量大大增加[18]。婴儿食用含有SC-GOS 和LC-FOS的婴配粉可以降低肠绞痛的发生率[19]，预防轮状病毒引起的腹泻症状[20]，促进婴儿的生长发育[21]。然而，目前有关利用SC-GOS 的双歧杆菌研究较少，菌株资源较为有限。
本课题组从婴儿粪便中分离得到126 株双歧杆菌，以SC-GOS 为唯一碳源，从中筛选高效利用SC-GOS 的双歧杆菌，结合基因测序技术确定其种属。评价胞外多糖含量、菌体表面蛋白含量、表面疏水性和自聚集能力、模拟胃液耐受能力、胆盐耐受能力以及上清液抑菌能力，以期获得高效利用SC-GOS 且益生特性优良的双歧杆菌菌株，为开发出含有GOS 和双歧杆菌的产品提供菌株资源。
1 材料与方法
1.1 微生物菌株
婴儿双歧杆菌M63（Bifidobacterium longum subsp.infantis M63，BI_M63）为实验室保藏菌种，婴儿双歧杆菌ATCC 15697（Bifidobacterium longum subsp.infantis ATCC 15697，BI_15697）及大肠杆菌ATCC 25922（Escherichia coli ATCC 25922，EC_25922）购自中国微生物菌种保藏中心。
1.2 主要材料与试剂
低聚半乳糖（GOS）、葡萄糖、乳糖，上海源叶生物科技有限公司；MRS 肉汤培养基，青岛海博生物公司；L-半胱氨酸盐酸盐（L-Cysteine HCl），德国BioFroxx 公司；猪胆盐，上海瑞永生物科技有限公司；胃蛋白酶，天津阿尔法生物科技有限公司；DNA 提取试剂盒Omega D4015-01，Omega Bio-Tek 公司
1.3 主要仪器与设备
CMax Plus 酶标仪，美谷分子仪器（上海）有限公司；SPL-150 生化培养箱，天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司；ZWY-A2102C 恒温培养振荡器，上海智城分析仪器制造有限公司；TGL-23 离心机，四川蜀科仪器有限公司；BSC-1100-L ⅡA2生物安全柜，北京东联哈尔仪器制造有限公司。
1.4 培养基
还原液配制方法如下：10 g/L 细菌蛋白胨，5 g/L 氯化钠，0.5 g/L L-Cysteine HCl，1 mL/L 吐温80。121 ℃灭菌15 min。RB 琼脂培养基参照郭春峰[22]的方法配制，118 ℃灭菌15 min。MRSC 培养基配制方法如下：MRS 肉汤培养基添加0.5 g/L LCysteine HCl，加入15 g/L 琼脂制成MRSC 固体培养基，118 ℃灭菌15 min。无碳源MRSC 培养基配制方法如下：10 g/L 细菌蛋白胨、5 g/L 酵母浸粉、0.5 g/L L-Cysteine HCl、2 g/L 磷酸氢二钾、5 g/L无水乙酸钠、2 g/L 柠檬酸铵、0.2 g/L 七水硫酸镁、0.05 g/L 一水硫酸锰、1 mL/L 吐温80，118 ℃灭菌15 min。
不同碳源培养基配制方法如下：在上述无碳源MRSC 培养基中分别添加10 g/L 的P-GOS/GOS/葡萄糖/乳糖，118 ℃灭菌15 min。
1.5 试验方法
1.5.1 菌株活化 将课题组前期从婴儿粪便中筛选分离得到的126 株双歧杆菌菌株活化，即以1%接种量接种至MRSC 液体培养基，37 ℃厌氧培养24 h，传代18 h 备用。
1.5.2 SC-GOS 的制备 根据Taksawan 等[15]的方法制备SC-GOS。即将0.15 mg/mL GOS 加样到已装填好Sephadex G-25 凝胶（Sigma-Aldrich）的XK 16/100 柱（GE Healthcare Life Science）中，洗脱收集。以乳糖为对照，应用苯酚-硫酸法[23]确定GOS 和乳糖的出峰时间，收集GOS 和乳糖不重合部分，混合冻干得到SC-GOS，用于后续试验。利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱分析确定所得到SC-GOS 中不含有单糖和双糖。
1.5.3 可利用SC-GOS 的双歧杆菌筛选 取1 mL 上述1.5.1 节菌液离心（10 000×g，5 min，4℃），水洗沉淀并重悬制备菌悬液。分别取200 μL SC-GOS-培养基、GOS-培养基、葡萄糖-培养基、乳糖-培养基至96 孔板中，以1%接种量接种菌悬液，设置对照组（无碳源MRSC 培养基、SCGOS-培养基、GOS-培养基、葡萄糖-培养基、乳糖-培养基以及加菌的无碳源MRSC 培养基）。37℃厌氧培养，测定0，24，48 h 的OD595nm 值以确定能利用SC-GOS 的双歧杆菌。
1.5.4 利用SC-GOS 双歧杆菌的生物学鉴定 利用细菌基因组DNA 提取试剂盒Omega D4015-01提取细菌基因组DNA。根据郑慧娟等[24]的研究用双歧杆菌特异引物（Bif164-F：5’-GGGTGGTAATGCCGGATG-3’；Pbi R2：5’-GACCATGCACCACCTGTGAA-3’）对菌株DNA 进行扩增，1%琼脂糖凝胶电泳，送至上海生工生物科技有限公司测序。序列进行BLAST 比对分析，确定菌株种属。
1.5.5 利用SC-GOS 双歧杆菌形态观察取1 mL 上述1.5.1 节菌液离心（10 000×g，5 min，4℃），PBS 洗涤，应用孙明明等[25]方法处理。即用2.5%戊二醛处理12 h，乙醇系列脱水并冷冻干燥，应用钨灯丝扫描电子显微镜S-3400N 观察菌体形态。
1.5.6 益生特性分析
1.5.6.1 胞外多糖产量测定 取10 mL 上述1.5.1节菌液离心（6 000×g，10 min，4 ℃），将上清液与3倍体积乙醇混合，4 ℃沉淀16 h，用3.5 ku 透析袋透析，每8 h 换1 次水，透析48 h。用Alcian Blue法[26]测定胞外多糖产量。
1.5.6.2 菌体表面蛋白含量测定 取10 mL 上述1.5.1节菌液离心（6 000×g，10 min，4 ℃），PBS 洗2次，加入2 mL 5 mol/L LiCl，恒温振荡反应（200 r/min，1 h，37 ℃），离心（6 000×g，10 min，4 ℃），将上清液与2 倍体积冰丙酮混合，-20 ℃放置过夜。应用Bradford 法[27]测定菌体表面蛋白含量。
1.5.6.3 表面疏水性的测定 取3 mL 上述1.5.1节菌液，加入等体积二甲苯，恒温振荡反应（250 r/min，10 min，37 ℃），静置1 h。吸取水相测定波长595 nm 处的吸光度。重复进行3 次，取平均值。疏水性（H）计算公式：
式中，A0——0 h 吸光度；A1——不同时间吸光度。
1.5.6.4 自聚集能力的测定 取5 mL 上述1.5.1节菌液离心（4 500×g，15 min，4 ℃），PBS 缓冲液洗涤并重悬制备菌悬液，测定0，2，4，6 h 上述菌悬液在595 nm 下的吸光度。自聚集率（A）计算公式：
式中，A0——0 h 吸光度；At——不同时间吸光度。
1.5.6.5 模拟胃液耐受能力分析 取上述1.5.1节菌液按体积比1∶5 接种至pH 值为2.0 的人工胃液（胃蛋白酶10 g/L，加入盐酸溶液调节pH 值）中，37 ℃静置培养，分别在0 h、30 min、3 h 时菌落计数。1.5.6.6 胆盐耐受能力分析 取1 mL 上述1.5.1节菌液离心（10 000×g，5 min，4 ℃），洗涤菌体2次，重悬于含0.2%猪胆盐的MRSC 培养液中，37℃厌氧培养，分别在0 h 和30 min 时菌落计数。1.5.6.7 无细胞上清液抑菌能力测定 取5 mL上述1.5.1 节菌液离心（10 000×g，5 min，4 ℃），将上清液通过0.22 μm 的微孔滤膜。以EC_25922 为指示菌，应用牛津杯法[28]评估各菌株抑菌能力。
1.6 数据处理与分析
所有试验均独立进行3 次，结果以平均值±标准差（
）表示。试验数据使用SPSS 软件进行沃勒-邓肯显著性分析，P<0.05，差异显著。使用Origin 8.0 和GraphPad Prism 8 进行绘图。
2 结果与分析
2.1 利用SC-GOS 的双歧杆菌筛选及16S rDNA 鉴定结果
Thomson 等[29]发现BI_15697 在0.5% GOS 上生长48 h 的OD595nm 在0.3 左右，本研究发现BI_15697 在1% SC-GOS 和GOS 培养基中生长48 h 的OD595nm 分别为0.25 和0.63，故以BI_15697和BI_M63 作为对照菌株，SC-GOS、GOS 作为筛选的标志物，共54 株利用SC-GOS 效果优于BI_15697。根据菌落形态、来源、镜检结果等，最终选择7 株利用SC-GOS 能力（OD595nm﹥0.80）远强于BI_15697（P<0.05）的双歧杆菌进行16S rDNA鉴定。鉴定结果显示，1 株长双歧杆菌婴儿亚种BI_Y46，2 株两歧双歧杆菌（BB_Y22、BB_S7），2株假小链双歧杆菌（BP_Y43、BP_YA）以及2 株长双歧杆菌（BL_S34、BL_H26）。双歧杆菌利用SCGOS 情况及发育树见图1，序列比对结果见表1。
表1 NCBI BLAST 比对结果
Table 1 NCBI BLAST comparison results
表2 各试验菌株自聚集能力（，n=3）
Table 2 The self-aggregation ability of each experimental strain（，n=3）
注：不同大写字母为同一菌株不同时间差异显著（P<0.05），不同小写字母为不同菌株同一时间差异显著（P<0.05）。
图1 碳源利用情况及系统发育树
Fig.1 Utilization of carbon sources and phylogenetic tree
2.2 扫描电镜观察双歧杆菌形态
扫描电镜观察菌株形态如图2 所示，BL_S34（f）和BL_H26（g）呈勺状；BP_YA（d）中含分叉结构；BB_Y22（a）为弯杆状、BP_Y43（b）和BB_S7（e）为长杆状，表面均较为光滑。值得注意的是，BI_Y46（c）具有独特的菌毛结构，Francesca 等[30]发现两歧双歧杆菌PRL2010 具有的菌毛结构有助于其黏附，并且具有免疫调节活性。短双歧杆菌UCC2003 中也存在菌毛结构，虽然短双歧杆菌UCC2003 不能单独利用3’-唾液酸乳糖或部分岩藻糖，但可以与两歧双歧杆菌PRL2010 共培养形成交叉喂养，发挥益生作用[31-32]。因此推断菌体表面存在菌毛的BI_Y46 可能具有较强黏附能力，同时具有抑制病原菌等功能，未来将通过更多试验进行验证。
图2 SEM 观察利用SC-GOS 的双歧杆菌形态图
Fig.2 Observation of Bifidobacterium morphology using SC-GOS by SEM
2.3 利用SC-GOS 的双歧杆菌胞外多糖产量
利用SC-GOS 的双歧杆菌胞外多糖产量见图3。其中，BB_Y22 胞外多糖产量最高，为（0.49±0.04）mg/mL，BI_Y46 以及BL_H26 胞外多糖产量在0.4～0.45 mg/mL 之间。目前针对高产胞外多糖的双歧杆菌研究较少，一般胞外多糖产量在几十到几百毫克每升不等，蔡静静等[33]分离得到双歧杆菌胞外多糖产量在0.4 mg/mL 左右，故BB_Y22、BP_Y43 属于产胞外多糖能力较强的菌株，为未来应用提供一定参考。
图3 利用SC-GOS 双歧杆菌的胞外多糖产量（，n=3）
Fig.3 The exopolysaccharide yield of Bifidobacteria able to utilize SC-GOS（，n=3）
注：不同小写字母表示差异显著（P<0.05），下同。
2.4 利用SC-GOS 的双歧杆菌菌体表面蛋白含量分析
表面蛋白可以延长益生菌在肠道发挥作用的时间[34]，本试验测定菌体表面蛋白，为后续分析其具体成分或探讨其黏附功能及机制奠定基础。各试验菌株菌体表面蛋白含量见图4。结果表明，BL_H26 菌体表面蛋白含量较高，为（0.74±0.07）mg/mL（P<0.05），而BB_Y22、BB_S7、BL_S34 含量接近，均在0.35～0.45 mg/mL 范围；所有菌株表面蛋白含量均超过BI_15697。目前有关双歧杆菌菌体表面蛋白的报道不多，后续将对双歧杆菌的表面蛋白进一步分离，以探讨其的功能特性。
图4 利用SC-GOS 双歧杆菌菌体表面蛋白含量（，n=3）
Fig.4 Surface protein content of Bifidobacteria able to utilize SC-GOS（，n=3）
2.5 表面疏水性和自聚集能力
表面疏水性和自聚集能力与黏附能力密切相关，具有良好黏附能力的益生菌株可以抑制致病菌的侵袭[35]。以BI_M63 和BI_15697 作为对照，各试验菌株表面疏水性如图5 所示。结果表明，BP_Y43、BP_YA 表面疏水性为24.96%，24.90%，与BI_15697、BI_M63 的表面疏水性差异较小，而显著高于BI_Y46 和BL_H26（P<0.05）；其余菌株如BB_Y22、BB_S7、BB_S34 表面疏水能力处于中等水平，均在15%左右，低于陈美瑄[36]筛选得到的双歧杆菌Probio-M9（50%），可能是由于处理条件不同导致的。
图5 各试验菌株表面疏水性（，n=3）
Fig.5 Surface hydrophobicity of each experimental strain（
，n=3）
自聚集试验表明，BB_Y22 和BP_Y43 整体自聚集能力较强，BL_H26 较弱。在2 h 时，BB_Y22和BP_Y43 的自聚集百分比分别为（51.08±4.02）%和（55.27±5.94）%，明显高于其它菌株（P<0.05），其余菌株与赵笑笑等[37]的研究基本一致，在10%～30%范围。在4 h 时，BB_Y22 高达（73.16±4.06）%，提高了20%左右，同时BP_Y43、BI_Y46、BP_YA、BB_S7 以及BL_S34 都有显著提升，而BI_M63 和BI_15697 变化较小，在4 h 时分别为（27.37±1.89）%和（32.80±3.82）%；在6 h 时，BB_Y22 和BP_Y43 达到了80%以上，远高于其它菌株（P<0.05），同时超过陈美瑄[36]筛选得到的双歧杆菌Probio-M8（58%）和Probio-M9（78%）。
2.6 利用SC-GOS 的双歧杆菌模拟胃液耐受情况分析
双歧杆菌为到达并稳定地定居在大肠，必须应对胃肠道上发生的大量氧化、渗透、胆盐或胃液应激挑战[38]。以BI_M63 和BI_15697 作为对照，各试验菌株在模拟胃液pH 2.0 时的耐受情况如表3 所示。处理30 min 与0 h 相比，BI_M63、BP_YA、BB_S7 菌落数量略微增长或持平，而其余菌株菌落数量减少，BI_15697 相对减少菌落数量最多（P<0.05）；处理3 h 与0 h 相比，BI_15697 的存活率最低（P<0.05），BI_M63 菌落数量增加，这可能与应激反应产生的物质相关，即受到刺激后产生促进自身生长的物质。其余菌株存活率接近100%，说明菌株具有较强的胃液耐受性，所有筛选得到菌株在pH 2.0 模拟胃液刺激下的存活率高于胡鹏钰等[39]分离得到的两株双歧杆菌在pH 2.5 模拟胃液刺激下的存活率（73%，75%），较强胃液耐受菌株在今后产品中的应用具有广阔前景。
表3 菌株在模拟胃液（pH 2.0）耐受情况（，n=3）
Table 3 Simulated gastric juice tolerance of srtains at pH 2.0（，n=3）
注：大写字母不同为同一菌株不同时间生长情况差异显著（P<0.05），小写字母不同为不同菌株同一时间以及3 h 存活率的差异显著（P<0.05）。
2.7 利用SC-GOS 的双歧杆菌胆盐耐受情况分析
潜在的益生菌要有较强的胆盐耐受能力，各试验菌株在0.2%猪胆盐处理30 min 时相较0 h的细菌数量减少情况如图6 所示。结果表明，在胆盐存在的条件下，所有菌株存活能力受到不同程度的影响，BP_Y43 的菌落数量减少5.5×108 CFU/mL，其余菌株菌落数量减少1.0×107 CFU/mL 左右（P<0.05）。这个结果表明除BP_Y43 外，其余试验菌株胆盐耐受性强（P<0.05）。黄巧芬[40]分离的长双歧杆菌NCU712 在0.3%猪胆盐刺激下，菌数减少了3.9×107 CFU/mL，可能是由于菌株不同和所用的胆盐不同，未来将进一步探讨0.3%胆盐下的耐受情况。
图6 胆盐耐受情况（，n=3）
Fig.6 Bile salt tolerance（，n=3）
2.8 利用SC-GOS 的双歧杆菌上清液抑菌能力评价
Delcaru 等[41]证实了双歧杆菌对大肠杆菌产生拮抗作用，目前已经提出了部分益生菌对致病菌产生拮抗作用的机制，如竞争排斥、宿主免疫调节等[42]。以无菌的MRSC 培养基作为对照，各试验菌株的上清液抑制EC_25922 能力见表4。结果表明，BI_15697 上清液没有抑菌效果；BP_Y43、BP_YA 抑菌效果较强，抑菌环直径分别为10.33 mm 和10.17 mm；BB_Y22、BL_S34、BL_H26 菌 株上清液抑菌能力强，抑菌环直径在11～12.5 mm 之间，而BI_M63、BI_Y46 以及BB_S7 上清液对大肠杆菌抑制作用更加明显，抑菌环直径可以达到12.5 mm 以上。
表4 菌株上清液对EC_25922 抑制作用（，n=3）
Table 4 Inhibitory effect of strain supernatant on EC_25922（，n=3）
注：牛津杯外径8 mm。-.没有抑菌作用；+.抑菌环直径8～9.5 mm；++.抑菌环直径9.5～11 mm；+++.抑菌环直径11～12.5 mm；++++.抑菌环直径>12.5 mm。
3 结论
从粪便样品中分离得到7 株高效利用SCGOS 的双歧杆菌，分别为两歧双歧杆菌BB_Y22和BB_S7、假小链双歧杆菌BP_Y43 和BP_YA、长双歧杆菌婴儿亚种BI_Y46 以及长双歧杆菌BL_S34、BL_H26。
观察形态并分析益生特性，发现BI_Y46 具有菌毛结构，蛋白含量较高，为（0.31±0.02）mg/mL，同时BI_Y46 上清液对EC_25922 的抑菌效果较强（P<0.05）；BB_Y22 的胞外多糖产量最高，为（0.49±0.04）mg/mL，菌体表面蛋白含量为（0.37±0.06）mg/mL，具有较强表面疏水性和自聚集能力，还具有较强的胃液耐受性（P<0.05）；BP_Y43 也同样具有较高胞外多糖产量和高菌体蛋白含量，表面疏水性与自聚集能力也较强，同时具有较强胆盐耐受能力，有利于其在肠道中的定殖（P<0.05）。
综上，本试验分离高效利用短链低聚半乳糖的双歧杆菌中，长双歧杆菌婴儿亚种BI_Y46、两歧双歧杆菌BB_Y22 以及假小链双歧杆菌BP_Y43 具有较好的益生潜力，为开发益生菌产品、婴儿配方乳粉提供一定的参考，也为后续研究提供菌株资源。
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