天然产物来源β-葡聚糖具有良好的生理活性，包括抗氧化、抗肿瘤、抗炎，调节血糖以及调节免疫等[1-3]。有文献报道，β-葡聚糖的活性与其结构有着紧密联系，如低分子量的β-葡聚糖具有良好的抗氧化和免疫活性[4-5]，高分子、高黏性β-葡聚糖在降胆固醇、血糖调节方面发挥重要作用[6-7]。通过一定手段降解β-葡聚糖或引入其它取代基团来改变其结构也会引起活性的改变[8-9]。科学认识β-葡聚糖结构特征，对于其生理活性研究与应用具有重要意义。
长裙竹荪是一种名贵的食用菌，多糖是其重要营养成分[10]。长裙竹荪含有丰富的水溶性β-1，3-葡聚糖[11]。也有文献报道长裙竹荪多糖中还含有甘露糖、半乳糖以及少量的鼠李糖和葡萄糖醛酸[12-13]。此外，有研究发现，长裙竹荪中葡萄糖的残基类型既有β 构型，也有α 构型[14]。这些研究结果的差异性，导致人们对长裙竹荪多糖的结构产生困扰。本文从长裙竹荪中提取β-葡聚糖，分析其化学组成、结构特征和溶液性质，以期为其活性研究，以及后续相关功能性食品的开发提供参考。
1 材料与方法
1.1 原料与试剂
长裙竹荪，贵州省赤水市。葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡聚糖标准品（Mw 2.0×106 u 和2.5×104 u）、碘甲烷，美国Merck（Sigma-Aldrich）公司；葡萄糖醛酸标准品、葡聚糖标准品 （Mw 7.0×104，6.0×104，5.0×104，4.0×104 u 和1.0×104 u）、考马斯亮蓝G-250、牛血清蛋白、没食子酸、耐高温α 淀粉酶、木瓜蛋白酶，上海阿拉丁试剂有限公司；木糖、甘露糖标准品，百灵威科技有限公司；葡聚糖标准品（Mw 5.0×105 u），北京欣经科生物技术有限公司；浓硫酸，国药集团化学试剂有限公司；乙醇、乙酸、磷酸、甲醇、二甲基亚砜等，均为国产分析纯试剂。
1.2 试验仪器与设备
Dionex ICS 5000 离子色谱仪、Nicolet 5700红外光谱仪、Varioskan Flash 多功能酶标仪，美国Thermo Scientific 公司；JSM-7610F 场发射扫描电镜带能谱仪，日本JEOL 公司；ARES-G2 流变仪，美国TA 公司；HPSEC-MALLS 色谱系统，美国WYATT 公司；E2695 液相系统，美国WATERS 公司；GC-MS7890/7000 QQQ，美国Agilent 科技有限公司；AL104 电子天平，上海梅特勒-托利多仪器公司；Rotavapor R-220 SE 旋转蒸发仪，瑞士Buchi 公司；Milli-Q 超纯水仪，美国Millipore 公司；12 L 立式冷冻干燥机，美国LABCONCO 公司。
1.3 长裙竹荪多糖的制备与纯化
1） 原料前处理 将长裙竹荪样品粉碎，以1∶8 的料液比于体积分数为75%乙醇中浸泡24 h，离心除去上清液，加入体积分数为75%乙醇再次浸泡24 h，收集沉淀，烘干，获得竹荪粉末。
2） 多糖制备 将上述乙醇浸泡后的长裙竹荪粉末，按照料液比1∶31 加入蒸馏水，75 ℃提取两次，每次3.5 h，离心（4 800 r/min，10 min），收集上清液，减压真空浓缩，再缓慢加入体积分数为95%乙醇至体系乙醇体积分数达80%，于4 ℃冰箱醇沉过夜。离心（4 800 r/min，5 min），沉淀加水复溶，旋蒸除去乙醇。采用Sevag 法脱蛋白3 次，离心（4 800 r/min，10 min），收集上清液。旋蒸浓缩除去残留的有机试剂，蒸馏水透析3 d（透析袋截留分子质量8 000～14 000 u），将透析液浓缩冻干，得到长裙竹荪多糖 （D.indusiata polysaccharide，DIP）。
3） 多糖纯化 配制质量浓度为1 mg/mL 的竹荪多糖溶液，加入体积分数为0.05%耐高温α-淀粉酶，然后，溶液在98 ℃下酶解30 min，冷却至室温后加入0.025%木瓜蛋白酶，于60 ℃酶解30 min。酶解结束后将溶液温度上升至100 ℃保持15 min 使酶失活。待溶液冷却，缓慢加入无水乙醇，不断搅拌至乙醇体积分数达20%，4.0 ℃静置12 h 过夜。离心（10 000 r/min，15 min）后沉淀加水复溶，旋蒸除乙醇，在4.0 ℃冰箱透析（透析袋截留分子质量8 000～14 000 u）2 d 后冻干。冻干后的多糖加水复溶（1.0 mg/mL），二次醇沉、透析、冻干后得到长裙竹荪纯化多糖 （D.indusiata purified polysaccharide，DIPP）。
1.4 化学组成测定
以葡萄糖为标准品，苯酚硫酸法测定中性糖含量[15]。以牛血清蛋白为标准品，考马斯亮蓝法测定蛋白质含量[16]。采用AOAC 法996.11，用Megazyme 淀粉总量检测试剂盒测定淀粉含量。
1.5 单糖组成测定
取5 mg 多糖样品于厚壁管，在冰浴条件下向其中加入0.5 mL 12 mol/L 浓硫酸搅拌5 min，继续加入2.5 mL 蒸馏水，在100 ℃下油浴2 h 后移入50 mL 容量瓶中蒸馏水定容，稀释5 倍后过0.22 μm 水系滤膜，使用Dionex ICS 5000 离子色谱仪检测其单糖组成[17]。
色谱条件：色谱柱：CarboPacTM PA20 分析柱 （3 mm×150 mm，Dionex，CA）、CarboPacTM PA20保护柱（3 mm×30 mm，Dionex，CA），柱温30.0 ℃。
1.6 傅里叶红外光谱测定
取多糖样品真空干燥，在干燥环境中与溴化钾粉末混合，研磨均匀，压片后采用傅里叶红外光谱仪在400～4 000 cm-1 范围扫描采集红外光谱信号。
1.7 高效尺寸排阻色谱串联多角度激光散射仪（HPSEC-MALLS）分析
多糖用流动相配成1.0 mg/mL 多糖溶液，过3遍0.22 μm 滤膜，得到待测样品，采用HPSECMALLS 分析。仪器色谱系统配有E2695 分离单元，MALLS 多检测器联用系统（美国Wyatt）配有十八角度激光光散射检测器 （LS）、黏度检测器（DP）和示差检测器（RI）。
色谱条件：色谱柱：OHpak SB-G 保护柱（50 mm × 6.0 mm I.D.，10 μm）、OHpak SB-806 HQ（300 mm×8.0 mm I.D.，13 μm）和OHpak SB-804 HQ （300 mm×8.0 mm I.D.，10 μm）（日本Shodex Denko 公司）。流动相：0.1 mol/L NaNO3 溶液（含0.035% proclin 300）
1.8 甲基化与GC-MS 测定
参考Wang 等[18]的甲基化方法，使用GC-MS 7890/7000 QQQ 检测。
选用SPTM-2330 ms 毛细管柱 （30 m×0.25 mm×0.2 μm，美国Merck Supelco）分析。其它条件：进样口温度250 ℃，不分流；升温程序：以2 ℃/min 速度，从160 ℃升至210 ℃，再5 ℃/min 升温至240 ℃，保持20 min；离子化模式：EI（70 kV）；MS 扫描范围：m/z 35～400。
1.9 扫描电镜测定
取多糖样品配成1 mg/mL 的多糖溶液，干燥后置铜台上喷金处理，使用JSM-6701F 冷场发射扫描电镜观察表面形貌特征。
1.10 流变性质测定
取多糖样品用蒸馏水溶解，配成质量分数分别为0.1%，0.5%，1.0%，1.5%和2.0%的多糖溶液，使用ARES-G2 流变仪测定表观黏度。在线性黏弹区内选取5%应变作为动态频率测量的应变值，在Oscillatory Frequency 模式下测定多糖溶液黏弹性。
1.11 数据分析
数据采用SPSS 软件进行t 检验，P＜0.05 为差异具有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 理化性质
从长裙竹荪中提取的水溶性粗多糖得率为5.6%，纯化后得到的组分得率较低，仅1.4%。纯化后，长裙竹荪多糖DIPP 的纯度（中性糖与单糖组成中Glc 的含量）得到很大提升，蛋白质和淀粉含量显著下降。DIP 中的主要组分为Glc，还含有少量的Gal、Man 和GlcA，纯化得到的DIPP 中仅检测到Glc，表明DIPP 是一种葡聚糖。长裙竹荪多糖的单糖组成以葡萄糖为主，通过酶解醇沉的方法可以得到一种纯度较高的非淀粉葡聚糖。
表1 DIP 和DIPP 得率和基本成分分析（n=3，
±s）
Table 1 Yield and chemical composition of DIP and DIPP（n=3，±s）
注：-：未检测到；A：得率（%）=多糖质量/干燥子实体质量×100；B：每个值为平均值±标准差，同一列不同小写字母间具有显著性差异（P＜0.05）。
?
2.2 红外光谱分析结果
图1是DIPP 的红外光谱图，位于3 394 cm-1和2 924 cm-1 附近的吸收峰分别是由O-H 的伸缩振动和C-H 的伸缩振动引起的[19-20]，这是多糖的特征吸收峰。1 633 cm-1 处为结合水引起的吸收峰[21]。1 430～1 200 cm-1 范围的吸收峰是由O-H 变角振动和C-O 的伸缩振动引起的。1 076 cm-1 处的吸收峰是吡喃环的伸缩振动引起的[22]，896 cm-1处的吸收峰表明DIPP 的糖苷键存在β 构型[23]。上述结果表明，DIPP 是具有β 构型的吡喃糖。
图1 DIPP 的红外光谱图
Fig.1 FT-IR spectrum of DIPP
2.3 HPSEC-MALLS 分析结果
HPSEC-MALLS 是一种简单、有效的分析分子量和链构象参数的技术[24]。图2表明DIPP 是单一组分多糖，表2中DIPP 的回收率为43.5%，这可能是因为DIPP 分子量大、黏度高，导致样品过滤时很多组分被截留。DIPP 的重均分子质量为2.8×106 u，分子质量分布较窄（Mw/Mn=1.5）。在水溶液中，DIPP 特性黏度为1 094.3 mL/g，比已报道的红托竹荪多糖特性黏度（[η]=1 350.0 mL/g）要小[18]，而高于棘托竹荪多糖（[η]=10.9 mL/g）[25]。综上可知，DIPP 是一种均一性良好的水溶性多糖，具有一定的黏性。
表2 DIPP 的溶液性质
Table 2 Solution property of DIPP
?
图2 DIPP 尺寸排阻色谱图
Fig.2 Size exclusion chromatogram of DIPP
2.4 甲基化分析结果
表3为DIPP 的甲基化分析结果，糖残基类型为T-Glcp（29.8%），1，3-Glcp（42.6%）和1，3，6-Glcp（27.8%）（对应比例约为2∶3∶2）。这一比例与香菇多糖的相近[26-27]，也与已有的竹荪β-葡聚糖的报道类似。在最早的关于竹荪葡聚糖的结构解析中得到的是具有（1→6）支链的（1→3）-β-D-葡聚糖，其糖残基Glcp-（1→、→3）-Glcp-（1→和→3，6）-Glcp-（1→的比值为1 ∶1.54 ∶0.99[28]。Wang等[29]也纯化得到此类型的竹荪β-葡聚糖。除β-葡聚糖外，Shi 等[25]还在棘托竹荪中得到以（1→6）为支链的α-（1→4）-葡聚糖。
表3 DIPP 糖苷键连接类型
Table 3 Linkage patterns analysis of DIPP
?糖苷键类型DIPP/%T-Glcp29.8 1，3-Glcp42.6 1，3，6-Glcp27.8
2.5 扫描电镜分析结果
图3是DIPP 的表面形貌。液氮急速冷冻使得DIPP 的多糖分子在溶液中的形态被固定，DIPP 呈丝状线性分布。
图3 DIPP 的扫描电镜图
Fig.3 SEM of DIPP
2.6 流变性质
图4显示不同浓度DIPP 表观黏度和成胶性能测试结果。DIPP 有剪切变稀的趋势，属于非牛顿流体。随着多糖浓度的增大，表观黏度也随之增强。与红托竹荪多糖相比[18]，在相同质量分数下（质量分数为0.5%），DIPP 表观黏度要更大，而对比具有相似结构的香菇多糖，其表观黏度接近一致[30]。DIPP 质量分数为0.1%时，表现出溶胶性质〔储能模量（G'）与损耗模量（G''）曲线有交叉〕，在更高浓度下，DIPP 的G' 值始终大于G''，表现出一定的成胶性能。
图4 浓度对DIPP 表观黏度（a）和凝胶特性（b）的影响
Fig.4 Effect of concentration on apparent viscosity （a） and gel properties （b） of DIPP
3 讨论与结论
从竹荪中提取纯化所得水溶性多糖DIPP 具有较高的分子质量，主要糖残基类型为T-Glap、1，3-Glcp 和1，3，6-Glcp，这与已报道的具有（1→6） 支链的 （1→3）-β-D-葡聚糖的糖残基类型一致。结合红外分析结果，确定DIPP 也是一种β-葡聚糖。HPSEC-MALLS 测定表明，DIPP 的特性黏度较高（[η]=1 094.3 mL/g）。在对DIPP 的流变性的测定时也发现其黏性较强，具有弱凝胶性质，这与其结构有关。有研究发现，燕麦β-葡聚糖分子质量的增大对应黏度也会增大[31]。随着β-葡聚糖分子质量的降低，其黏度也随之降低[32]，这表明在一定分子量范围，分子量与黏度呈正相关，凝胶强度与分子量的关系则相反，分子量越小，凝胶能力越强[33-34]。高分子量可能是导致DIPP 具有高黏性与弱凝胶性质的重要因素。此外，DIPP 的溶液性质也可能与其初级结构有关。1，3，6-Glcp 上存在支链位点，带有支链的多糖链在水中与羟基作用，形成分子间和分子内氢键，使其具备对应的溶液性质，其原理有待研究。
综上所述，DIPP 是一种β-葡聚糖，具有较高的黏度和一定的成胶性能。本研究结果为竹荪β-葡聚糖的功能活性提供了物质结构基础，也为竹荪多糖产品的开发和设计提供理论支持。
[1]BASHIR K M，CHOI J.Clinical and physiological perspectives of β-glucans：The past，present and future[J].International Journal of Molecular Sciences，2017，18（9）：1906.
[2]ZHU F M，DU B，XU B J.A critical review on production and industrial applications of beta-glucans[J].Food Hydrocolloids，2016，52：275-288.
[3]DU B，LIN C Y，BIAN Z X，et al.An insight into anti-inflammatory effects of fungal beta-glucans[J].Trends in Food Science & Technology，2015，41（1）：49-59.
[4]LEI N，WANG M，ZHANG L F，et al.Effects of low molecular weight yeast β-glucan on antioxidant and immunological activities in mice[J].International Journal of Molecular Sciences，2015，16 （9）：21575-21590.
[5]ISHIMOTO Y，ISHIBASHI K，YAMANAKA D，et al.Production of low-molecular weight soluble yeast β-glucan by an acid degradation method[J].International Journal of Biological Macromolecules，2018，107：2269-2278.
[6]DU B，MEENU M，LIU H Z，et al.A concise review on the molecular structure and function relationship of β -glucan [J].International Journal of Molecular Sciences，2019，20（16）：4032.
[7]WANG Y，HARDING S V，ECK P，et al.Highmolecular-weight β-glucan decreases serum cholesterol differentially based on the CYP7A1 rs3808607 polymorphism in mildly hypercholesterolemic adults[J].The Journal of Nutrition，2016，146（4）：720-727.
[8]QIN Y Y，XIE J，XUE B，et al.Effect of acid and oxidative degradation on the structural，rheological，and physiological properties of oat β-glucan[J].Food Hydrocolloids，2021，112（8）：106284.
[9]ZHANG Q Y，XIE J，XUE B，et al.Effect of sulfated modification on rheological and physiological properties of oat β-glucan oligosaccharides prepared by acid or oxidative degradation[J].Journal of Cereal Science，2021，99：103209.
[10]华洋林，高擎，唐健，等.不同产地竹荪营养成分的比较研究[J].食品工业科技，2011，32（10）：418-420.HUA Y L，GAO Q，TANG J，et al.Study on comparison of nutritional components in fruiting bodies of Dictyophora indusiata from different regions[J].Science & Technology of Food Industry，2011，32（10）：418-420.
[11]FU Y，LIN S，LU M，et al.Quantitative evaluation of ultrasound-assisted extraction of 1，3-β-glucans from Dictyophora indusiata using an improved fluorometric assay[J].Polymers，2019，11（5）：864.
[12]KANWAL S，JOSEPH T P，ALIYA S，et al.Attenuation of DSS induced colitis by Dictyophora indusiata polysaccharide （DIP） via modulation of gut microbiota and inflammatory related signaling pathways[J].Journal of Functional Foods，2020，64：103641.
[13]WU D T，ZHAO Y X，GUO H，et al.Physicochemical and biological properties of polysaccharides from Dictyophora indusiata prepared by different extraction techniques[J].Polymers，2021，14（13）：2357.
[14]吴定涛，巨瑶君，陆静峰，等.糖谱法比较不同产地竹荪多糖结构特征[J].食品科学，2014，35（13）：98-102.WU D T，JU Y J，LU J F，et al.Characterization and comparison of polysaccharides from Dictyophora indusiata using saccharide mapping[J].Food Science，2014，35（13）：98-102.
[15]DUBOIS M，GILLES K A，HAMILTON J K，et al.Colorimetric method for determination of sugars and related substances[J].Analytical Chemistry，1956，28（3）：350-356.
[16]BRADFORD M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein -dye binding [J].Analytical Biochemistry，1976，72（1/2）：248-254.
[17]WANG Y，ZHANG T，XIN Y，et al.Comprehensive evaluation of alkali -extracted polysaccharides from Agrocybe cylindracea：Comparison on structural characterization [J].Carbohydrate Polymers，2021，255：117502.
[18]WANG Y X，YIN J Y，HUANG X J，et al.Structural characteristics and rheological properties of high viscous glucan from fruit body of Dictyophora rubrovolvata[J].Food Hydrocolloids，2020，101：105514.
[19]CHEN J C，ZHANG X，HUO D，et al.Preliminary characterization，antioxidant and α-glucosidase inhibitory activities of polysaccharides from Mallotus furetianus[J].Carbohydrate Polymers，2019，215：307-315.
[20]SU Y，LI L.Structural characterization and antioxidant activity of polysaccharide from four auriculariales[J].Carbohydrate Polymers，2020，229：115407.
[21]DENG C，HU Z，FU H T，et al.Chemical analysis and antioxidant activity in vitro of a β-D-glucan isolated from Dictyophora indusiata[J].International Journal of Biological Macromolecules，2012，51（1/2）：70-75.
[22]XIAO H，CHEN C，LI C，et al.Physicochemical characterization，antioxidant and hypoglycemic activities of selenized polysaccharides from Sargassum pallidum[J].International Journal of Biological Macromolecules，2019，132：308-315.
[23]AHMAD A，ANJUM F M，ZAHOOR T，et al.Extraction and characterization of β-D-glucan from oat for industrial utilization[J].International Journal of Biological Macromolecules，2010，46（3）：304-309.
[24]HE P，HE L，ZHANG A，et al.Structure and chain conformation of a neutral polysaccharide from sclerotia of Polyporus umbellatus[J].Carbohydrate Polymers，2017，155：61-67.
[25]SHI X，LI O，YIN J，et al.Structure identification of α -glucans from Dictyophora echinovolvata by methylation and 1D/2D NMR spectroscopy[J].Food Chemistry，2019，271：338-344.
[26]SAITÔ H，OHKI T，TAKASUKA N，et al.A 13CN.M.R.-Spectral study of a gel-forming，branched（1→3）-β-D-glucan，（lentinan） from lentinus edodes，and its acid-degraded fractions.Structure，and dependence of conformation on the molecular weight[J].Carbohydrate Research，1977，58（2）：293-305.
[27]SAITÔ H，OHKI T，SASAKI T.A 13C-nuclear magnetic resonance study of polysaccharide gels.Molecular architecture in the gels consisting of fungal，branched （1→3）-β-D-glucans （lentinan and schizophyllan） as manifested by conformational changes induced by sodium hydroxide[J].Carbohydrate Research，1979，74（1）：227-240.
[28]HARA C，KIHO T，UKAI S.A branched （1→3）-β-D-glucan from a sodium carbonate extract of Dictyophora indusiata fisch[J].Carbohydrate Research，1983，117：201-213.
[29]WANG J T，XU X J，ZHENG H，et al.Structural characterization，chain conformation，and morphology of a β-（1→3）-D-glucan isolated from the fruiting body of Dictyophora indusiata[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2009，57（13）：5918-5924.
[30]XU X J，XU J，ZHANG Y Y，et al.Rheology of triple helical lentinan in solution：Steady shear viscosity and dynamic oscillatory behavior[J].Food Hydrocolloids，2008，22（5）：735-741.
[31]KIM H J，WHITE P J.Impact of the molecular weight，viscosity，and solubility of β-glucan on in vitro oat starch digestibility[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2013，61（13）：3270-3277.
[32]BYUN E，KIM J，SUNG N，et al.Effects of gamma irradiation on the physical and structural properties of β-glucan[J].Radiation Physics and Chemistry，2008，77（6）：781-786.
[33]LI W，CUI S W，KAKUDA Y.Extraction，fractionation，structural and physical characterization of wheat β-D-glucans[J].Carbohydrate Polymers，2006，63（3）：408-416.
[34]LI W，CUI S W，WANG Q，et al.Studies of aggregation behaviours of cereal β-glucans in dilute aqueous solutions by light scattering：Part I.Structure effects[J].Food Hydrocolloids，2011，25（2）：189-195.