桑葚自古以来就被认为是保健圣品，桑葚果酒酒精度一般只有5～14 度，酒精含量低于啤酒等酒类，含有丰富的花色苷等天然色素，属于富色食品，同时含有丰富的各种维生素和17 种必需氨基酸，比其它果酒更有效地调节脏腑代谢，舒缓情绪，增强人体免疫力，清除体内有害自由基，改善基础代谢等[1-3]。经微生物发酵制成的桑葚果酒，含有活性微生物代谢转化生成的多糖、蛋白肽、氨基酸、维生素等有益成分[4-7]。桑葚果酒的工业化生产开发具有重要的商业价值和前景。
现阶段，微生物群落动态变化规律一般通过Illumina MiSeq 高通量测序手段来监测[8-9]。该技术可以表征细菌群落分布、进化情况，预测菌落主导的功能活性与环境间的互作关系，显著拓展了复杂体系的动态发酵过程中微生物学的研究范畴[1-3]。例如，刘晓柱等[8]借助高通量测序技术对自然发酵的刺梨汁的细菌群落变化进行监测；谢丹等[9]基于同样的技术对发酵的刺梨果渣的细菌多样性进行分析；邸鹏月等[1]使用该分析技术对桑葚酵素的微生物组成及多样性进行测序，结果显示，在发酵前期，酵母是桑葚酵素中的优势菌，占比92.16%，细菌中乳杆菌属所占比例最大，趋势为先升高后降低，该研究揭示了自然发酵的桑葚酵素的动态微生物变化规律及其多样性机制，为实现人工可控的新型发酵模式下的桑葚酵素的开发提供重要的理论基础。同样地，利用宏基因组学研究自然发酵桑葚果酒的细菌多样性及变化规律，对于新型适宜发酵生产的野生菌株的开发具有重要的意义，可为实现高附加值工业化的桑葚果酒提供技术参考。本研究以发酵周期差异显著的2 个自然发酵的岭南桑葚果酒为样本，利用宏基因组学科学技术分析2 个样品中细菌多样性，筛选高效微生物菌剂，实现果酒发酵技术的革新，为提高桑葚果酒生产效率与质量安全水平提供科学依据[10-12]。
1 材料与方法
1.1 材料与设备
原料：桑葚果酒：购自岭南永和镇创鲜果桑采摘园。桑葚果和冰糖按质量比7∶3 不加水放入灭菌的发酵玻璃罐中，置于暗处，于当地自然环境中室温发酵6～18 个月制得。
试剂：试剂盒（型号D3142），广州美基生物科技有限公司；相关PCR 试剂，美国新英格兰生物实验室股份有限公司；无水乙醇，广州化学试剂厂；PCR 引物，广州基迪奥生物有限公司合成。
主要设备：4 ℃离心机 （型号Eppendorf 5427R），德国艾本德股份公司；超纯水仪器（型号明澈TM-D），瑞菲乐生物科技有限公司，-80 ℃冰箱（型号DWHL528S），中科美菱；涡旋振荡器（型号米欧mix-28+），广州围古润仪器有限公司。
1.2 方法
1.2.1 桑葚果酒样品采集及分组 采用无菌洁具，在6 个独立发酵的玻璃罐体中采集各40 mL酒样，置无菌离心管中。新酒（STF）和陈酒（LTF）各3 个平行样。自然发酵6 个月的新酒分别标记为STF-1、STF-2、STF-3，自然发酵18 个月的陈酒分别标记为LTF-1、LTF-2、LTF-3。
1.2.2 桑葚果酒细菌DNA 的提取 按照试剂盒操作指南操作，所用试剂盒为中国Magen 的HiPure 土壤DNA 提取试剂盒。
1.2.3 PCR 扩增 选定V3～V4 作为16S rRNA基因的目标区域进行引物设计，上游引物为341F：CCTACGGGNGGCWGCAG；下游引物为806R：GGACTACHVGGGTATCTAATPCR。扩增条件：95℃5 min，然后，95 ℃1 min，60 ℃1 min，72 ℃持续1 min 的30 个循环，末段72 ℃保温7min。PCR反应一式3 份。扩增体系：50μL 混合物，包含10 μL 5×Q5 R反应缓冲液，10 μL 5×Q5 R 高GC 含量增强剂，1.5 μL 2.5 mmol/L dNTPs，1.5 μL 10 μmol/L 上、下游引物，0.2 μL Q5R高保真DNA 聚合酶，50 ng 模板DNA。
1.2.4 Illumina 测序 PCR 产物上样于2%琼脂糖凝胶块样品孔中进行电泳，切胶收集并回收纯化扩增样品。按照Axygen Biosciences DNA 提取试剂盒说明书对扩增样品进行纯化，样品DNA 浓度通过ABI StepOnePlus 实时荧光定量PCR 系统测定。按照Illumina 平台的标准程序，对纯化后的扩增子进行PE250 双端测序，由广州基迪奥生物科技有限公司完成相应的建库和Miseq 测序[1-3]。
1.2.5 生物信息分析 Miseq 测序数据下机后，选择Usearch 方法，测序数据的样本为6 个月自然发酵时长的样本（STF）和18 个月的样本（LTF），共2 组，每组3 个平行重复。由广州基迪奥生物有限公司使用Omicsmart 动态实时交互在线数据分析平台及FASTP （版本0.18.0） Krona（版本2.6）等专业分析软件对数据质控处理，并聚类、去嵌合体，获得操作分类单元（OTU）代表序列和丰度信息。基于OTU 序列进行物种注释，各层级的物种丰度信息基于OTU 丰度信息统计获得，进一步分析获得物种组成、指示物种、α 多样性、β 多样性、功能预测、环境因子关联等生物信息。
2 结果与分析
2.1 凝胶电泳鉴定结果
由图1所示桑葚果酒样品细菌16S rDNA PCR 扩增产物凝胶电泳结果可知，LTF 和STF 共6 个桑葚果酒样本的PCR 产物条带显示较好的特异性和亮度，符合测序要求。
图1 桑葚自然发酵液样品细菌16S rDNA 扩增产物凝胶电泳图
Fig.1 Gel electrophoresis of 16S rDNA amplification product of nature fermentation liquid samples of mulberry
注：M.100 bp Marker，上样量5 μL；1～3.分别为发酵18 个月（LTF）3 个平行样本；4～6.分别为发酵6 个月 （STF）3 个平行样本；CK.以水为模板作为负对照，上样量均为2 μL。
2.2 测序样本数据分析
分析自然发酵不同周期的桑葚果酒2 组样本的测序数据，读数共789 014 条，经过滤、去噪、去嵌合体系列质量控制，得到有效序列共760 581条，对应序列的有效率均在96%以上，序列长度大部分分布在204～474 bp，序列的平均碱基长度约461 bp，细菌的OTUs 平均数目为767 个 （见表1）。
表1 桑葚自然发酵液样品测序样本读数结果
Table 1 Results of sequencing sample reads of nature fermentation liquid samples of mulberry
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2.3 物种注释
在2.2 节获取的OTU 丰度信息基础上，通过基迪奥生物公司专业软件系统统计样品7 个分类水平序列数目占比，所述7 个分类水平为域、门、纲、目、科、属、种，用于评估样本物种注释的分辨率。相应的OTU 注释结果见图2。其属水平分布情况及相对丰度分别见图3的Venn 图和图4。
由图2可知，属水平上的序列数占比在60%以上，在各分类水平中显示出最高分辨率。
图2 桑葚自然发酵液样品序列注释程度
Fig.2 Sequence annotation degree of nature fermentation liquid samples of mulberry
由图3a 可知，门水平上，在自然发酵桑葚果酒中检测到变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、蓝细菌门（Cyanobacteria）、放线菌门（Actinobacteria、Epsilonbacteraeota、酸杆菌门（Acidobacteria）、浮霉菌门 （Planctomycetes）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）和绿弯菌门（Chloroflexi）10 个菌门的细菌类，其中变形菌门为优势细菌门，新酒和陈酒中的平均占比分别为54.74%和47.97%。显著性分析显示差异较显著的是厚壁菌门，在新酒中检测到的厚壁菌门菌群占比为9.26%，而在长时发酵的陈酒样品中厚壁菌门达到16.09%的占比，提示其在桑葚自然发酵6～18 个月的过程中发挥作用。
由图3（b）可知，纲水平上，在自然发酵桑葚果酒中检测到优势细菌纲为γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）、α-变形杆菌纲（Alphaproteobacteria）和拟杆菌纲（Bacteroidia），新酒平均占比分别为28.24%，18.78%和17.59%，陈酒平均占比分别为29.98%，24.50%和25.18%。显著性分析显示差异较显著的是氧化光合细菌纲（Oxyphotobacteria）、杆菌纲 （Bacilli） 和梭状芽孢杆菌纲（Clostridia），在新酒检测到的氧化光合细菌纲、杆菌纲和梭状芽孢杆菌纲菌群占比分别为6.21%，6.81%和2.29%，而在长时发酵的陈酒样品中的比例分别达到10.66%，9.60%和6.47%，提示其在桑葚自然发酵6～18 个月的过程中发挥作用。
由图3c 可知，在目水平上，自然发酵桑葚果酒中检测到优势细菌目为伯克氏菌目（Betaproteobacteriales）、噬纤维菌目（Chitinophagales）和拉恩氏菌目 （Reyranellales），新酒平均占比分别为28.13%，23.04%和14.83%，陈酒平均占比分别为18.12%，12.73%和8.75%。在新酒中未检出纤毛虫菌目（Fimbriimonadales）、亚群_2（Subgroup_2）、亚群_7（Subgroup_7）、S085、长微生物菌目（Longimicrobiales）、软骨杆菌目（Chthoniobacterales）和海洋异养古菌类群II（Marine_Group_II）菌目，而在长时发酵的陈酒样品中检出占比为0.04%～0.09%，提示其在桑葚自然发酵6～18 个月的过程中发挥作用。
图3 桑葚自然发酵液样品各分类水平上的细菌菌群相对丰度及门纲属水平上的差异性热图分析
Fig.3 Relative abundance of bacteria community of nature fermentation liquid samples of Mulberry at each level and analysis of the difference by heat map at the phylum and class level
由图3d 可知，科水平上，在自然发酵桑葚果酒中检测到优势细菌科为伯克氏菌科（Burkholderiaceae）、噬纤维菌科（Chitinophagaceae）和拉恩氏菌科（Reyranellaceae），新酒平均占比分别为27.53%，23.04%和14.83%，陈酒平均占比分别为18.05%，12.72%和8.75%。在新酒中未检出气球菌科 （Aerococcaceae）、疣微菌科（Verrucomicrobiaceae）、消化链球菌科（Peptococcaceae）、Longimicrobiaceae、噬纤维菌科、CPla-3_termite_group、67-14 和mle1-27，而其在长时发酵的陈酒样品中检出占比为0.04%～0.06%，提示其在桑葚自然发酵6～18 个月的过程中发挥作用。
由图3e 和3f 可知，属水平上，在自然发酵桑葚果酒中检测到优势细菌属为分枝杆菌属（Sediminibacterium）、雷拉内拉菌属（Reyranella）、弯曲菌属（Curvibacter）和链球菌属（Streptococcus），新酒平均占比分别为22.99%，14.83%，10.46%和5.83%，陈酒平均占比分别为12.52%，8.75%，6.11%和7.62%。在新酒中未检出奈瑟氏球菌属（Niastella）、肠杆菌属（Endobacter）、气球菌属（Aerococcus）、Ohtaekwangia、罗氏菌属（Roseimicrobium）、Segetibacter、Candidatus_Udaeobacter、交替红色杆菌属 （Altererythrobacter） 和肠共生杆菌属（Commensalibacter），而其在长时发酵的陈酒样品中检出占比为0.04%～0.07%，提示其在桑葚自然发酵6～18 个月的过程中发挥作用。随着桑葚的深度发酵，分枝杆菌属、雷拉内拉菌属、慢生根瘤菌属（Curvibacter bradyrhizobium）、罗尔斯通氏菌属（Ralstonia）、Mycobacterium 含量逐渐降低；而链球菌属、不动杆菌属（Acinetobacter）、拟杆菌属（Bacteroides）、Massilia、链霉菌属（Streptomyces）、Macellibacteroides、芽孢杆菌属（Bacillus）、Novosphingobium、醋杆菌属（Acetobacter）和Dysgonomonas细菌在发酵过程中含量不断增加，表明随着桑葚自然发酵的进行，参与糖代谢相关菌群量逐渐降低，而逐渐增加可能是参与酒精、乳酸及醋酸发酵相关的菌群。
由图4可知，STF 特有属35 种，样品LTF 特有属42 种，2 组样本共有属105 种，提示6～18 个月的发酵，有利于样本微生物的多样性。
图4 桑葚自然发酵液的细菌属水平分布韦恩图
Fig.4 Venn diagram of bacteria community distribution at the genus level of nature fermentation liquid samples of mulberry
2.4 Alpha 多样性分析
测序数据量能否充分反映样品中的物种多样性，需要借助稀释曲线来分析，由图5a 桑葚自然发酵液样品的稀释曲线可知，桑葚自然发酵液2 组样品细菌OTU 图表现出较好的平缓性，绝大部分的样本细菌菌群信息被呈现出来。样本物种丰富度也可以由稀释曲线间接反映。2 组样品中，LTF 细菌丰富度程度大于STF。
图5 桑葚自然发酵液样品α-多样性分析
Fig.5 Diversity analysis of nature fermentation liquid samples of mulberry
样本物种多样性的综合评价通常使用Shannon 指数，物种多样性越高，对应的数值越大，反之，多样性越低，数值越小。表2中，LTF 和STF的测序深度覆盖率达到0.998。LTF 的Shannon 指数高于STF，OTU 数也高于STF 组，说明物种多样性较为丰富的组别是LTF 组。
Ace 指数和Chao1 指数也可用来衡量样本中物种的种类。样本中物种种类越多，对应的Ace 指数和Chao1 指数越大。表2中样本LTF 的Ace 指数和Chao1 指数均高于STF。图5b 的Chao1 指数的welch's t 检验图显示其指数具有显著性差异（P＜0.05），反映LTF 的样本种类显著多于STF。
表2 桑葚自然发酵液样品Alpha 多样性指数
Table 2 Alpha diversity indexes of nature fermentation liquid samples of mulberry
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2.5 样本比较分析
LEfSe 法是适合菌群丰度差异检验的常见分析方法，是非参数检验和LDA（线性判别分析）的结合。由图6a、6b 可知，在桑葚自然发酵的样品LTF 中，菌群总体丰度较高，且Candidatus_protochlamydia、气球菌属、肠杆菌属、Gaiella、短芽孢杆菌属（Brevibacillus）、RB41、气微菌属（Aeromicrobium）、交替单胞菌属、假诺卡氏菌属（Pseudonocardia）、噬糖厌氧产氢杆菌属（Hydrogenoanaerobacterium）、Candidatus_riegeria、金黄杆菌属（Chryseobacterium）、醋杆菌属、假单胞菌属（Pseudomonas）、芽孢杆菌属、Macellibacteroides、寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）、柠檬酸杆菌属（Citrobacter）、不动杆菌属等菌属在样品LTF 中分布较为特异性，且不动杆菌属菌群丰度较高；在STF 中，Candidatus_ovatusbacter、普雷沃氏菌属（Prevotella）、污泥单胞菌（Pelomonas）、奈瑟氏球菌属、罗尔斯通氏菌属、分枝杆菌属分布较为特异性，且分枝杆菌属菌群丰度较高。
图6 桑葚自然发酵液样品细菌菌群属水平上的LEfSe 法线性判别分析
Fig.6 Linear discriminant analysis in genus level of bacteria community of nature fermentation liquid samples of mulberry by LEfSe method
STF 和LTF 的组内及组间从域水平到属水平的序列间的进化距离及物种丰富差异度如图6c所示。LTF 组的b 酸杆菌纲（Acidobacteriia）的a 酸杆菌目（acidobacteriales）和STF 组的e9 柔膜菌纲（Mollicutes）的e8 柔膜菌纲_RF39 菌目之间的距离最远，亲缘关系最薄弱。
2.6 功能潜能预测分析
使用BugBase 软件预测样本菌落的表型功能如图7a 所示。LTF 样本菌群中含有更多的厌氧菌及革兰氏阳性菌的典型基因序列信息，且显著性分析表明，STF 中包含的移动元素显著高于LTF样本，提示超长时间的桑葚酒发酵更倾向于厌氧发酵，STF 倾向于兼性厌氧模式，含有更多的可移动的菌落。
借助KEGG 功能注释数据库，使用PICRUSt2软件预测桑葚自然发酵过程中各菌群的功能特性，结果见图7b 和图8。LTF 样本菌群中与代谢相关的铁载体群非核糖体肽的生物合成（Biosynthesis siderophore group nonribosomal peptides）与人类疾病（Human Diseases）相关的细菌入侵上皮细胞（Bacterial invasion of epithelial cells）过程显著高于STF 组（P＜0.05）；而STF 样本中氨基酸代谢、碳水化合物代谢、辅因子和维生素的代谢、异生物质的生物降解和代谢、萜类化合物和聚酮化合物的代谢、其它氨基酸的代谢、脂质代谢、能量代谢、复制和修复、折叠、分类和降解等过程高于LTF 样本，而免疫疾病、心血管疾病、发育、信号分子及相互作用则低于LTF 样本，提示STF 和LTF 样本含有多肽、多糖等丰富的菌群次生代谢产物对人体有一定的保健功能，而太长时间发酵的LTF 样本可能受到外界环境的污染或其它影响，同时样本菌群中也可能出现引起免疫疾病和心血管疾病相关的致病菌，有一定的食用安全风险。
图7 桑葚自然发酵液样品细菌菌群功能特性分析
Fig.7 Analysis of the bacteria functional characteristics of nature fermentation liquid samples of mulberry
图8 桑葚自然发酵液样品细菌菌群第3 水平功能特性预测分析
Fig.8 Prediction and analysis of functional characteristics of nature fermentation liquid samples of mulberry in the third level
2.7 环境因子关联分析
基于距离矩阵的Mantel test 检验酒精度（adc）、酸度（aci）、pH、5%样本的DPPH 清除活性（dpph1）、1.33%样本的DPPH 清除活性（dpph2）、多糖含量（polysaccharide）这6 个环境因子与LTF和STF 整个微生物群落的相关性。Mantel test 的相关性越大，P 值越小，说明环境因子对微生物群落的影响越大。图9结果显示所有环境因子与芽单胞菌门水平显著性相关（P＜0.01），多糖含量与装甲菌门（Armatimonadetes）水平显著性相关（P＜0.05）；多糖含量对菌门的影响程度较高，达15.23%，其它环境因子影响较低，均为4.61%。CCA 分析结果显示：多糖含量指示箭头与坐标轴的夹角较酒精度的小，箭头长度较短，STF 样本点距离多糖含量箭头较近，LTF 样本点距离adc 箭头较近，所处象限提示多糖含量对菌门水平呈正相关作用，adc 对菌门水平呈负相关作用。箭头长度提示其对样本菌落分布影响比adc 小，箭头夹角提示其与菌门的相关性比adc 大，样本点与箭头之间的距离提示adc 对LTF 样本影响较大，多糖含量对STF 样本影响较大。
图9 桑葚自然发酵液样品细菌菌群门水平与环境因子的关联分析
Fig.9 Correlation analysis of bacterial flora by phylum level and environmental factors in mulberry natural fermentation broth samples
注：adc、aci、pH、dpph1、dpph2、polysaccharide 分别为酒精度、酸度、样本氢离子浓度指数、5%样本的DPPH 清除活性、1.33%样本的DPPH 清除活性、多糖含量。
3 结论
采用高通量测序方法解析2 个自然发酵周期的岭南桑葚果酒的细菌多样性，结果表明，6 个月短时自然发酵的新酒，继续发酵为陈酒（18 个月）的过程中，细菌的多样性和丰富度程度增加，厌氧菌和革兰氏阳性菌不断增加。新酒中的拟杆菌门分枝杆菌属显著减少（P＜0.05），变形菌门不动杆菌属显著增加（P＜0.05）。本研究掌握了新酒发酵为陈酒的过程中细菌多样性及其菌群结构的变化，为桑葚果酒样本真菌多样性分析、优质菌种资源选育及桑葚果酒工业化生产奠定了基础。
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