葡聚糖酶是一类重要的水解酶，能降解谷物细胞壁等结构中葡聚糖的β-葡萄糖苷键，在食品、酿造、饲料等行业具有广泛应用，可以制备功能性低聚糖，提高啤酒酿造的过滤效率，改善动物对谷物营养的吸收率等[1-3]。在动物、植物和微生物中都有葡聚糖酶，其中微生物是葡聚糖酶的主要生产者[4]。产葡聚糖酶的菌株种类丰富，包括细菌、霉菌、放线菌和酵母[5-8]。筛选新颖微生物菌株是获取具有新颖酶学特性葡聚糖酶资源的重要途径。
我国白酒酿造环境是一个富含细菌、霉菌、放线菌和酵母的特殊自然态生境，其以富含丰富微生物的酒曲为专用糖化发酵剂，以高粱等谷物为原料，采用开放式的固态发酵酿制而成，在这一酿造过程中，形成了稳定且极具特色的菌系和酶系[9-10]。白酒酿造的原料高粱、小麦、大麦等谷物的细胞壁中含有丰富的葡聚糖，因此，白酒酿造环境中不乏有降解葡聚糖的菌株，是筛选获得新颖葡聚糖酶的优良生境[11]。另外，探究白酒酿造环境中高产葡聚糖酶的优良菌株，通过对其适当强化来改善高粱等原料细胞壁的降解速率，从而实现原料中淀粉快速、充分地释放，提高原料的利用率，增加出酒率[9，12]。然而，有关白酒酿造环境微生物产葡聚糖酶的相关研究较少，有待进一步挖掘[9，11，13]。
前期，本研究团队从白酒酿造环境中获得1株新颖细菌，经鉴定为吡咯伯克霍尔德氏菌（Burkholderia pyrrocinia），通过基因组分析发现该菌株含有1 个第8 家族葡聚糖酶，以麦麸为碳源，对其产葡聚糖酶进行初步发酵分析，结果发现该菌所产葡聚糖酶活力达到674 U/mL，并实现了该酶的克隆和表达，是该菌产葡聚糖酶的首次报道[12]。基于此，本文将对该菌产葡聚糖酶条件进行系统优化，为其产葡聚糖酶及在白酒中更好的应用提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 菌株与试剂
吡咯伯克霍尔德氏菌B1213 为北京工商大学食品与健康学院食品微生物及酶技术研究团队自白酒酿造环境中筛选，并保存。
大麦葡聚糖和葡萄糖标品，美国Sigma 公司；其它试剂如未做特殊说明，均为国产生物或分析纯试剂；麦麸、玉米芯、甘蔗渣、酒糟、稻壳、大麦粉、玉米秸秆、咖啡渣、荞麦粉和棉花籽（均已粉碎至20～40 目），河南新乡地区。
1.2 培养基
Luria-Bertani（LB）培养基：胰蛋白胨10 g/L，氯化钠10 g/L，酵母浸粉5 g/L，自然pH 值，115 ℃条件下灭菌20 min。
初始发酵培养基：大麦粉40 g/L，硫酸铵1.3 g/L，磷酸二氢钾0.37 g/L，七水硫酸镁0.25 g/L，二水氯化钙0.07 g/L，氯化铁0.02 g/L，酵母浸粉1.0 g/L，初始pH 值为6.0，分装于250 mL 三角瓶中（每瓶30 mL），121 ℃灭菌15 min。
1.3 仪器和设备
YQX-SG46-280S 高压蒸汽灭菌器，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；BCN-1360 型生物洁净工作台，北京东联哈尔仪器公司；电子天平、pH计，赛多利斯科学仪器有限公司；HZQ-F160 全温振荡培养箱，太仓实验设备厂；DK-98-II A 电热恒温水浴锅，天津市泰斯特仪器有限公司；TU-19紫外-可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；Microfuge 2R 离心机，北京田林恒泰科技有限公司。
1.4 试验方法
1.4.1 吡咯伯克霍尔德氏菌B1213 产葡聚糖酶条件优化
1.4.1.1 单因素实验 将吡咯伯克霍尔德氏菌B1213 接种于LB 液体培养基中，30 ℃，120 r/min活化培养2 次，在600 nm 波长下测得浊度为1.1时，按照0.5%（V/V）接种量接种于初始发酵培养基中，30 ℃，120 r/min 培养96 h，发酵结束后于4℃，10 000 r/min 离心10 min，收集上清液，测定其葡聚糖酶活力。采用单因素考察碳源种类、碳源粒度、碳源质量浓度、氮源种类、氮源质量浓度、初始pH、接种量、装液量、转速、温度、表面活性剂种类及质量浓度和时间等因素对吡咯伯克霍尔德氏菌B1213 产葡聚糖酶的影响，具体因素与水平见表1。每组试验做3 个平行。
表1 单因素及其试验水平
Table 1 Factors and levels of single factor design
1.4.1.2 PB 试验 结合单因素试验结果，本试验选用N=15 的PB 设计对8 个因素进行考察，每个因素取+1 和-1 两个水平，响应值为葡聚糖酶活力（U/mL），试验设计的因素及其水平如表2 所示。
表2 PB 试验设计的因素水平
Table 2 Factors and levels of the variables in PB design for glucanase activity
1.4.1.3 最陡爬坡试验 根据单因素实验及PB试验结果，选取对葡聚糖酶活力有显著影响的因素进行最陡爬坡试验，因素的步移方向和步长依据PB 试验获得的回归模型和试验经验进行设定，共设置6 个梯度，每个梯度3 个平行（表3）。
表3 最陡爬坡试验设计及结果
Table 3 Experimental designs and the results of steepest ascent for glucanase activity
1.4.1.4 响应面试验 根据PB 和最陡爬坡试验结果，确定时间（h）、接种量（%，V/V）和初始pH 值3 个因素进行响应面试验，中心点为最陡爬坡试验中葡聚糖酶活力最高组（第2 组）对应因素及其水平。响应面试验采用软件Design-Expert 11 设计的Box-Behnken 进行（如表4）。
表4 Box-Behnken 试验因素及编码水平
Table 4 Factors and levels for the Box-Behnken design
1.4.2 葡聚糖酶活力及生物量测定 葡聚糖酶活力采用3，5-二硝基水杨酸（DNS）方法进行测定[12]，具体如下：摇瓶发酵液离心后（4 ℃，10 000 r/min，10 min），用pH 6.0 的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液（50 mmol/L）适当稀释后，将25 μL 稀释后的酶液与225 μL 1%的大麦葡聚糖溶液混合，于45 ℃反应10 min，然后加入250 μL DNS 终止反应，沸水浴中15 min，再加入250 μL 40%的酒石酸钾钠溶液，冷却后于540 nm 波长处测定吸光度值，以葡萄糖标准溶液绘制的标准曲线计算葡聚糖酶活力。
葡聚糖酶活力单位定义为：在上述反应条件下，每min 生产1 μmol 葡萄糖所需要的酶量为一个酶活单位（U/mL）。
生物量采用分光光度计于600 nm 波长处测定吸光度值（OD600nm 值）。
1.4.3 数据分析 采用SPSS 24.0 对试验数据进行差异显著性检验分析；利用Excel 2019 和Design-Expert 11 绘图软件绘制图表。
2 结果与分析
2.1 单因素实验结果
2.1.1 碳源种类对B1213 产葡聚糖酶的影响 葡聚糖酶是一种诱导酶，不同的碳源因所含有的组成成分、结构不同，而具有不同的诱导效果[14]。本研究选用了麦麸、稻壳、荞麦粉等10 种富含纤维素等成分的天然有机物，分别作为单一碳源进行诱导B1213 产葡聚糖酶，如图1 所示。可见，麦麸是B1213 高产葡聚糖酶最佳碳源，产量达到624 U/mL。这可能是由于麦麸中不仅含有丰富的纤维素成分，诱导其高产葡聚糖酶，而且，还含有一定量的淀粉和蛋白质，为菌株B1213 的生长和繁殖提供了必要的生长物质，促进菌体产酶。合适的碳源种类有利于诱导产生葡聚糖酶，而不同的菌株其所产葡聚糖酶最佳的碳源种类可能有所不同，如枯草芽孢杆菌ZJF-1A5 产葡聚糖酶的最佳碳源与本研究一致，为麦麸，黑曲霉突变株An08-752 产葡聚糖酶最佳碳源种类为麦麸或大麦粉，而泡盛曲霉CAU33 则以玉米芯作为碳源时葡聚糖酶活力最高[15-17]。这一现象与碳源原料之间的差异以及菌株本身生理特性有关，如菌株所产生的酶系不同，利用相同碳源的能力则存在差异，从而引起所产葡聚糖酶活力不同，即其所产酶的最佳碳源不尽相同。基于不同碳源种类对菌株B1213所产葡聚糖酶活力影响的结果，本研究选择麦麸作为后续优化其发酵产葡聚糖酶的碳源。
图1 不同碳源种类对菌株B1213 产葡聚糖酶的影响
Fig.1 Effect of different carbon sources on the glucanase production by B.pyrrocinia B1213
注：相同的字母表示采用Tukey test 检验时，组间没有显著差异（P>0.05），下同。
2.1.2 麦麸粒度对B1213 产葡聚糖酶的影响 碳源粒度会影响微生物对碳源的附着、营养物质的利用率及发酵过程中的溶氧水平和剪切力大小，从而对微生物生长代谢产生一定的影响。由图2可见，随着麦麸粒度的减小，菌株B1213 所产葡聚糖酶活力先增加后降低，在粒度为40～60 目时，酶活力最高，达到687 U/mL，为此，后续发酵选择40～60 目的麦麸。麦麸粒度过大时，虽有利于细菌吸附，但两者接触的比表面积小，不利于营养物质的吸收利用，且溶氧量较低，剪切力相对较大，因此，不利于菌株B1213 产葡聚糖酶；而粒度过小，细菌与麦麸接触的比表面积增大，剪切力降低，不利于细菌吸附，且溶氧量也较低，同样会降低其对麦麸中营养物质的吸收利用，影响其生长和产酶。一般而言，微生物发酵适合的碳源目数在20～80目，且细菌发酵产酶的碳源粒度略小于酶解，这主要是由于细菌细胞较小，较小粒度的碳源有利于细菌细胞对营养物质的吸收利用[18-20]。
图2 不同麦麸目数对菌株B1213 产葡聚糖酶的影响
Fig.2 Effect of particle size of wheat bran on the glucanase production by B.pyrrocinia B1213
2.1.3 麦麸质量浓度对B1213 产葡聚糖酶的影响确定麦麸为最适碳源后，进一步考察麦麸质量浓度对菌株B1213 产葡聚糖酶的影响。结果表明（图3），麦麸质量浓度对产酶影响显著，随着质量浓度的增加，葡聚糖酶活力呈现先升高后略有降低的趋势，在麦麸质量浓度为50 g/L 时，菌株B1213 所产葡聚糖酶活力最高，为727 U/mL。较低麦麸质量浓度，碳源不足，对微生物的生长和产酶有影响，而较高麦麸质量浓度，则会引起发酵培养基粘稠而影响到溶氧量，从而对菌株产酶产生一定抑制作用。一般而言，采用农业废弃物作为碳源发酵产酶时，农业废弃物的质量浓度范围在40～70 g/L 之间，此范围质量浓度的碳源不仅可以保证充足的能源需求和诱导产酶，而且具有较好的分散性，保障发酵所需溶氧量。如，泡盛曲霉CAU33 发酵产葡聚糖酶最适玉米芯质量浓度为55 g/L，黑曲霉AN-13 产木聚糖酶最佳麦麸质量浓度为54.2 g/L[16，21]。
图3 麦麸质量浓度对菌株B1213 产葡聚糖酶的影响
Fig.3 Effect of wheat bran mass concentration on the glucanase production by B.pyrrocinia B1213
2.1.4 氮源种类对B1213 产葡聚糖酶的影响 氮源是微生物生长所需的重要营养物质，也是合成相应酶制剂的重要前体来源，对酶的合成影响很大[22]。不同氮源种类所含蛋白质结构、氨基酸组成或有效氮的存在形式不同，从而影响微生物对其利用情况，影响其生长和代谢及诱导产酶水平。通过试验发现（图4），细菌B1213 可以较好的利用有机氮源或无机氮源合成葡聚糖酶，并且，在有效氮质量浓度一致时（0.366 g/L），以有机氮源所产葡聚糖酶活力优于无机氮源，这与大多数研究结果类似[16，22]。然而，也存在少量菌株以无机氮源所产酶活力优于有机氮源[4]，这可能是由于不同种类微生物在利用氮源的效率方面存在一定差异。针对细菌B1213 而言，以酵母浸粉、牛肉蛋白胨和胰蛋白胨分别作为单一氮源时，所产葡聚糖酶活力较高，尤其是酵母浸粉，这是因为这些氮源中不仅含有对应浓度的蛋白质，还含有其它生长因子，对细菌生长、繁殖和产酶具有一定促进作用。
图4 氮源种类对细菌B1213 产葡聚糖酶的影响
Fig.4 Effect of different nitrogen sources on the glucanase production by B.pyrrocinia B1213
图5 酵母浸粉质量浓度对细菌B1213 产葡聚糖酶的影响
Fig.5 Effect of yeast extract mass concentration on the glucanase production by B.pyrrocinia B1213
2.1.5 酵母浸粉质量浓度对B1213 产葡聚糖酶的影响 适量的氮源浓度有利于微生物产酶，浓度偏低则会影响到微生物的生长和新陈代谢，从而不利于微生物产酶，而浓度过高则因微生物快速生长和繁殖而消耗大量的其它营养物质，造成产酶阶段的营养失衡以及产生较多蛋白酶，也会对微生物产酶造成不利影响。结果表明，随着酵母浸粉质量浓度的提高，细菌B1213 合成葡聚糖酶活力不断增加，当质量浓度超过8 g/L 时，葡聚糖酶活力变化不明显，相比其它研究报道氮源浓度偏低，这可能是由于不同微生物对氮源的需求量不同，另外，本研究采用的碳源为麦麸，其含有一定量的氮源，这也是该菌株合成葡聚糖酶时所需氮源质量浓度偏低的原因之一[4，16]。
2.1.6 pH 值对B1213 产葡聚糖酶的影响 pH 值是调控微生物生长代谢重要的参数之一，其通过影响微生物细胞结构，尤其是细胞膜的通透性，微生物合成酶种类和组成以及营养物质的状态影响微生物代谢活动[4]。由图6 可知，随着初始pH 值的增加，B1213 所产葡聚糖酶不断增加，当pH 值为5.0～9.0 时，酶活力较高，继续增加初始pH 值，酶活力有所降低，这与pH 值对该菌生长的影响结果一致。
图6 初始pH 值对细菌B1213 产葡聚糖酶的影响
Fig.6 Effect of initial pH value on the glucanase production by B.pyrrocinia B1213
2.1.7 接种量对B1213 产葡聚糖酶的影响 接种量影响微生物的生长周期，是发酵产酶的关键因素之一。由图7 所示，不同接种量对细菌B1213 产葡聚糖酶具有一定影响，随着接种量的增加，其所产葡聚糖酶活力呈现下降趋势。当接种量为0.2%～0.5%时，酶活力最高，与大多数研究报道的细菌接种量（一般控制在1%～5%）相比偏低，然而也有少量研究报道的接种量与本文相似[23-24]。不同的微生物细胞生长情况存在差异，细菌B1213 经2 次活化后，细胞生长代谢活跃，在低接种量时，便能快速适应发酵培养基环境而高产酶，在高接种量时，则因菌株快速大量的生长繁殖而消耗较多营养物质导致产酶水平下降。
图7 接种量对细菌B1213 产葡聚糖酶的影响
Fig.7 Effect of inoculum volume on the glucanase production by B.pyrrocinia B1213
2.1.8 装液量与转速对B1213 产葡聚糖酶的影响溶氧关系着微生物的生长代谢和发酵产物含量，是调控微生物发酵合成代谢产物的重要参数[25]。适宜的溶氧量有助于微生物发酵产酶，而过低或过高则会影响微生物呼吸作用而影响微生物的生长或代谢，对微生物产酶产生抑制作用。在摇瓶发酵水平上，通常采用装液量和转速来调控溶氧量，装液量少，转速高，则溶氧量高，反之，则溶氧量低。由图8 所示，随着装液量的增加，B1213所产葡聚糖酶活力不断降低，而随着转速的增加，其所产葡聚糖酶活力先略有升高后降低，综合可见，B1213 需要较高的溶氧量，细胞相对比较敏感，难以承受高剪切力。
图8 装液量（a）与转速（b）对细菌B1213 产葡聚糖酶的影响
Fig.8 Effect of liquid medium volume（a）and shaking speed（b）on the glucanase production by B.pyrrocinia B1213
2.1.9 温度对B1213 产葡聚糖酶的影响 温度是影响微生物生长和发酵的重要参数之一，通过温度的控制可以调控微生物代谢能力。由图9 可知，B1213 产葡聚糖酶的最适温度为30 ℃，这与该菌的最适生长温度一致，过低或过高的温度都会影响菌株的生长和繁殖，从而抑制其发酵产葡聚糖酶。一般而言，微生物生长和代谢产酶的最佳温度因种类不同而有所差异，如泡盛曲霉CAU33 最适产葡聚糖酶温度为35 ℃，而链霉菌BRC1 和BRC2 的最适产葡聚糖酶温度为26 ℃[16，26]。
图9 温度对细菌B1213 产葡聚糖酶的影响
Fig.9 Effect of incubating temperature on the glucanase production by B.pyrrocinia B1213
2.1.10 表面活性剂种类及其浓度对B1213 产葡聚糖酶的影响 表面活性剂是一种两亲物质，不同表面活性剂会在不同程度上影响微生物细胞膜的结构，引起细胞膜通透性发生变化而产生差异，从而使微生物细胞吸收营养物质、利用氧气及分泌酶的能力产生变化，影响微生物产酶水平[27]。由图10 可知，除吐温40 对B1213 产葡聚糖酶有一定抑制外，吐温系列的表面活性剂对其产酶没有显著影响，曲拉通114 对其产酶也未有显著差异，而曲拉通100 则对其产酶具有促进作用，另外，甘油对其产酶有一定抑制作用。不同表面活性剂对微生物产酶的影响有一定差异，这与对应微生物细胞膜中成分和组成有关。确定曲拉通100 对菌株B1213 产葡聚糖酶具有促进作用后，考察其质量浓度对菌株B1213 产葡聚糖酶的影响，结果如图11 所示，在较低质量浓度时，其对产酶影响不显著，当质量浓度为20 g/L 时，能够显著促进B1213 产葡聚糖酶，质量浓度继续增大，则对细胞膜有一定的破坏，使细胞膜通透性过大，引起细胞内电解质外渗，导致各种代谢失调而引起产酶水平降低[27]。
图10 表面活性剂种类对细菌B1213 产葡聚糖酶的影响
Fig.10 Effect of different surfactants on the glucanase production by B.pyrrocinia B1213
图11 曲拉通100 质量浓度对细菌B1213产葡聚糖酶的影响
Fig.11 Effect of Triton X-100 mass concentration on the glucanase production by B.pyrrocinia B1213
2.1.11 时间对B1213 产葡聚糖酶的影响 在发酵前期，微生物主要进行生长和繁殖，在中后期进行主发酵产生代谢物和酶。不同微生物其对应的最佳产酶时间有所不同。由图12 可知，随着培养时间的延长，细菌B1213 发酵产葡聚糖酶水平升高，在培养96 h 时，产葡聚糖酶活力最高，为636 U/mL，继续延长培养时间，葡聚糖酶活力有所降低，这可能是由于其产生的蛋白酶对其降解速率高于其合成葡聚糖酶速率所致。一般而言，细菌最佳产酶时间略短于霉菌，如泡盛曲霉CAU33 和裂褶菌产葡聚糖酶的最佳时间都为144 h[16，28]。
图12 时间对细菌B1213 产葡聚糖酶的影响
Fig.12 Effect of fermentation time on the glucanase production by B.pyrrocinia B1213
2.2 PB 试验
根据单因素实验结果，选取麦麸为碳源（粒度为40～60 目），酵母浸粉为氮源，采用PB 试验设计进一步分析麦麸质量浓度（X1）、酵母浸粉质量浓度（X2）、接种量（X3）、装液量（X4）、曲拉通100质量浓度（X5）、时间（X6）、温度（X7）和初始pH 值（X8）8 个因素对细菌B1213 产葡聚糖酶的影响，依据单因素优化实验结果，并考虑实验经济因素确定各因素中心值和高低水平，共设计N=15 的PB 试验（表5）。
表5 PB 试验设计及结果
Table 5 Experimental design of PB and the results for glucanase activity
通过对试验结果进行分析，得到最优回归方程为：
通过方差分析（表6）可以看出，回归模型极显著，相关系数R2=0.9530 表明该模型能够很好的预测细菌B1213 发酵合成葡聚糖酶活力。从表7 可以看出，接种量、曲拉通100 质量浓度、时间和pH 值对该菌产葡聚糖酶影响显著，因此，选择此4 个因素进行后续爬坡试验，其它因素，则选取PB 试验中的中心值。
表6 PB 试验回归方程方差分析
Table 6 Regression equation analysis of variance in PB design
表7 PB 试验模型偏回归系数与显著性检验分析
Table 7 Model partial regression coefficient and significance analysis in PB design
注：**.P<0.01 差异高度显著；*.P<0.05 差异显著；a.可信度（%）=（1-P 值）×100。
2.3 最陡爬坡试验
最陡爬坡试验设计及结果见表3，试验结果表明葡聚糖酶活力呈“抛物线”变化趋势，并且以第二组试验所获得的葡聚糖酶活力最高，即接种量为0.15%，曲拉通100 质量浓度为25 g/L，诱导时间为84 h，pH=6.5 时，葡聚糖酶活力为1 219 U/mL。因此，结合PB 中因素显著性，选择第二组中的时间、接种量和初始pH 值3 个因素及其对应水平作为响应面试验的因素和中心点。
2.4 Box-Behnken 试验
根据Box-Behnken 设计方法对时间、接种量和初始pH 值进行响应面试验，结果如表8 所示，利用Design-Expert 软件处理试验结果，获得多元二次回归拟合方程如下：
表8 Box-Behnken 试验设计及产葡聚糖酶活力结果
Table 8 The Box-Behnken design and the responses of the dependent variables
由方差分析（表9）的模型和失拟项P 值显著可知，该方程拟合程度良好，可以利用该方程对菌株B1213 产葡聚糖酶活力进行很好的预测，另外，回归方程决定系数（R2=0.9915），也表明采用该二阶回归方程获得的预测值与真实值间具有很高的相关性。
表9 Box-Behnken 试验设计回归方程方差分析
Table 9 Experimental design regression equation analysis of variance of the Box-Behnken design
（续表9）
注：***.P<0.001 差异极显著；**.P<0.01 差异高度显著；*.P<0.05 差异显著。
方差分析结果（表9）表明，一次项A、B 和C显著（P<0.05），且3 因素对葡聚糖酶活力的影响顺序为：时间>初始pH 值>接种量，这与PB 试验结果略有差异，可能是两者分析的因素数量及运算方法不同有关；另外，A2、B2 和C2 显著，表明这3个因素对菌株B1213 产葡聚糖酶具有极显著的曲面效应；时间和接种量交互极显著，而其它交互作用不显著。由响应面图（图13）更为直观的看出，随各因素水平的增加，葡聚糖酶活力呈先上升后下降的趋势，拟合曲线均为凸形，有最大值，通过Design-Expert 软件求解方程，得到预测最优条件：时间83 h、接种量0.15%和初始pH 值6.6，在该条件下，葡聚糖酶活力的预测值为1 172 U/mL。按照上述条件进行验证，试验结果为1 230 U/mL，与模型预测值基本吻合，表明模型可靠。在该优化结果条件下，B1213 所产葡聚糖酶活力相比单因素最高发酵水平（873 U/mL）提升了41%。
图13 各因素间相互作用影响葡聚糖酶活力的响应曲面及其等高线图
Fig.13 The response surface interaction of variable and its contour plots on the glucanase activity response using he Box-Behnken design
3 结论
吡咯伯克霍尔德氏菌是1 株白酒源功能微生物菌株，其在白酒酿造中可能发挥着重要的作用。本文基于前期研究发现，该菌株具有葡聚糖酶活性，故对其产葡聚糖酶活性进行研究，以期为其在白酒中的应用提供理论价基础。首先，通过单因素实验考察了碳源种类、碳源质量浓度、碳源粒度、氮源种类、氮源质量浓度、初始pH 值、接种量、装液量、转速、温度、表面活性剂种类、表面活性剂质量浓度和时间，分别对细菌B1213 产葡聚糖酶活力的影响，从中确定了对葡聚糖酶活力影响较大的潜在因素及其对应的因素水平；然后采用PB 试验进一步确定了4 个对葡聚糖酶活力影响较大的关键因素：接种量、曲拉通100 质量浓度、时间和初始pH 值；利用最陡爬坡试验对以上4 个因素进行组合优化，获得Box-Behnken 试验设计的中心值，最后采用响应面优化获得细菌B1213 产葡聚糖酶的最佳条件为：麦麸粒度为40～60 目，麦麸质量浓度为50 g/L，酵母浸粉质量浓度为8 g/L，初始pH 值为6.6，装液量为30 mL/250 mL，接种量为0.15%，曲拉通100 质量浓度为25 g/L，在温度为30 ℃，转速为160 r/min 下，培养83 h。在此培养条件下，其产葡聚糖酶活力达到1 230 U/mL，较优化前酶活力提高了41%。该研究有助于菌株B1213 更好的在白酒酿造中发挥作用。
[1] GAO M J，YANG G S，LI F F，et al.Efficient endo-β-1，3-glucanase expression in Pichia pastoris for co -culture with Agrobacterium sp.for direct curdlan oligosaccharide production [J].International Journal of Biological Macromolecules，2021，182：1611-1617.
[2] CANALES A M，GARZA R，SIERRA J A，et al.The application of a beta-glucanase with additional side activities in brewing[J].Technical Quarterly，Master Brewers' Association of the Americas，1988，25（1）：27-31.
[3] LAMP A E，EVANS A M，MORITZ J S.The effects of pelleting and glucanase supplementation in hulled barley based diets on feed manufacture，broiler performance，and digesta viscosity[J].Journal of Applied Poultry Research，2015，24（3）：295-303.
[4] 刘璐，陈洲，陈瑶瑶，等.黄曲霉产胞外β-1，3-1，4-葡聚糖酶的发酵条件优化[J].食品科学技术学报，2019，37（1）：28-35.LIU L，CHEN Z，CHEN Y Y，et al.Optimization of fermentation conditions for β-1，3-1，4-glucanase production by Aspergillus flavus[J].Journal of Food Science and Technology，2019，37（1）：28-35.
[5] WANG L L，RUAN H，ZHANG H E，et al.Characterization of a thermostable and acidic-tolerable beta -glucanase from aerobic fungi Trichoderma koningii ZJU-T[J].Journal of Food Science，2007，72（9）：C452-C456.
[6] QIAO J Y，ZHANG B，CHEN Y Q，et al.Codon optimization，expression and characterization of Bacillus subtilis MA139 beta-1，3-1，4-glucanase in Pichia pastoris[J].Biologia，2010，65（2）：191-196.
[7] VAN RENSBURG P，VAN ZYL W H，PRETORIUS I S.Over-expression of the Saccharomyces cerevisiae exo -beta -1，3 -glucanase gene together with the Bacillus subtilis endo-beta-1，3-1，4-glucanase gene and the Butyrivibrio fibrisolvens endobeta -1，4 -glucanase gene in yeast [J].Journal of Biotechnology，1997，55（1）：43-53.
[8] FAYAD K P，SIMAO-BEAUNOIR A M，GAUTHIER A，et al.Purification and properties of a beta-1，6-glucanase from Streptomyces sp EF -14，an actinomycete antagonistic to Phytophthora spp[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2001，57（1/2）：117-123.
[9] 汪凌旭，易卓林，罗惠波，等.来源于不同表达菌株的β-葡聚糖酶酶学性质比较[J].应用与环境生物学报，2022（3）：1-10.WANG L X，YI Z L，LUO H B，et al.Comparison of enzymatic properties of β-glucanase from different expression strains[J].Chinese Journal of Applied &Environmental Biology，2022（3）：1-10.
[10] 范光森，吴秋华，刘朋肖，等.脂肪酶在白酒酯类化合物合成中的作用研究进展[J].中国食品学报，2021，21（1）：351-360.FAN G S，WU Q H，LIU P X，et al.Research progress on the role of lipase in the synthesis of esters in Baijiu[J].Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology，2021，21（1）：351-360.
[11] HUANG Y H，YI Z L，JIN Y L，et al.Metatranscriptomics reveals the functions and enzyme profiles of the microbial community in Chinese Nong-flavor liquor starter[J].Frontiers in Microbiology，2017，8：1747.
[12] HU X Q，FAN G S，LIAO H，et al.Optimized soluble expression of a novel endoglucanase from Burkholderia pyrrocinia in Escherichia coli[J].3 Biotech，2020，10（9）：387.
[13] ALI B，YI Z L，FANG Y，et al.Characterization of a fungal thermostable endoglucanase from Chinese Nong-flavor daqu by metatranscriptomic method[J].International Journal of Biological Macromolecules，2019，121：183-190.
[14] TOBISCH S，GLASER P，KRUGER S，et al.Identification and characterization of a new beta-glucoside utilization system in Bacillus subtilis[J].Journal of Bacteriology，1997，179（2）：496-506.
[15] TANG X J，HE G Q，CHEN Q H，et al.Medium optimization for the production of thermal stable beta-glucanase by Bacillus subtilis ZJF-1A5 using response surface methodology[J].Bioresource Technology，2004，93（2）：175-181.
[16] 刘二伟，杨绍青，闫巧娟，等.泡盛曲霉液体发酵产β-1，3-1，4-葡聚糖酶的条件优化[J].食品科学，2017，38（16）：29-35.LIU E W，YANG S Q，YAN Q J，et al.Optimization of liquid-state fermentation conditions for β-1，3-1，4-glucanase（lichenase）production by Aspergillus awamori [J].Food Science，2017，38（16）：29-35.
[17] 刘德海，何蔚荭，王红云，等.饲用葡聚糖酶高产菌株的选育及发酵条件研究[J].河南科学，2010，28（11）：408-411.LIU D H，HE W H，WANG H Y，et al.Screening of strain with high yield of β -glucanase on feeding and studies on fermentation conditions [J].Henan Science，2010，28（11）：408-411.
[18] 杨然，张笑雨，刘朋肖，等.耐热木聚糖酶菌株的筛选鉴定及发酵条件分析[J].食品科学，2019，40（18）：101-107.YANG R，ZHANG X Y，LIU P X，et al.Screening and identification of heat-resistant xylanase-producing strain and investigation of fermentation conditions[J].Food Science，2019，40（18）：101-107.
[19] 滕超，范园园，曲玲玉，等.嗜热真菌Talaromyces thermophilus F1208 产木聚糖酶条件优化[J].中国食品学报，2015，15（8）：85-93.TENG C，FAN Y Y，QU L Y，et al.Optimization of high -producing xylanase by thermophilic fungi Talaromyces thermophilus F1208[J].Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology，2015，15（8）：85-93.
[20] 朱运平，禇文丹，李秀婷，等.一株产木聚糖酶放线菌的液体发酵条件优化及水解特性研究[J].食品科学，2012，33（21）：177-182.ZHU Y P，CHU W D，LI X T，et al.Optimization of liquid fermentation conditions for xylanase production by a Actinomyces and characterization of the enzyme[J].Food Science，2012，33（21）：177-182.
[21] CAO Y，MENG D J，LU J，et al.Statistical optimization of xylanase production by Aspergillus niger AN-13 under submerged fermentation using response surface methodology[J].African Journal of Biotechnology，2008，7（5）：631-638.
[22] 范光森.樟绒枝霉耐热木聚糖酶的纯化、性质和应用研究[D].北京：中国农业大学，2014.FAN G S.Purification，characterization，and application of thermostable xylanases from Malbranchea cinnamomea[D].Beijing：China Agricultural University，2014.
[23] 毛婷，朱瑞清，牛永艳，等.纤维素降解芽孢菌的筛选及产酶条件优化[J].中国酿造，2020，39（1）：71-76.TING M，ZHU R Q，NIU Y Y，et al.Screening and enzyme production conditions optimization of cellulose-degrading Bacillus[J].China Brewing，2020，39（1）：71-76.
[24] 陈朋，朱玥明，韩文佳，等.产褐藻胶裂解酶菌种的筛选、鉴定及发酵条件优化[J].食品科学，2015，36（15）：105-111.CHEN P，ZHU Y M，HAN W J，et al.Screening and identification of a Bacterial strain and optimization of medium composition and culture conditions for the production of alginate lyase[J].Food Science，2015，36（15）：105-111.
[25] FAN G S，LIU P X，CHANG X，et al.Isolation and identification of a high-yield ethyl caproateproducing yeast from Daqu and optimization of its fermentation[J].Frontiers in Microbiology，2021，12：663744.
[26] CHELLAPANDI P，JANI H M.Production of endoglucanase by the native strains of Streptomyces isolates in submerged fermentation[J].Brazilian Journal of Microbiology，2008，39（1）：122-127.
[27] 范光森，杨绍青，闫巧娟，等.嗜热棉毛菌固体发酵产木聚糖酶条件的优化[J].食品工业科技，2012，33（6）：219-224.FAN G S，YANG S Q，YAN Q J，et al.Optimization of xylanase production from Thermomyces lanuginosus CAU44 by solid-state fermentation[J].Science and Technology of Food Industry，2012，33（6）：219-224.
[28] 熊云霞，赵旭，郑必胜.裂褶菌发酵产β-1，3-葡聚糖酶条件的优化[J].现代食品科技，2011，27（6）：643-646，633.XIONG Y X，ZHAO X，ZHENG B S.Optimization of fermentation conditions for producing β-1，3-glucanase by Schizophyllum commune[J].Modern Food Science and Technology，2011，27（6）：643-646，633.