叶黄素（Lutein，LUT）是一种天然类胡萝卜素，在深绿色叶类蔬菜中含量居高[1-2]。它在神经系统发育，预防黄斑变性、心血管疾病等方面发挥作用[3-4]。然而，由于叶黄素分子中含有不饱和键，当其暴露于氧化剂、光和热时，会迅速恶化[5]。构建有效的递送载体是增加水不溶性活性分子应用的常用手段。
牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）具有营养价值高，可生物降解，成本低，易获得等优点[6-7]。此外，BSA 结构上有许多官能团，如硫醇、胺和羧基，可与多种化合物结合[8]，常被作为包封生物活性化合物的有效载体。BSA 是一种双链多结构域蛋白，具有3 个结构域Ⅰ（A，B），Ⅱ（A，B）和Ⅲ（A，B），与HSA 非常相似[9]。Paiva 等[10]通过多光谱法研究LUT 与BSA 相互作用，发现LUT 和BSA 以1∶1 的化学计量比结合形成复合物。
超声波可有效改变食品加工方式，加快蛋白质与小分子的结合[11]。近几年，超声处理广泛用于膳食纤维、多糖、蛋白类食品，以提高加工性能，改善食品的品质因数[12-14]。Wang 等[15]研究表明，超声预处理会使大豆球蛋白色氨酸（Tryptophan，Trp）侧链移动到蛋白质分子的外部。蛋白质三级结构的变化导致其微环境的极性增加。Jiang 等[16]从超声波处理后荧光强度的波动来研究黑豆蛋白质的三级结构，其内部的疏水相互作用被破坏，并暴露在分子表面。
由于人体不能自发产生LUT，需要更有效的LUT 来预防上述疾病，因此，LUT 被考虑用于功能性强化食品。LUT 与BSA 形成复合物已有报道[10]，而超声处理对LUT 与BSA 结合的影响鲜有报道。通过荧光光谱法、紫外-可见吸收光谱法和位点竞争试验，研究不同频率的超声处理对LUT 与BSA结合行为的影响，具有重要意义。为LUT 的深度开发和利用提供有效的途径。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
牛血清白蛋白（98%）、LUT（80%），上海萌芽生物科技有限公司；布洛芬（ibuprofen，IBUP 98%）、华法林（warfarin，WARF 98%），生工生物（上海）股份有限公司；无水乙醇、磷酸氢二钠、柠檬酸（分析纯级），天津市北辰方正试剂厂。
1.2 仪器与设备
F-7000 荧光分光光度计，日本日立高新技术公司；PHS-25 pH 计，上海仪电科学仪器股份有限公司；UV-2700 紫外-可见分光光度计，日本岛津公司；SK6210 HP 超声波清洗器，上海科导超声仪器有限公司；KQ-500 DE 数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 LUT 与BSA 相互作用的荧光光谱 荧光发射光谱的测定参考Yu 等[17]的方法并稍作改动。取7 支规格为5 mL 的离心管，依次加入Tris-HCl缓冲溶液（pH 7.4）2 970，2 920，2 870，2 820，2 770，2 720，2 670 μL，再分别加入1.2×10-4 mol/L BSA 储备液30 μL，最后加入一定体积7.2×10-4 mol/L LUT，溶液总量为3 mL，摇匀，使其反应充分。以298 K 和310 K、超声频率0 Hz 为对照组，超声频率（40 kHz/53 kHz）为试验组，避光反应30 min。对6 组处理样品，设置激发波长280 nm，发射波长范围290～500 nm，激发光栅2.5 nm、发射狭缝5.0 nm。分别测定6 组样品在发射波长290～500 nm 范围的光谱并记录数据。
1.3.2 同步荧光光谱的测定 激发波长与发射波长的间隔分别设为Δλ=15 nm 和Δλ=60 nm，激发、发射狭缝分别定为2.5 nm 和5.0 nm。在298 K和310 K 测定6 组处理样品在250～350 nm 的同步光谱并记录数据。
1.3.3 LUT 与BSA 相互作用的紫外-可见吸收光谱 参照方法1.3.1 节，在298 K 和310 K 测定6组样品在波长200～600 nm 范围的紫外吸收光谱并记录数据。
1.3.4 IBUP、WARF 位点竞争试验 参照1.3.1节方法，在加入LUT 储备溶液前，先加入25 μL 7.2×10-4 mol/L IBUP/WARF，充分摇匀，避光静置30 min，后续操作同1.3.1 节。
1.3.5 分子模拟 为进一步研究LUT 与BSA 的相互作用，利用AutoDock 4.0 软件进行分子对接分析。LUT 配体（CID：5281243）和BSA 蛋白（ID：4OR0）的晶体结构分别从PubChem 和蛋白数据库RCSB PDB 下载[10]。在分子对接前，首先去除氢原子、水分子及b 链，之后进行网格尺寸设置为86 Å×56 Å×64 Å，以覆盖网格中心在X=8.66，Y=21.11，Z=103.6 的所有BSA 活性位点氨基酸残基，BSA刚性对接，LUT 柔性对接，其它对接参数都保留为默认参数，选择最低对接构象进行研究。
1.3.6 数据处理 本试验重复3 次，结果表示为
。用Excel 处理数据，用Origin 2018 软件绘制谱图，用SPSS 软件进行数据显著性差异分析（P<0.05 为显著）。
2 结果与分析
2.1 超声频率对LUT 与BSA 荧光猝灭的影响
BSA 固有的荧光主要来源于其酪氨酸（Tyrosine，Tyr）、苯丙氨酸（Phenylalanine，Phe）和Trp 芳香族氨基酸残基[18]。荧光猝灭是指荧光物质分子与溶剂分子之间发生猝灭的现象，药物配体可以降低荧光团的强度，BSA 荧光基团周围微环境的极性变化会导致光谱红移或蓝移[19]。在298 K，超声频率0 Hz/40 kHz/53 kHz 时，BSA 最大发射波长随LUT 浓度的增加发生蓝移（2，3 nm 和2 nm），表明BSA 附近微环境发生变化，疏水性增强。在温度310 K，超声频率为0 Hz/40 kHz/53 kHz 时，随着LUT 浓度的增加，BSA 荧光强度的最大峰位置在0 Hz 时发生蓝移（4 nm），在40 kHz 和53 kHz处理条件下红移（1 nm 和2 nm），表明其内部疏水相互作用可能被破坏，疏水性降低。由图1 可知，不同温度时，随着超声频率的升高猝灭率逐渐增加，在310 K，53 kHz 时猝灭率最高（50.6%），说明超声处理时BSA 三级结构存在显著差异，影响BSA 与LUT 的结合。
图1 不同超声频率下LUT 与BSA 结合的荧光发射光谱
Fig.1 Fluorescence emission spectra of LUT binding to BSA at different ultrasonic frequencies
注：BSA 浓度1.2 μmol/L，叶黄素浓度（1→7）依次为0，12，24，36，48，60，72 μmol/L。
2.2 荧光猝灭机理与热力学分析
2.2.1 荧光猝灭机理 分析BSA 在不同温度、超声频率下随LUT 浓度增加的荧光猝灭光谱。LUT可以猝灭BSA 的固有荧光。采用Stern-Volmer 方程（1）Hill 方程（2）进行分析评价[20]。
式中，F0、F——分别是BSA 在LUT 存在和不存在时的荧光强度；Kq——静态猝灭速率常数；τ0——蛋白质的平均寿命，约10-8 s；[Q]——LUT浓度，mol/L；Ksv——分子猝灭常数；Ka——LUTBSA 结合常数；n——结合位点的数量。
由表1 数据可知，超声频率0 Hz/40 kHz/53 kHz 时，LUT 活性分子猝灭常数（Kq）高于猝灭常数值2.0×1010 L/（mol·s），表明LUT 通过静态猝灭机制诱导BSA 发生荧光猝灭[21]。在不同超声频率条件下二者的结合位点数近似等于1，判断LUT与BSA 形成物质的量比为1∶1 的复合物。同时，LUT-BSA 复合物的结合常数均大于104 数量级，证实二者间有强的结合行为，且在超声频率53 kHz 时结合常数最大，与荧光发射光谱分析结果一致。
表1 LUT 与BSA 相互作用的猝灭常数、结合常数和结合位点
Table 1 Quenching constants，binding constanta and binding sites of BSA interacting with LUT
注：Ra 为方程（1）拟合Ksv 相关系数，Rb 为方程（2）拟合Ka 相关系数。
2.2.2 热力学性质 对BSA 与LUT 结合的热力学进行分析，确定LUT 在BSA 上的结合位点，了解LUT-BSA 结合的主要驱动力，有助于优化BSA运输LUT 的热力学条件。由热力学方程（3）和（4）分别计算相关参数[22]。通过不同超声频率处理比较热力学常数值的变化，判断结合力类型。
式中，K1、K2——T1（298 K）、T2（310 K）时的结合常数；R——热力学常数值，8.314 J/（mol·K）；ΔH——焓变，kJ/mol；ΔS ——熵变，J/（mol·K）；ΔG——吉布斯自由能，kJ/mol。
LUT 与BSA 之间的结合力类型可根据以下3种形式判断，当ΔH 为负值，TΔS 为正值时，静电相互作用占主导地位；当ΔH 和TΔS 均为正值时，疏水作用驱动结合过程；当ΔH 和TΔS 均为负值时，氢键和范德华力是分子间主要作用力[23]。由表2 可知，ΔG 和ΔH 均为负值，说明LUT-BSA 复合物的形成是自发形成的放热反应；ΔG 为负值，随着温度的升高略有降低，这表明在一定温度范围，BSA-LUT 复合物比游离BSA 和LUT 分子更稳定，温度越高，配合物越稳定。当超声频率为0 Hz/40 kHz 时，TΔS＜0，二者结合主要依赖于氢键和范德华力；当超声频率53 kHz 时，TΔS＞0，主要作用力是静电引力，推测超声频率过高改变了二者结合的作用力类型。
表2 LUT 与BSA 相互作用的热力学常数
Table 2 Thermodynamic constants of BSA interacting with LUT
2.3 同步荧光光谱
同步荧光图谱可提供残基周围微环境的极性与空间是否舒展等信息[24]。从图2 可看出，试验组样品荧光峰值均高于对照组样品的荧光峰值，说明超声处理使BSA 结构变得更加舒展，更加有利于LUT 与BSA 的结合[25]。在温度298 K，超声频率0 Hz/40 kHz/53 kHz 时，Tyr 发射波长分别红移1.5，0.4 nm 和0.9 nm。Trp 发射波长分别蓝移0.6，0.7 nm 和1.3 nm。根据Samari 等[26]研究可知，蓝移表示Trp 和Tyr 残基所处微环境极性减弱，周围空间收缩；红移则相反。超声处理会使Tyr 残基红移变小，即阻碍Tyr 周边肽链的折叠；而超声处理使Trp 残基蓝移变大，即促进其周围空间的收缩。在同步荧光光谱图中，随着超声频率的增强，Trp的荧光强度呈现明显下降趋势，在超声功率53 kHz 时变化最显著（P＜0.05）。综上所述，LUT 主要与BSA 结构中的Trp 残基相互作用，超声处理改变了BSA 的构象。
图2 0 Hz（a，b），40 kHz（c，d），53 kHz（e，f）时LUT 与BSA 相互作用的同步荧光光谱（298 K）
Fig.2 Synchronous fluorescence spectra of LUT binding to BSA at 0 Hz（a，b），40 kHz（c，d），53 kHz（e，f）（298 K）
注：BSA 浓度1.2 mol/L，叶黄素浓度（1→7）依次为0，12，24，36，48，60，72 μmol/L。
2.4 超声频率对LUT 与BSA 结合紫外吸收光谱的影响
BSA 的吸收最大值对周围的微环境高度敏感，并因蛋白质构象的变化而发生变化[17]。在图3紫外光谱图中BSA 有两个典型的吸收峰，225 nm处的峰表征蛋白质中的肽键，279 nm 处的峰反映芳香族氨基酸（Trp、Tyr 和Phe）[27]。在温度298 K，改变超声频率，随着LUT 的加入，BSA 在225 nm处的峰值强度下降，水平方向没有移动；在279 nm 处BSA 的吸收强度降低，并发生轻微的蓝移，水分子亲和力下降。超声处理组样品吸光值均明显高于未经超声组样品的吸光值（P＜0.05），即BSA 中加入LUT 后有明显的增色效应，且随LUT浓度的增大，增色效应增强，表明加入LUT 影响BSA 的结构，改变了BSA 分子的取代基结构，表明因LUT 和BSA 形成复合物而引起BSA 吸收光谱的变化，与荧光光谱的分析结果一致。
图3 LUT 与BSA 相互作用的紫外可见光谱
Fig.3 UV-Vis spectra of LUT binding to BSA
注：BSA 浓度1.2 μmol/L 叶黄素浓度（1→7）依次为0，12，24，36，48，60，72 μmol/L。
2.5 LUT 与BSA 的结合位点
研究发现，IBUP 和WARF 可以作为BSA 亚结构域ⅡA（Sudlow's site Ⅰ）和亚结构域ⅢA（Sudlow's site Ⅱ）既定位点的荧光探针[28]。通过对猝灭率的比较，可以判断LUT 与BSA 的结合位点是否位于亚结构域ⅡA 或亚结构域ⅢA。
图4 显示在温度298 K，未超声处理条件下，两种标记物对于LUT 与BSA 相互作用荧光光谱的影响。可以看出，标记物IBUP 和WARF 的加入并未降低LUT-BSA 复合物的猝灭率，因此不存在标记物位点竞争，说明LUT 与BSA 的结合位点不在亚结构域ⅡA 和亚结构域ⅢA。
图4 位点竞争试验的荧光光谱图及猝灭率（298 K）
Fig.4 Fluorescence spectrogram and quenching rate of site competition experiment（298 K）
注：BSA 浓度1.2 μmol/L，IBUP/WARF 浓度6.0 μmol/L，a 图和c 图1→7 依次为LUT 浓度0，12，24，36，48，60，72 μmol/L。
2.6 LUT 与BSA 的分子对接结果
分子对接技术不仅可以证明氢键的存在，还可以验证竞争试验结果[29]。利用Autodock vina 对接软件分析10 种预测。根据吉布斯自由能选取最佳构象，ΔG 值为-35.16 kJ/mol。与热力学常数值存在差异，可能是受缓冲溶液离子和未结合分子（如水）的影响，这些因素在对接研究中被忽略了[30]。由图5 可知，当与BSA 结合时，LUT 被Leu 490 通过氢键包围，Pro 492、Arg 412、Val 408、Tyr 400、Arg 409、Ala 405 等残基通过疏水相互作用包围，与结合竞争试验一致。
图5 LUT 和BSA 的预测结合位点、氨基酸残基及作用力
Fig.5 Predicted bindding site，the binding sites ammino acids and interaction forces of LUT and BSA
注：绿色键代表氢键，黄色键代表疏水相互作用。
3 结论
采用荧光光谱法研究超声处理（0 Hz/40 kHz/53 kHz）对LUT 与BSA 的荧光猝灭作用；采用同步荧光和紫外-可见吸收光谱判断3 种超声条件下LUT 对HSA 三级结构的影响；采用位点竞争试验结合分子对接确定结合位点及相互残基作用力。结果表明，超声处理使LUT 对BSA 的猝灭作用增强，53 kHz 超声处理猝灭效果最好，结合常数最大，二者主要通过氢键和疏水相互作用与BSA自发结合，随着超声频率的增加，改变了作用力的结合方式。位点Marker 试验和分子对接试验表明，LUT 与BSA 结合位点位于亚结构域ⅢA 和ⅢB 之间。本试验结果表明：增大超声频率可促进LUT 与BSA 的结合，为后续超声频率调控食品中蛋白与小分子相互作用提供了新思路。
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