酵素（Jiaosu）是当前世界发酵植物领域内的一款流行的食品[1]。它是以动物、植物、菌类等为原料，添加或不添加辅料，经微生物发酵制得的含有特定生物活性成分的产品，包括酶类、酚类、有机酸等多种活性成分的混合物[2]。酵素不仅保留了果蔬富含的碳水化合物、多酚、维生素、矿物质和膳食纤维，还通过发酵改变了感官特性、营养品质、保质期、最终产品的经济价值等[3]。如今市售的食用酵素是指广义的酵素，强调微生态整体，不仅包含酶和活性成分，也包含产酶微生物和相关调节因子及相互作用，例如激活剂及抑制剂、协同调控因子及反馈调控因子等[4]。这些物质通过影响机体机能来调节细胞层面的生命活动，将大分子物质加速分解成小分子物质，例如将大分子的多糖转化为葡萄糖，蛋白质分解成氨基酸等活动，从而被机体细胞充分吸收利用来维持机体功能、组织修复、食物消化等生命活动[5]。
此外，近年来因乳糖不耐受、牛奶蛋白过敏、素食主义等人群越来越多，故酵素产品受到越来越多消费者的关注，生产酵素产品的企业也越来越多[6]。由此科学界对酵素的设计和功能特性的研究日益增多。酵素中大量含有的酚类、有机酸等物质，能够调节肠道pH 值，改变菌群之间的丰度，从而改善肠道微环境，促进肠道蠕动，增强肠道代谢功能[7]。菌群丰度的改变不仅影响肠道微生物的初生代谢产物，也影响其次级代谢产物，例如短链脂肪酸（SCFAs）的改变影响肠道屏障功能和免疫应答，进而抑制病原菌侵袭和定植[8]。与此同时，微环境的改变会调节肠道微生物的稳定性和恢复力，促进机体健康，并且有效抑制病原微生物定植[9]。目前已有诸多研究发现酵素可以影响小鼠肠道菌群的多样性[10]，具有减肥[11]，提高免疫功能[12]，减缓Ⅰ型糖尿病[13]等诸多功效，然而，目前还未有关于酵素对人体肠道影响的报道。基于此，本试验以健康人群为研究对象，采集26 名健康青年持续摄入复合蔬菜酵素前、后的粪便样本，利用高通量测序技术检测粪便样品内的微生物菌群多样性，探究摄入酵素是否引起肠道菌群的变化，并预测其产生的功能。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器
1.1.1 材料 由韩国圃美多公司提供的复合蔬菜液体酵素，成分为茄子33.50%、奶白菜10.00%、韭菜0.50%、奶黄瓜1.00%、黄瓜1.00%、二荆条1.00%、水白菜10.00%、苋菜10.00%、冬瓜10.00%、秋葵3.00%、低聚果糖19.99%。制作过程如下：按0.01%接种量向复合蔬菜汁接种活化后的乳杆菌PMO08，发酵72 h 后与质量分数55%低聚果糖溶液等体积混合，在25 ℃后熟3 个月，后熟期间每周进行充分搅拌。经检测，此复合蔬菜液体酵素富含维生素、矿物质、有机酸、酶类、低聚果糖等，且具有一定的抗氧化性，是一种营养丰富、营养均衡、口感良好的健康饮品。
1.1.2 试剂 基因组DNA 提取试剂盒，上海索宝生物科技有限公司。
1.1.3 仪器 DYCZ-TRANS2 电泳仪，北京六一生物科技有限公司；ABI
9700PCR 仪，美国应用生物系统公司；无菌便样采管（30 mL），上海朗赋实业有限公司；DW-86W102 超低温冰柜，澳柯玛股份有限公司；NanoDrop2000 超微量分光光度计，上海土森视觉科技有限公司。
1.2 试验对象
26 名年龄在21～27 岁之间健康的中国青年（男13 名，女13 名），平均年龄为（23.54 ± 1.48）岁，身体质量指数（BMI 值）均在18.0～23.9 kg/m2之间。所有青年均在中国重庆生活了3 个月以上，且近1 个月内未服用过激素类、抗生素和益生菌类产品，且无宗教信仰[14]。研究对象保持日常饮食的情况下，连续14 d 在每日晚上8 点服用3 倍稀释后的酵素30 mL。分别于服用后的第0，7 天和14 天采集研究对象的粪便样本。采用已经做好标记的一次性无菌便样采管进行粪便样本采集，每次2 份。采样后用封口膜将采样管管口封好后迅速置于液氮中，后将样品转移入-80 ℃超低温冰柜保存备用。
1.3 试验方法与设计
采用基因组DNA 提取试剂盒提取粪便样品的DNA。采用超微量分光光度计对DNA 的浓度和纯度进行检测，后用琼脂糖凝胶电泳进行DNA完整性的检测。采用PCR 仪进行PCR 扩增。PCR扩增引物：细菌16S rRNA V3～V4 可变区域引物338F（ACTCCTACGGGAGGCAGCAG）和 806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）。以上操作由上海美吉生物有限公司协助完成。
1.4 统计分析方法
通过高通量测序得到的原始数据，经指控拼接后，再以QIIME2（v2020.2）进行降噪（DADA2Deblur），得到扩增序列变体（Amplified sequence variants，ASV）代表序列和ASV 峰度表。采用classify-sklearn（Naive Bayes）对ASV 代表序列进行分类学分析，获得获得了菌群的基本分类：域（Domain）、界（Kingdom）、门（Phylum）、纲（Class）、目（Order）、科（Family）、属（Genus）、种（Species），与数据库silva138 进行对比，并在交互平台按着最小样本序列数进行抽平后进行分析。将数据以第0，7，14 天（即d-0 组、d-7 组、d-14组）进行分类。以P＜0.05 为差异有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 肠道菌群丰度分析
78 份粪便测序样本共获得9 412 887 优化序列，3 879 334 703 碱基，得到微生物种类如下：1 域、1 界、15 门、22 纲、57 目、104 科、286 属、544 种、3 647 ASV。稀释曲线在小于500 条测序序列时，Shannon 指数随着序列增加而迅速增加，大于500 后Shannon 指数随着序列增加趋于平缓进入平台期，本次研究的序列样本数量均在5 000 以上，说明本次测序数据量足够大，足以反映样本中绝大多数的微生物多样性信息，适合进行下一步分析（图1a）。
图1 ASV 分类学水平上的稀释曲线（a）和维恩图（b）
Fig.1 Rarefaction curve（a）and venn diagram（b）on ASV taxonomic level
图2 ASV 分类学水平上的β 多样性分析（NMDS）
Fig.2 Beta diversity analysis on ASV taxonomic level（NMDS）
通过分析粪便样本中菌群的α 多样性，发现3 组共有776 ASV，每个组内各有不同ASV 的菌群，且随着时间的增加ASV 的数目也在增加（图1b）。然而，3 组实际观测到的物种数目（Sobs 值）、群落丰富度（Chao1 值）、群落多样性（Shannon值）、群落均匀度（Shannoneven 值）、群落谱系多样性（PD 值）对比均无统计学意义（表1，P＞0.05），表明在试验期间复合蔬菜酵素对健康青年的肠道菌群的α 多样性无显著影响。进一步评估β 多样性的差异，采用非度量多维尺度（Non-metric multidimensional scaling，NMDS）来显示组间的差异（Analysis of similarities，ANOSIM，距离算法：Weighted-unifrac）。结果显示，3 组之间的物种丰度分布仍具有一定的差异，其中d-7 组和d-14 组（r=0.0404，P=0.0295）之间呈显著差异，而d-0 组和d-7 组之间（r=0.0127，P=0.2215）、d-0 组和d-14 组之间（r=0.0052，P=0.5452）均无显著性差异。这表明在试验期间，酵素对健康青年的肠道菌群在ASV 水平上虽具有一定的影响，但影响相对较小。
表1 α 多样性指数组间差异
Table 1 Differences in alpha diversity index between groups
2.2 肠道菌群在门分类学水平上的组成和差异分析
组内求均值，并将丰度占比＜0.1%的物种归为其它，分析试验对象不同时间的肠道菌群在门分类学水平下的组成差异。发现构成人体肠道微生物菌群主要有厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidota）、放线菌门（Actinobacteriota）、变形菌门（Proteobacteria）、梭杆菌门（Fusobacteriota）、脱硫菌门（Desulfobacterota）、疣微菌门（Verrucomicrobiota）等。由图3a 可知厚壁菌门和拟杆菌门为主要的优势菌门，约占85%以上。运用wilcoxon 符号秩检验的方法，根据得到的群落丰度数据，采用将样本一一对应配对的方案，对不同组样本微生物群落之间的物种进行假设检验，评估物种丰度差异的显著性水平，获得随时间推移的物种信息差异。在试验过程中试验样本的菌群构成均发生了一定的变化。其中d-0 组和d-7 组相比，厚壁菌门和拟杆菌门的丰度均具有显著性差异（P＜0.05）。相比其它2 组，d-7 组中的厚壁菌门的丰度较低，而拟杆菌门丰度较高，而d-0 组和d-14 组相比，仅有含量较低的脱硫菌门具有丰度上的显著性差异。即在试验过程中，厚壁菌门的丰度先显著减少，后到第14 天时增加到和试验开始丰度相似；拟杆菌门的变化则刚好与厚壁菌门相反。
图3 在门分类学水平上的肠道菌群物种组成（a）和肠道菌群分型分析（b 和c）
Fig.3 Species composition of intestinal flora（a）and typing analysis of intestinal flora（b and c）on phylum taxonomic level
注：* 表示差异显著（P＜0.05）。
依据不同样本的丰度优势菌群结构，在组内采用JSD 距离算法进行样本菌群分型分析，可分为2 个菌群型（图3b）。2 个菌群类型的第一优势菌群均为厚壁菌门，然而该优势菌群在两个不同类型菌群中含量有不同（图3c）。类型1 相比类型2 中的厚壁菌门丰度较高，而拟杆菌门丰度相比较低。这与众多研究发现的拟杆菌门的减少将会伴随着厚壁菌门增加相符[15]。统计每个时间段的各类型的人数发现，随着时间的变化，类型1 菌型结构的人数先减少后增加；类型2 菌型结构的人数则先增加后减少（表2），表明在试验过程中，大多数人的肠道菌群菌型均发生了变化。
表2 肠道菌群分组类型组成
Table 2 The composition of intestinal flora grouping type
表3 核心肠道菌群及其相对丰度（丰度前1%，分组下括号内数字表示丰度前1%的菌属相对丰度的总和；单位：%）
Table 3 Core intestinal flora and their relative abundance（top 1% abundance，and the numbers in parentheses below the grouping represent the sum of the relative abundance of the genera in the top 1% of abundance；Unit：%）
（续表3）
注：无标注为均无显著性差异（P＞0.05）；a、b 分别表示与无标注相比差异显著（P＜0.05）；ab 表示与剩余两组均无显著性差异（P＞0.05）。
表4 肠道菌群功能统计（%）
Table 4 Intestinal flora function statistics（%）
2.3 肠道菌群在属分类学水平上的组成和差异分析
在属分类学水平上，试验对象的肠道菌群主要由粪杆菌属（17.91%）、拟杆菌属（8.53%）、双歧杆菌属（6.86%）、巨单胞菌属（6.64%）、布劳特氏菌属（6.32%）、罗斯氏菌属（3.71%）、普氏菌属（3.60%）、不动杆菌属（3.49%）、罕见小球菌属（3.00%）、柯林斯菌属（2.38%）等组成。运用上述门分类学水平相同的方法（wilcoxon 符号秩检验法），分析不同时间菌群在属分类学水平上的差异性。d-0 组与d-7 组具有显著差异的菌群共有26属（图4a）；d-0 组与d-14 组具有显著差异的菌群共有19 属（图4b）；d-7 组与d-14 组具有显著差异的菌群共有33 属（图4c）。
图4 属分类学水平上差异显著的菌群
Fig.4 Significantly different flora on genus level
注：各图右侧数据表示差异性水平（P＜0.05）。
采用线性判别分析及影响因子（Linear discriminant analysis Effect Size，LEfSe），进一步确认具有显著性差异且影响较大的分类群。LEfSe 鉴定出39 个区别特征（图5a），它们的相对丰度的差异对效果影响较大，在属分类学水平上，d-0 组的微生物菌群富集了6 个属，d-7 组的微生物菌群富集了7 个属，d-14 组的微生物菌群富集了2 个属。进一步确认具有显著性差异且影响更大的分类群（图5b），其中d-0 组仅有梭菌纲显著富集，无显著富集的菌属；d-7 组的拟杆菌属显著富集，且影响整个拟杆菌门对差异的效果；d-14 组厚壁菌门的布劳特氏菌属显著富集。
图5 线性判别分析及影响因子
Fig.5 Linear discriminant analysis effect size
2.4 肠道菌群功能预测
为了进一步探索酵素对肠道菌群的影响，采用基于16s rRNA 基因丰度统计分析的PICRUSt2和KEGG 数据库进行分析。肠道菌群大多数具有新陈代谢、环境信息处理、遗传信息处理等功能（表5）。如图6 所示，基于秩和检验结果表明：d-0组和d-7 组、d-7 组和d-14 组具有不同功能且具有显著差异的菌群较多；而d-0 组和d-14 组具有不同功能且具有显著差异的菌群相对较少。
图6 显著差异功能检验
Fig.6 Test of significant differences functional
注：* 表示差异显著（P＜0.05）；** 表示差异极显著（P＜0.01）。
d-0 组和d-14 组仅有与有机系统相关的功能中的循环系统具有显著差异（图6b）。通过对比图6a 和图6c 可知，健康青年的肠道菌群有5 种具体功能在试验过程中一直发生着变化：在与新陈代谢相关的功能中糖的生物合成和代谢的具体功能在试验第7 天达到高峰，而在试验第14 天时降低到试验开始时的丰度；在与人类疾病相关的功能中寄生传染病的具体功能在试验第7 天相对较低，而在试验第14 天时回升到试验开始时的丰度；在与细胞代谢过程相关的功能中细胞生长和死亡、运输和分解代谢的两种具体功能在试验第7天达到高峰，而在试验第14 天时降低到试验开始时的丰度；在与有机系统相关的功能中环境适应的具体功能同样在试验第7 天达到高峰，而在试验第14 天时降低到试验开始时的丰度。
3 讨论
肠道微生物群与人体相互作用，与人体的健康有着密切的关系，近年来已成为科学研究的热点。许多亚健康状态，如肥胖[16]、非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）[17]、糖尿病[18]、精神症状[19]等都与肠道菌群相关。构成人体肠道菌群的主要菌群是厚壁菌门和拟杆菌门，它们的丰度比例在人类肠道微生物组成中具有显著相关性[20]。在试验过程中发现厚壁菌门和拟杆菌门在试验过程中的变化均是显著的，在第7 天时厚壁菌门显著减少，拟杆菌门显著增加。尽管存在一定的争议[21]，但是厚壁菌门和拟杆菌门的丰度与人体的肥胖具有一定的相关性：厚壁菌门和拟杆菌门的比值越大，人体相对越肥胖[22]。拟杆菌门在人体中发挥着降解碳水化合物的作用，被认为是真核生物基因组的补充[23]。当减掉部分体重后，拟杆菌门丰度的增加与体重损失率呈一定的相关性[24]。
此次试验对象入选标准较为严格，个体之间的差异相对较小[25]，同时试验对象所处同一地区且饮食习惯相似[26]，且试验对象人群均为在校大学生，大多在同一食堂就餐，为共居群体，而肠道菌群会在关系密切的人群之间转移，这些共居个体的肠道菌群具有群落相似性[27]，因此试验对象之间的差异性相对较小。然而，研究结果显示类群之间的相似性对测试样本群之间的总体相似性影响并不十分显著，这可能是由于来自同一个人的菌群通常比来自其它人的菌群更为相似，另外可能由于参与试验的对象人数相对较少，从而对数据的解释度相对较低[28]。
已有研究表明影响健康肠道菌群的因素有饮食、外源性益生菌与益生元的使用、抗生素的使用和进行粪菌移植[29]，试验对象在试验期间均未使用抗生素和进行粪菌移植，说明本试验肠道菌群的变化仅与饮食因素和饮用酵素产品相关。研究表明，由于健康成年人长期的膳食习惯，尽管每日饮食复杂多变但并不会引起肠道菌群的显著变化[30]，因此本试验期间肠道菌群的变化可能由于复合蔬菜液体酵素的摄入引起。在无外源物质干扰的情况下，拟杆菌属属内的菌种有着拮抗和互生的关系，因此在人体肠道中相对稳定[31]。布劳特氏菌属是厚壁菌门梭状芽孢杆菌纲（Clostridia）毛螺菌目（Lachnospirales）毛螺菌科（Lachnospiraceae）的菌属[32]，是肠道内外源物质干扰后较易于发生变化且产生短链脂肪酸的有益菌属[33-34]。当试验进行到第7 天时试验对象的肠道菌群的丰度发生着变化，而当试验进行到第14 天时，肠道菌群的丰度逐渐与试验开始时相类似。这可能是由于短期食用动物性或植物性饮食可重复改变人类群体中的微生物群落结构和基因表达[35]。已有研究表明每日的益生元摄入会在短时间内影响特定的结肠菌群，从而改善代谢调节[36]。然而，十几天的的饮食干预不足以改变个体的肠道类型[37]，另外由于健康成年人的肠道菌群已经成型并且难以改变，如果通过饮食或生活方式从根本上改变则需要更长的时间[38]。
4 结论
持续饮用酵素可以影响健康青年肠道菌群组成和丰度，通过分析PICRUSt2 和KEGG 数据库，发现与菌群丰度和结构对应的功能结构的影响也不同。本研究表明，持续饮用酵素至第7 天时，健康青年的肠道菌群的组成和丰度在门和属分类学水平上均与试验开始前产生了显著的变化，持续饮用酵素至第14 天时健康青年的肠道菌群组成和丰度与第7 天相比变化显著，逐渐恢复到试验开始时的组成和丰度。通过分析的PICRUSt2 和KEGG 数据库表明在此过程中同时也引起了肠道菌群的功能结构的变化，而在试验到第14 天时恢复到试验开始时的功能结构。此研究对酵素行业的发展提供指导方向，并为酵素产品对人体肠道菌群影响方面提供理论基础。
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