大黄米（Panicum millaceum L.）是糜子（黍）去皮后的产物，约在10 000 年前起源于中国，目前于中国北部、欧洲、北美、澳大利亚、非洲均有广泛种植[1-2]。淀粉是大黄米的主要成分，其含量在60%～90%[3-4]。此外，大黄米还富含蛋白质、维生素、多种矿物质元素以及膳食纤维，能够预防糖尿病、肝损伤、心血管等疾病[5]。大黄米属营养价值高、药食同源的健康谷物，越来越受欢迎。因缺乏创新的加工技术，故使大黄米这种优质谷物资源长期处于利用率较低的状态，对其精深加工及开发应用较少。
多孔淀粉（Porous starch）也称微孔淀粉，因形成由表面延伸至中心的多孔结构而使比表面积变大，具有优异的物理吸附能力，对被吸附对象无选择性，可作为封装剂、微胶囊芯材载体、吸附剂等，被广泛应用于医药、环境、食品、化妆品等众多领域，扩大了淀粉的应用范围，发展前景广阔[6-8]。
目前制备多孔淀粉的方法主要有化学法、物理法、酶法，其中酶水解法因绿色环保、操作易控制、底物特异性强而被广泛应用[9]。有研究表明[10-12]，α-淀粉酶和糖化酶是酶水解法最主要的酶。α-淀粉酶为一种内切酶，仅内切α-1，4 糖苷键。糖化酶作为外切酶，其专一性较差且只能从非还原末端逐步水解，除能水解α-1，4 糖苷键外，还能缓慢水解α-1，3 和α-1，6 糖苷键[13]。当二者共同作用于淀粉时，复合水解产生的协同作用使水解效果优于单一酶。近年来，制备多孔淀粉的原料较多集中在淀粉含量较高的玉米[14]、大米[15]、木薯[16]等，以大黄米淀粉制备多孔淀粉鲜有研究报道。
本研究以大黄米淀粉为原料，采取Box-Benhnken Design（BBD）试验优化复合酶法（α-淀粉酶和糖化酶）制备大黄米多孔淀粉的工艺，并对大黄米多孔淀粉的结构进行表征。以期制备一种高吸附性能的多孔淀粉，增加大黄米的综合利用价值，为多孔淀粉的开发及应用提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
大黄米，辽宁建平县惠丰源粮食加工有限公司；大豆油，市售；α-淀粉酶（酶活3 479 U/g，参考国标GB/T24401-2009《α-淀粉酶制剂》测定），糖化酶（酶活44 074.072 U/g，参考国标GB1886.174-2016《食品工业用酶制剂》测定），上海源叶生物科技有限公司；氢氧化钠、磷酸氢二钠、无水柠檬酸，分析纯试剂。
1.2 仪器与设备
VERTEX 70 傅里叶变换红外光谱仪，德国Bruker 公司；BT-9300HT 激光粒度分布仪，丹东市百特仪器有限公司；D/MAX2500 X-射线衍射仪，日本理学公司；Sigma 300 超低温扫描电镜，德国Zeiss 公司；ASIQM00002-4 全自动比表面和孔径分析仪，美国Quantachrome 公司；TLXJ-JIB 高速离心机，上海安亭科学仪器厂；Allegra X-30R 高速离心机，美国Beckman 公司；DKZ-2 电热恒温震荡水槽，上海精宏实验设备有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 大黄米淀粉的提取 大黄米→除杂粉碎→过筛（100 目）→碱液浸泡（固液比1 ∶5）→离心水洗（去除上层脂质、蛋白质、色素等物质）→淀粉粗浆→匀浆→调节pH 值至中性→离心（洗涤沉淀）→取沉淀于40 ℃下干燥→粉碎过筛（100 目）→大黄米淀粉。
1.3.2 大黄米多孔淀粉的制备 参考Zhang 等[17]的方法，并稍作修改。称取10 g 大黄米淀粉溶于50 mL 一定pH 值（4.0，4.5，5.0，5.5，6.0）的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液中，混匀后预热10 min。精确称取一定配比（1∶2，1∶3，1∶4，1∶5，1∶6）的α-淀粉酶和糖化酶，与大黄米淀粉悬浮液混合，恒温振荡反应一定时间（6，8，10，12，14，16 h）后，加入4% NaOH 停止酶解反应。将酶解液离心所得沉淀用蒸馏水洗涤后，置于40 ℃烘箱干燥后研碎，过100 目筛，即酶解后大黄米多孔淀粉。
1.3.3 吸油率的测定 参考吴丽荣等[18]的方法，将0.50 g（m1）的淀粉样品置于离心管中，室温下与大豆油以质量比1∶10 的比例震荡，充分混匀后静置30 min，离心（4 000 r/min，10 min），将上层大豆油吸出，倒置至无油滴滴下，加盖称重。吸油率（ω）计算公式：
式中，m1——淀粉样品质量（g）；m2——离心管、淀粉及油的总质量（g）；m0——离心管质量（g）。
1.3.4 单因素实验设计 选取复合酶配比（1∶2，1∶3，1 ∶4，1 ∶5，1 ∶6）、酶添加量（0.2%，0.6%，1.0%，1.4%，1.8%）、酶解pH（4.0，4.5，5.0，5.5，6.0）、酶解温度（40，45，50，55，60 ℃）、酶解时间（6，8，10，12，14，16 h）进行实验，研究其对吸油率的影响。试验固定条件为复合酶配比1∶4，酶添加量1.0%，酶解pH 4.5，酶解温度55 ℃，酶解时间12 h。
1.3.5 响应面试验设计 以单因素实验为基础，采用四因素三水平的响应面分析方法对大黄米多孔淀粉的制备工艺进行优化，试验因素及水平见表1。
表1 试验因素与水平表
Table 1 Experimental factors and levels
1.3.6 粒径分布分析 将少量淀粉粉末分散在测定池中，当遮光度升至12%时，涡旋及超声分散后进样，平行测定3 次，取平均值，得到粒径分布结果。
1.3.7 X-射线衍射析 参考Qiao 等[19]的方法，并稍作修改。采用铜靶Cu-Kα，管压40 kV，管流30 mA，扫描角度范围2θ 为4°～40°。相对结晶度以MDI Jade 6 进行分析。
1.3.8 扫描电镜颗粒形貌分析 为衡量多孔淀粉的成孔情况，将其均匀分布于载物台上，真空喷金处理5 min，于电压3 kV 下，放大2 000 倍和5 000 倍，观测样品颗粒形貌。
1.3.9 傅里叶红外光谱扫描 参考Liu 等[20]的方法并作部分修改。使用傅里叶红外光谱检测（FTIR）大黄米淀粉及其多孔淀粉的结构。称取1 mg干样品与100 mg KBr 在紫外灯下充分混合，研磨，真空压片1 min。扣除溴化钾薄片的背景，于4 000～400 cm-1 波数范围扫描64 次，得到大黄米淀粉及其多孔淀粉红外光谱图。
1.3.10 比表面积及孔容孔径分析 参考Guo等[21]方法测定。将样品在100 ℃真空脱气、脱水12 h 后，在液氮温度（77.35 K）下，通入高纯N2，对淀粉样品进行吸附测定。
1.3.11 黏度特性分析 称取3 g 淀粉样品于RVA 铝罐中，加入25 mL 蒸馏水，在960 r/min 下搅匀形成淀粉悬浮液。将样品在50 ℃下保持1 min，然后加热至95 ℃，保温5 min，随后将样品冷却至50 ℃，保持4 min，得到淀粉糊化特性结果。
1.4 数据处理
所得数据采用SPSS Statistics 25 进行显著性分析，用Origin 2017 作图，用Design Expert 10.0.1进行响应面优化处理。
2 结果与分析
2.1 单因素实验结果及分析
由图1a 可知，吸油率随着双酶配比的改变先升高后降低，于双酶配比1∶4 时达到最大值，表明此条件下双酶的协同效应最佳。α-淀粉酶随机内切α-1，4 键产生的非还原末端为糖化酶提供新的作用位点，糖化酶也能降低α-淀粉酶水解产物在水解过程中所带来的阻碍[22]。二者产生的协同作用使水解连续性地沿着淀粉双螺旋结构向内部不断深入，因此双酶配比在1∶4 为宜。
图1 不同工艺条件对大黄米多孔淀粉吸油率的影响
Fig.1 Effect of different technological conditions on oil absorption rate of porous starch of proso millet starch
注：不同小写字母代表差异显著（P＜0.05），下同。
由图1b 可知，吸油率随酶添加量的增加先升高后降低，于1.0%时达到最大值。这是由于在酶浓度较低时，淀粉与酶结合不充分，形成孔洞较小，孔隙较浅[23]。而酶用量超过1.0%时，淀粉的过度水解使小孔融合为大孔，部分形成中空结构的多孔淀粉裂解，吸油率下降，并且过量的酶会因找不到结合位点，未与淀粉结合而造成浪费。酶添加量在1.0%为宜。
由图1c 可知，吸油率随pH 值的增加先升高后降低，于pH 4.5 时达到最大值。pH 的变化影响酶活性以及多孔淀粉的电荷特性，酶活性不同对淀粉结构的影响也不同，多孔淀粉电荷特性的改变影响其吸附能力[24]。酶解pH 4.5 为宜。
因多孔淀粉是在亚糊化温度下水解制备的，而大黄米淀粉的糊化温度为77 ℃左右[25-26]，故酶解温度范围在40～60 ℃之间。由图1d 可知，随着温度的升高，吸油率出现明显增加，于55 ℃达到最大值。这是由于温度与酶反应速率、淀粉的溶胀有关[27]。随着温度的升高，酶反应速度加快，淀粉吸水溶胀，有利于酶向淀粉内部逐渐渗入，促进水解作用。当温度超过55 ℃时淀粉趋于糊化，酶因高温而失活。酶解温度在55 ℃为宜。
由图1e 可知，吸油率随酶解时间的增加先升高后降低，于14 h 达最大值。在水解的最初阶段，因淀粉内部构造紧密，故水解十分缓慢，部分颗粒还未形成孔结构，截留油脂的能力较低。随着水解的进行，淀粉结构逐渐松散，酶对淀粉水解更加充分，淀粉颗粒表面孔洞及凹坑的数量增加，内部中空结构扩大。然而，时间过长会导致酶解过度，吸附能力下降[28]。酶解时间在14 h 为宜。
2.2 响应面优化试验结果
2.2.1 Box-Behnken 试验设计及结果 在单因素实验基础上，选取影响吸油率较为显著的复合酶添加量（A）、酶解温度（B）、酶解pH（C）和复合酶配比（D），根据Box-Behnken 设计原理设计得到29 组响应面试验，试验设计及结果见表2。
表2 响应面试验设计及结果
Table 2 Response surface test design and results
2.2.2 模型回归方程拟合及方差分析 通过Design Expert 软件对表2 试验结果进行多元二次回归拟合，建立回归模型，得到大黄米多孔淀粉吸油率与各因素变量的二次方程模型：Y=173.87+6.91A+2.15B+0.44C+2.68D+2.46AB+5.30AC-2.88AD+1.49BC-4.37BD+1.07CD-7.48A2-10.96B2-10.26C2-4.84D2
从表3 方差分析结果可看出，该回归模型极显著（P＜0.0001），失拟项不显著（P=0.3541＞0.05）。模型的R2=0.9801，R2adj=0.9602，表明试验误差小，模型拟合度较好，说明以此模型预测试验结果十分可靠，与实际情况相符。模型中的一次项C 和交互项BC、CD 为不显著（P＞0.05），其它参数均显著。根据F 值大小可得出各因素影响吸油率的主次顺序为：复合酶添加量（A）＞酶解时间（D）＞酶解温度（B）＞酶解pH（C）。
表3 模型回归方程方差分析
Table 3 Analysis of variance of regression model
注：***.P<0.001，极显著；**.P<0.01，高度显著；*.P<0.05，显著。
2.2.3 大黄米多孔淀粉制备各因素交互作用及分析 三维响应面的曲面越陡，二维等高线图越趋于椭圆形，且排线越密集，说明各因素及因素间交互作用对吸油率影响越大[29-30]。由图2a，2c，2e，2g所示，沿A 因素轴向的曲面较其它轴向曲面陡峭，说明复合酶添加量对吸油率的影响最显著。由图3b，2d，2f，2h 可知，等高线均呈椭圆形，说明复合酶添加量与酶解pH、酶解时间、酶解温度，酶解时间与酶解温度两因素间交互作用显著，其它因素的交互作用不明显，与表3 结果一致。
图2 因素交互作用的曲面图及等高线图
Fig.2 Surface and contour map of interactive effects of different factors
图3 大黄米淀粉及多孔淀粉的粒度分布
Fig.3 Particle size distribution of proso millet starch and porous starch
2.2.4 验证试验 采用Design-Expert 10.0.7 分析方程模型。考虑到降低能耗、操作便利，将拟合所得最佳工艺条件修正为：复合酶添加量1.2%，酶解温度56 ℃，酶解时间14 h，酶解pH 4.6，复合酶配比1∶4。在此条件下做3 次平行验证试验，测出吸油率为（174.00±2.00）%，与预测最大吸油率176.022%基本相符，且远高于原淀粉（原淀粉吸油率为88%），表明此回归模型用于预测大黄米多孔淀粉制备工艺有效、可靠。
2.3 结构表征
2.3.1 粒径分布 由仪器自动分析得到表4 参数。
表4 大黄米淀粉及多孔淀粉的粒度分布
Table 4 Particle size distribution of proso millet starch and porous starch
注：D10：颗粒累积分布为10%的粒径；D50：中位径；D90：颗粒累积分布为90%的粒径；D[4，3]：体积平均粒径；D[3，2]：表面积平均粒径；同一列的不同的小写字母表示之间存在显著性差异，P＜0.05。
粒度分布是表征淀粉颗粒尺寸的重要标准。由图3 可知，大黄米淀粉颗粒粒度分布范围在1～14 μm，较其它淀粉小，因此其本身聚合、吸附及化学反应的活性较大[31]。大黄米淀粉呈现3 个主峰的颗粒分布，经复合酶水解后，分布更为集中，稍向较低粒径范围转移，7～14 μm 处的峰值降低，1～7 μm 处的峰值增高，说明复合酶的酶解作用使淀粉颗粒均一性明显提高[32]。根据仪器自动分析表4 结果，D10、D50、D90 代表粒度分布情况，D[4，3]、D[3，2]代表淀粉颗粒的大小[33]。由表4 可知，在形成多孔淀粉后粒径分布发生明显改变，上述数值均减小，这是由于酶解使淀粉颗粒表面形成凹陷、孔洞及孔隙，也有部分淀粉颗粒因水解过度崩解而变成小颗粒碎片，粒径有所下降。
2.3.2 X-射线衍射分析结果 大黄米淀粉及其多孔淀粉的X 射线衍射结果如图4 所示，二者均在15°，17°，18°，23°处出现4 个主峰，为典型的谷物类A 型结晶结构，说明复合酶的水解作用对淀粉的晶型无影响。多孔淀粉出现比天然淀粉更强且尖锐的吸收峰，相对结晶度由（23.43±0.45）%增至（26.34±0.69）%。这主要是由于淀粉颗粒结晶少、密度小的无规则部分及无定形区经酶作用后出现大范围水解，结晶区比例升高，分子排列的有序性增强[34]，而未被水解部分彼此缔合形成多孔淀粉[35]。
图4 大黄米淀粉及其多孔淀粉的X-射线衍射图
Fig.4 X-ray diffraction pattern of proso millet starch and porous starch
2.3.3 扫描电镜颗粒形貌分析结果 大黄米淀粉及其多孔淀粉的微观颗粒形貌如图5 所示。大黄米淀粉表面相对光滑，大多呈多角形且伴有凹陷，部分颗粒表面有小孔，凹陷及小孔的存在可为酶分子提供接触位点，使复合酶分子更易渗入颗粒内部进行水解。经复合酶水解后，淀粉颗粒表面变得十分粗糙，存在由颗粒表面至内部延伸的孔洞及圆形凹陷，且分布不均匀，透过孔洞可看到淀粉颗粒的同心环层结构及内部的空腔结构，而颗粒形状几乎未发生改变，说明制得大黄米多孔淀粉。复合酶对淀粉的水解从淀粉颗粒不规则表面开始，从小孔渗入，糖化酶的外切活性能够增加孔深，α-淀粉酶的内切活性能够增加孔宽[36]，使水解连续由外至内径进入淀粉分子内部，孔洞逐渐增多，孔径增大，然后在中心附近熔融，再从中心向外水解，形成中空结构[37]。
图5 大黄米淀粉及其多孔淀粉的SEM 图
Fig.5 Scanning electron micrographs of proso millet starch and porous starch
2.3.4 傅里叶红外光谱分析结果 对于傅里叶红外光谱而言，1 047 cm-1 和1 022 cm-1 处的红外吸收峰分别代表淀粉颗粒中结晶区和无定形区，995 cm-1 与C-6 处羟基的分子内氢键有关，（1 047/1 022）cm-1 和（1 022/995）cm-1 的峰强度比值代表淀粉颗粒的短程有序结构[38-39]。由图6 红外光谱结果可知，大黄米淀粉与大黄米多孔淀粉的光谱图基本一致，特征吸收峰位置未发生变化，说明酶解过程并未改变淀粉的基本化学键组成，也未产生新的基团。而峰强度明显增加，于3 400 cm-1（O-H键的伸缩振动），2 931 cm-1（C-H 键的伸缩振动），1 640 cm-1（H2O 的弯曲振动）处较明显，峰值强度的增加与淀粉颗粒被水解后亲水亲脂基团暴露有关[40]，使大黄米多孔淀粉吸附能力增强。大黄米淀粉在形成多孔淀粉后（1 047/1 022）cm-1 比值由1.668 增到2.413，（1 022/995）cm-1 比值由0.626降到0.255，表明淀粉分子间氢键数量增加，促进淀粉分子螺旋结构的堆积和缠绕，使淀粉颗粒内部有序性更高，这与XRD 所得相对结晶度变化结果一致[41]。
图6 大黄米淀粉及其多孔淀粉的FT-IR 光谱图
Fig.6 FT-IR spectra of proso millet starch and porous starch
2.3.5 比表面积及孔容孔径分析 根据IUPAC分类方法，如图7a 和7c 所示的两个样品的吸脱附等温线均是II 型，吸附和脱附等温线并未重合，出现H3 型回滞环，这是多层吸附的介孔淀粉质原料的特征[42]。在同等条件下，大黄米多孔淀粉的吸-脱附等温线在大黄米淀粉上方，N2 吸附量更高，并随p/po 的增加不断缓慢上升，淀粉颗粒内孔洞及外表面对N2 由单分子层吸附转变为多层吸附，在p/po 接近1 时急剧升高，发生毛细凝聚现象，说明大黄米淀粉经酶解已形成粗糙的多孔结构[43]。由图7b 和7d 孔径分布结果及表5 结果可知，原淀粉及多孔淀粉的孔径均分布在2～50 nm间，曲线趋势基本相同，而多孔淀粉的介孔分布范围明显较高，这说明大黄米淀粉本身虽含有孔洞，但孔径较小，在酶解处理后孔洞增加且变大。平均孔径由4.143 nm 增至6.637 nm，比表面积由13.90 m2/g 增至29.42 m2/g，总孔容明显增加，意味着大黄米多孔淀粉承载物质的量更多，与吸油率增加有关，这与电镜结果中呈现的多孔及粗糙的多孔淀粉颗粒的表观形态一致。
图7 大黄米淀粉及其多孔淀粉的氮气吸-脱附等温线及孔径分布图
Fig.7 The nitrogen adsorption and desorption isotherms of proso millet starch and porous starch
表5 大黄米淀粉及其多孔淀粉的比表面积和孔结构参数
Table 5 Surface area and pore structure parameters for proso millet starch and porous starch
2.3.6 黏度特性 由表6 可知，与原淀粉相比，多孔淀粉的黏度相关参数、崩解值、回生值均降低，糊化温度升高。崩解值与淀粉颗粒稳定性有关，崩解值降低，说明多孔淀粉在加热过程中抗剪切性能增强。Benavent-Gil 等[7]研究表明，孔径大小及水结合力与峰值黏度呈负相关，多孔淀粉峰值黏度降低，说明酶解使淀粉分子链长变短，形成疏松的多孔凹坑结构，有利于水分渗透，使淀粉膨胀糊化能力增加。
表6 大黄米淀粉及其多孔淀粉的黏度特性
Table 6 Pasting parameters of proso millet starch and porous starch
3 结论
复合酶法制备大黄米多孔淀粉的最优工艺：复合酶添加量1.2%，酶解温度56 ℃，酶解时间14 h，酶解pH 4.6，复合酶配比1∶4。在此条件下的吸油率为（174.00±2.00）%。大黄米淀粉经复合酶作用后结构发生明显改变。形成多孔淀粉后，比表面积及孔容孔径明显增加，淀粉颗粒表面粗糙形成凹坑、多孔结构，峰值黏度、崩解值降低，糊化温度升高，粒径稍有减小。复合酶的水解作用并未改变大黄米淀粉的A 型结晶结构和化学结构，相对结晶度由（23.43±0.45）%增至（26.34±0.69）%，淀粉颗粒内部有序度提高。从大黄米多孔淀粉的高吸附能力也可以看出，大黄米淀粉可作为制备多孔淀粉的一种非常有前景的优质原料。
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