南美白对虾（Penaeus vannamei）属对虾科、滨对虾属，原产于南美太平洋沿岸水域。上世纪90年代初期，南美白对虾实现了人工繁殖，并成为中国虾类养殖的主要对象[1]。目前，南美白对虾在我国福建、海南、山东等地已有大规模的养殖，因味道鲜美、经济效益高且营养价值丰富而深受人们的喜爱。然而，南美白对虾在养殖水域环境中易受水体微生物的富集；同时其自身水分含量高、组织脆弱等因素导致其在捕捞、运输、加工及贮藏过程中极易造成微生物污染[2-3]。研究表明，微生物活动可直接影响水产品的货架期，同时微生物代谢产生的一些物质，如挥发性盐基氮严重影响水产食品等感官品质[4-6]。研究发现，冷藏能有效延长南美白对虾的货架期至4 d，然而，其色差和质构等品质发生明显的下降趋势[7]。邓文静等[8]通过复合生物保鲜剂较好地抑制了南美白对虾的腐败变质，然而复合生物保鲜剂的投资成本较高。采用适当的杀菌保鲜方式来保证南美白对虾的安全性并延缓其货架期，成为亟待解决的问题。
光动力技术（Photodynamic technology，NTPT）作为一种新型非热杀菌技术，因具有高效、低成本、可重复、易于维护、安全和环境友好等特点，在食品保鲜领域展现出巨大的应用前景[9]。光动力技术的原理是利用光敏剂、氧气和可见光之间的相互作用，产生活性氧物质，以灭活食品中有害微生物[10]。在有氧条件下，光敏剂暴露于可见光后，可在微生物细胞内累积大量的活性氧物质；活性氧物质通过破坏其生物靶分子的结构，引起有害微生物细胞的损伤，甚至死亡，而达到抗菌目的[11]。
姜黄素（Curcumin）是从姜黄中分离出的天然多酚类物质。其作为一种天然的食品添加剂，已被WHO、美国药品管理局（Food and Drug Administration，FDA）和我国批准使用。其具有毒性低、代谢快且靶向性强等特点，是极具开发潜力的天然食品级光敏剂。研究表明，姜黄素具有抗氧化、抗炎、抗凝血、抗肿瘤、抗衰老等功效[12-15]。同时，姜黄素本身具有一定的杀菌功效，被作为食品添加剂应用于食品加工领域，在食品微生物控制领域具有广泛的应用前景[16-17]。
目前，光动力技术在水产及鲜切水果的保鲜方面已有相关应用。如Hu 等[18]以50 mmol/L 姜黄素结合15 min 光照对即食海蜇进行微生物灭活，结果表明光动力技术更好地维持了即食海蜇的感官品质，且在4 ℃条件下有效延长了即食海蜇的贮藏期。Tao 等[19]采用光动力技术研究4 ℃贮藏条件对鲜切富士苹果品质的影响，结果表明：光动力处理降低了苹果片表面大肠杆菌的数量，其菌落总数降低了0.95 对数值。Lin 等[20]探讨了光动力技术对鲜切哈密瓜保鲜效果的影响；结果表明：光动力作用降低了鲜切哈密瓜表面的微生物，杀菌后菌落总数降低了1.8 lg（CFU/g）；此外，光动力作用维持了鲜切哈密瓜的感官品质和理化特性。曹斌斌等[21]采用姜黄素介导的光动力探究牡蛎中细菌的灭活效果，结果表明：相较于空白组，光动力处理后牡蛎的杀菌率在90%以上。
本文将姜黄素介导的光动力技术应用于南美白对虾的保鲜，以菌落总数和理化特征为评价指标，在姜黄素浓度、喷晒时间及光照时间单因素实验的基础上做正交试验设计，优化光动力减菌工艺条件。对4 ℃贮藏8 d 内光动力处理前、后的南美白对虾的挥发性盐基氮、硫代巴比妥酸、质构、色泽和含水量等理化指标进行分析，探究姜黄素介导的光动力处理对南美白对虾的保鲜作用。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
生鲜南美白对虾，福州大润发超市。
95%姜黄素，梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；氯化钾、硫代巴比妥酸、硼酸，国药集团化学试剂有限公司；三氯乙酸、75%生理盐水，北京索莱宝科技有限公司。
1.2 主要仪器与设备
PB-10 型pH 酸度计，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；425 nm LED 灯，北京卓立汉光仪器有限公司；CM-5 型色差仪，日本柯尼卡美能达；EZ-test 型质构分析仪，日本岛津有限公司；UV-1100 紫外分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；SCIENTZ-09 型无菌均质器，宁波新芝生物科技股份有限公司；Legend Micro17R 冷冻高速离心机，赛默飞世尔科技（中国）有限公司。
1.3 方法
1.3.1 原材料处理和光动力技术 将体质量约20 g 的新鲜南美白对虾去除虾体表面的水分，使用无菌培养皿对南美白对虾进行单体包装，并用无菌袋进行二次包装，置4 ℃冰箱保鲜，备用。
光动力处理流程：1）在样品上喷晒一定质量浓度的姜黄素溶液；2）在无菌环境下避光孵育样品；3）使用波长为425 nm 的LED 灯对样品进行光照；4）通过菌落总数计算验证（是否达到光动力杀菌效果）。
1.3.2 单因素实验
1）光敏剂质量浓度的选择 分别用0，10，20，30，40 mg/L 姜黄素溶液喷晒对虾表面，并在黑暗条件下孵育20 min，于LED 灯下光照30 min。
2）孵育时间的选择 用30 mg/L 姜黄素溶液喷晒对虾表面，并在黑暗条件下孵育0，10，20，30，40 min，于LED 灯下光照30 min。
3）光照时间选择 用30 mg/L 姜黄素溶液喷晒对虾后，在黑暗条件下孵育30 min，分别用LED 灯光照0，10，20，30，40 min。
1.3.3 正交试验设计 选取姜黄素质量浓度、孵育时间及光照时间3 个因素为考察变量，以菌落总数为评价指标设计正交试验，以优化光动力减菌工艺。做L9（33）正交试验设计，见表1。测定姜黄素光动力后各组对虾的菌落总数，每组试验重复3 次。
表1 最优组合的L9（33）正交试验设计
Table 1 L9（33）orthogonal test design for the optimal combination
1.3.4 细菌菌落平板计数 参照GB 4789.1-2016 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 总则》进行细菌菌落平板计数。试验重复3 次，取平均值。
式中，N——对照组的平均菌落数；n——试验组的平均菌落数。
1.3.5 挥发性盐基氮（TVBN）含量的测定 参考张沛玲等[22]的处理方法，检测光动力处理前、后南美白对虾挥发性盐基氮的情况。
精确称取不同处理条件、不同贮藏时间的南美白对虾各5.00 g，去壳、搅碎，装于无菌均质袋中。加入10 mL 无菌水，高速均质2 min，于4 ℃静置20 min，过滤虾肉，吸取5.0 mL 上清液于100 mL 容量瓶中，备用。用乙酰丙酮-甲醛分光光度计法测定南美白对虾中的挥发性盐基氮含量。每个样品分别测定3 次，取其平均值，记录。
式中，X——样品挥发性盐基氮含量（mg/100 g）；A——待测样中挥发性盐基氮含量（μg）；m——样品质量（g）；V——待测样体积（mL）。
1.3.6 硫代巴比妥酸（TBA）含量的测定 精确称取不同贮藏时间，经光动力处理前、后的5.00 g 南美白对虾，去壳、搅碎，加入20 mL 蒸馏水搅拌，混合均匀，加2 mL 盐酸溶液及2 mL 液体石蜡，采用水蒸气蒸馏，收集50 mL 蒸馏液。取5 mL 蒸馏液，与5 mL TBA 醋酸溶液充分混合，沸水浴加热30 min 后冷却10 min，以蒸馏水为空白样，在波长535 nm 测其吸光度A。每个样品分别测定3 次，取其平均值记录。
1.3.7 质构（TPA）的测定 参照徐南[23]的处理方法，取不同贮藏时间，经光动力处理前、后的南美白对虾的第2 腹节，用二次挤压质构分析方法（TPA）测定南美白对虾的硬度、弹性。
质构仪：P5 探头（直径5 mm），测试前速度2.00 mm/s，测试时速度1.00 mm/s，起始力度0.6 N，形变量30%，上升高度5 mm，测试时间3 s。每个样品分别测定3 次，取其平均值，记录。
1.3.8 含水量的测定 精确称取不同贮藏时间，经光动力处理前、后的5.00 g 南美白对虾，去壳、搅碎，置于水分测定仪中，测定含水量。每个样品测定3 次，取其平均值，记录。
1.3.9 色差的测定 精确称取不同贮藏时间，经光动力处理前、后的南美白对虾，置于手持式色差仪中测定其L*、a*和b*值。每个样品测定3 次，取其平均值，记录。
1.3.10 pH 值的测定 精确称取不同贮藏时间，经光动力处理前、后的5.00 g 南美白对虾，去壳、搅碎，置于烧杯中，加入10 mL 无菌水，高速均质2 min，于4 ℃喷晒10 min，过滤虾肉后用PB-10酸度计测定滤液的pH 值。每个样品测定3 次，取其平均值，记录。
1.4 数据统计与分析
所有试验结果均测定3 次，表示为平均值±标准差。采用GraphPad Prism 6 软件对单因素实验进行显著性差异性分析，并绘制相关图表；运用SPSS（Statistical Product and Service Solutions）数据处理系统（IBM SPSS Statistics 24.0）对试验数据进行统计分析，显著性差异水平选取P<0.05。
2 结果与分析
2.1 单因素实验结果
如图1a 所示，随着贮藏时间的增加，对虾的菌落总数呈上升趋势；姜黄素浓度增加可显著降低虾肉的微生物（P<0.05）。贮藏8 d 时，无姜黄素处理的对虾的菌落总数上升（1.85 ± 0.877）lg（CFU/g）；经30 mg/L 姜黄素处理的菌落总数上升（1.29±0.028）lg（CFU/g）。图1a 表明姜黄素处理减缓了贮藏过程中微生物的生长。如图1b 所示，随着贮藏时间的增加，对虾的菌落总数呈上升趋势；孵育时间增加可显著降低虾体内的微生物（P<0.05）。贮藏8 d 时，孵育0 min 处理的对虾菌落总数为4.61 lg（CFU/g）；经30 mg/L 姜黄素孵育40 min 处理的对虾菌落总数下降（0.94 ± 0.123）lg（CFU/g）。如图1c 所示，随着贮藏时间的增加，对虾的菌落总数呈上升趋势；光照时间增加可显著降低虾体内的微生物数量（P<0.05）。贮藏8 d时，光照0 min 处理的对虾菌落总数上升（1.35 ±0.017）lg（CFU/g）；相较于第8 天光照0 min 处理组，经30 min 光照处理的对虾的菌落总数下降（0.48±0.017）lg（CFU/g）。由单因素试验可知，光动力处理降低了对虾中的微生物菌落总数。
图1 不同条件对南美白对虾的抑菌效果
Fig.1 Effects of different conditions on the antibacterial activity of Penaeus vannamei
2.2 正交试验结果
为进一步优化光动力灭活对虾中微生物的杀菌工艺条件，选取姜黄素质量浓度（20，30，40 mg/L）、孵育时间（20，30，40 min）、光照时间（20，30，40 min）3 个因素进行正交试验设计（如表2）。R 值表明由姜黄素介导的光动力技术灭活对虾中细菌，主次因素是：孵育时间（B）＞姜黄素质量浓度（A）＞光照时间（C）。通过比较各因素的k 值大小，确定其较优水平组合为A2B3C3，即30 mg/L 姜黄素，40 min 孵育，40 min 光照。经试验测定，以30 mg/L 姜黄素结合40 min 孵育，并光照40 min，可灭活（99.9±0.01）%南美白对虾中的细菌。
表2 光动力处理南美白对虾中细菌的L9（33）正交试验结果
Table 2 L9（33）orthogonal test design of NTPT inactivated bacterial in Penaeus vannamei
表3 光动力处理南美白对虾中细菌的正交试验方差分析
Table 3 The variance analysis result of orthogonal test of NTPT inactivated bacterial in Penaeus vannamei
注：R2=0.991（调整后R2=0.965）；* 表示P<0.05。
2.3 对虾中挥发性盐基氮和硫代巴比妥酸的含量
总挥发性盐基氮（Total volatile basic nitrogen，TVBN）是用于评价水产品品质的新鲜度指标，当食品发生腐败时，由体内微生物繁殖产生的胞外酶和肉质中的内源性蛋白酶作用会引起含氮化合物的降解，如三甲胺、二甲胺等这类含氮物质[24]。研究表明，当水产食品的TVBN 值超过30 mg/100 g 时，表示该水产品已腐败且达到不可食用状态[25]。由图2a 所示，在贮藏过程中对照组和NTPT 组中TVBN 值均呈上升趋势，且对照组TVBN 的每日增量显著高于NTPT 组。第8 天时，对照组的TVBN 值达到（34.23±0.81）mg/100 g，达到不可食用状态，而NTPT 组的TVBN 值为（25.40±0.80）mg/100 g，说明光动力处理显著减缓南美对虾的腐败。硫代巴比妥酸（Thiobarbituricacid，TBA）是评价油脂氧化程度的指标之一。从图2b 可知，随着贮藏时间的增加，对照组与NTPT组虾肉的TBA 值均呈上升趋势，而对照组虾肉的TBA 值增加速率高于NTPT 组。其原因可能为姜黄素具有抗氧化性，短时间的光照射减弱了脂质的过度氧化[26-27]。
图2 不同处理条件下对虾挥发性盐基氮和巴比妥酸含量的变化
Fig.2 The changes of different treatment on total volatile basic nitrogen and thiobarbituric acid value of Penaeus vannamei
注：**** 表示P<0.0001；*** 表示P<0.0005。
2.4 光动力处理对虾肉质构特性的影响
随着贮藏时间的增加，水产品会降解；而微生物作用对水产品的质构特性也有一定的影响[28]。研究表明，微生物作用可导致肌肉组织结构被破坏，肌体变软，质构指标下降，引起食品腐败变质[29-30]。图3 显示不同贮藏时间对虾的硬度、咀嚼性、回弹性和黏性的变化情况。结果表明，相较于对照组，贮藏期间光动力组中对虾的硬度、咀嚼性、回弹性和咀嚼性的下降较少。贮藏4 d 时，NTPT 组硬度和咀嚼性分别为（579.26 ± 25.34）g和416.92±15.28，对照组的硬度和咀嚼性分别为（508.93±28.18）g 和381.39±7.78，二者存在显著性差异（P<0.05）。此外，贮藏6 d 时，NTPT 组回弹力为0.27±0.005，对照组的回弹力为0.24±0.005，具有显著性差异（P<0.05）。从TVBN（图2a）的变化趋势可以看出对照组对虾中挥发性盐基氮含量的上升速度显著高于NTPT 组。对照组对虾第4天时的质构特性显著下降，导致虾体变软；而光动力处理较好地维持了南美白对虾的质构特性，减缓了对虾的腐败变质。
图3 不同处理条件下对虾质构的变化
Fig.3 The changes of different treatment on texture of Penaeus vannamei
注：* 表示P<0.05，** 表示P<0.01。
2.5 光动力处理对虾肉含水量的影响
4 ℃贮藏环境以及微生物的生长是影响虾肉含水量的关键因素[31-32]。由图4 可知，随着贮藏时间的增加，虾肉的含水量均降低。贮藏4 d 时，对照组的含水量下降5.40%，NTPT 组含水量下降2.43%。NTPT 组在各贮藏时间的含水量均高于对照组。其原因可能是光动力处理可以较好地维持虾肉的持水性，保持肌肉组织的紧密性[33]。
图4 不同处理条件下对虾含水量的变化情况
Fig.4 The change of different treatment on water content of Penaeus vannamei
注：*** 表示P<0.0005。
2.6 光动力处理对虾肉色泽的影响
色泽是衡量食品新鲜程度的指标之一，直接影响消费者对食品的接受度和消费力。图5 显示不同姜黄素浓度处理后对虾外观的变化情况。不同浓度的姜黄素不影响同一批处理组中对虾的色泽变化。
图5 不同质量浓度姜黄素对对虾外观的影响
Fig.5 Effect of different curcumin mass concentrations on the appearance of Penaeus vannamei
注：1、2 均为同一批对虾样品在不同质量浓度姜黄素处理下外观的变化情况。
采用色差仪评价不同处理条件对南美白对虾亮度值（L*）、红度值（a*）和黄度值（b*）的影响。如表4 所示，随着贮藏时间的增加，L*值逐渐增加。这可能是因为对虾捕捞后经冰水处理引起虾体持水性下降，进而增大了虾体表面游离水的含量，以及南美白对虾对光的反射作用[23]。与对照组相比，经光动力处理组的b*值变化较小；贮藏6 d 后，对虾表面出现黑变现象。这可能与对虾贮藏过程中微生物的生长以及对虾中营养物质的氧化有关。
表4 不同处理条件对南美白对虾色差的影响
Table 4 Effect of different treatment on the color of Penaeus vannamei
注：a、b、c 表示同一列处理样本间存在显著性差异（P<0.05）。
2.7 光动力处理对虾肉pH 值的影响
对虾死后会发生一系列的生化反应，虾体内糖类逐渐降解生成酸类物质，使虾肉pH 值在贮藏前期出现下降趋势；由于微生物的作用，虾体内蛋白质被分解成氨、二甲胺、三甲胺等物质，使虾肉的pH 值在贮藏中、后期逐渐升高[34]。如图6 所示，NTPT 组与对照组虾肉的pH 值变化趋势相同，贮藏前2 d 虾肉的pH 值短暂下降，随后逐渐升高。各时段NPTP 组虾肉的pH 值均显著低于对照组，其原因可能是光动力处理降低了虾体内的微生物，从而减缓虾肉在贮藏过程中的腐败速率，较好地保持虾肉的新鲜度。
图6 不同处理条件对南美白对虾酸碱度的影响
Fig.6 Effect of different treatment on pH of Penaeus vannamei
注：**** 表示P<0.0001。
3 结论
采用姜黄素介导的光动力技术对南美白对虾进行非热杀菌后保鲜处理，与无处理的4 ℃保鲜组作比较，研究两种处理方式对南美白对虾保鲜过程中菌落总数和理化指标的影响。得出试验结论如下：在南美白对虾表面喷洒30 mg/L 姜黄素避光孵育40 min，采用LED 光照射40 min 的控菌效果明显，可灭活南美白对虾体中99.99%的细菌。此外，光动力技术较好地保持了南美白对虾虾肉的含水量、pH 值和色泽等理化特性，能够杀灭对虾表面微生物，并抑制虾体中微生物的生长，从而减缓虾肉贮藏过程中的腐败速率，较好地保持南美白对虾的新鲜度。该方法可应用于生鲜南美白对虾的保鲜。然而，光动力作用在改善南美白对虾的黑变方面还需要进一步研究。
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