脐橙 【Citrus sinensis（L.）Osbeck.var.brasliliensis Tanaka】属芸香科（Rutaceae Juss.）柑橘属（Citrus L.），是中国南方的特色水果，主要种植于重庆、湖北、江西、福建等地[1-2]。脐橙果实肉质脆嫩多汁，酸甜适口，风味浓郁，且富含多种维生素，具有较高的经济和食用价值，是品质最佳、销售最广的鲜食柑桔品类[2]。脐橙是非呼吸跃变型水果，主要成熟于11～12 月，果实易发生衰老、脱水、失重、果皮损伤和收缩、果肉质地变化以及风味下降等症状，这是采后脐橙果实经济损失的主要原因[3-4]。目前，国内外脐橙贮藏保鲜技术主要为化学试剂保鲜和冷藏保鲜[1，3]，然而，化学保鲜剂的使用可能造成脐橙果实表面化学残留，而冷藏保鲜会大大增加脐橙果实保鲜成本。因此，亟需发展一种高效、方便、低成本和绿色环保的保鲜技术，以提高采后脐橙果实耐贮性。
研究发现，果实采后耐贮性与活性氧（ROS）代谢密切相关[5-7]，果实耐贮性下降的同时伴随着细胞膜透性的增加。病原菌侵染[6]、能量亏缺[8]等会使采后果实活性氧清除能力下降，导致超氧阴离子自由基（O2-·）、过氧化氢（H2O2）等ROS 和膜脂过氧化产物丙二醛（MDA）在细胞内过量积累，最终使采后果实活性氧代谢失调。同时，活性氧代谢失调又会导致其细胞内的ROS 大量产生，造成细胞膜的结构和功能受损，脂质过氧化，细胞膜完整性被破坏，细胞膜透性增加，最终使采后果实的衰老进程加快，果实耐贮性降低[5-7]。然而，水杨酸、核黄素、1-甲基环丙烯等[9-11]处理可保持采后果实较高的清除ROS 能力，降低ROS 和MDA 的产生与积累，这些有利于减缓采后果实细胞膜膜脂质过氧化，保持细胞膜的完整性，进而提高采后果实耐贮性[5-7]。果实采后耐贮性与ROS 代谢水平密切相关。
壳聚糖具有抗菌、生物可降解和安全的特点[12-14]。前人研究发现，壳聚糖可调节ROS 代谢，增强ROS 清除酶活性，减少ROS 的积累及其对细胞膜的破坏，进而减缓果实衰老，提高采后果实的耐贮性[5-7]。目前，广泛应用于采后果蔬处理的壳聚糖是粉末状的。这种类型的壳聚糖在处理采后果蔬时需预先溶解在酸性溶液中，用碱将溶液pH 值调节到合适的范围，这需要花费较长的时间，不利于采后果蔬的快速处理[5-7]。卡多赞是一种新型的水溶性壳聚糖，无需调节pH 值且用水稀释即可得到所需不同浓度的溶液，使用非常方便。本课题组近年研究发现，卡多赞能有效减缓龙眼[5]、荔枝[6]和西番莲[7]等果实的成熟和衰老，并能有效提高果实耐贮性。这与水溶性壳聚糖能有效维持ROS 代谢平衡而提高龙眼、荔枝和西番莲等果实的ROS清除能力，从而减少ROS 积累有关。然而，目前尚未有关卡多赞（水溶性壳聚糖）对脐橙果实耐贮性影响的研究报道。本研究以“纽荷尔”脐橙为试验材料，研究卡多赞（水溶性壳聚糖）对采后脐橙果实活性氧代谢和细胞膜透性的影响，旨在提高脐橙果实采后耐贮性，延长保鲜期。
1 材料与方法
1.1 试剂与材料
水溶性壳聚糖（卡多赞），上海利统公司；乙二氨四乙酸二钠、抗坏血酸、十二水磷酸氢二钠、盐酸羟胺、对氨基苯磺酸、冰醋酸、三氯乙酸、氮蓝四唑、甲硫氨酸、二硫代硝基苯甲酸、考马斯亮蓝G-250、氯化铁、1-氨基萘、二硫代硝基苯甲酸，上海颖心实验设备有限公司。
供试材料为福建省三明市尤溪县久泰现代农业公司果园种植的“纽荷尔”脐橙（Citrus sinensis（L.）Osbeck.cv.Newhall navel orange），在果实九成熟（外果皮L*值为74±0.18，a*值为19.17±0.53，b* 值为69.76 ± 0.14，h 值为74.63 ± 0.39，颜色指数为3.71±0.11）时采摘，果实采摘后、常温运输到福建农林大学农产品产后技术研究所，挑选形状、大小、成熟度一致的健康果实进行试验。
1.2 设备与仪器
电热恒温水浴锅，北京市永光明医疗仪器厂；3173 型电导率仪，上海电子有限公司；多功能酶标仪，美国Thermo 公司；BSA224S 电子天平，赛多利斯（上海）贸易有限公司；DRX-260 人工气候箱、LFP-800T 型多功能粉碎机，宁波江南仪器厂；GL-20G-II 高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂。
1.3 方法
1.3.1 “纽荷尔”脐橙预处理 本课题组在预试验中采用不同浓度壳聚糖（卡多赞稀释200，400，600，800 倍及1 000 倍）和蒸馏水（对照）浸泡处理“纽荷尔”脐橙果实5 min，晾干后进行包装（每袋6 个果实，每组共60 袋），之后将果实置于相对湿度85%、（18±1）℃（因甜橙集中采收于11～12 月，所以将贮藏甜橙的贮藏温度模拟室温，设定为18℃）下贮藏180 d。在贮藏期的第180 天时，计算脐橙果实商品率分别为25.6%（稀释200 倍），38.9%（稀释400 倍），30%（稀释600 倍），50%（稀释800倍），22.2%（稀释1 000 倍），13.3%（对照组）。可以看出，稀释800 倍卡多赞溶液处理的“纽荷尔”脐橙果实商品率最高。因此，将卡多赞稀释800 倍作为接下来正式试验处理“纽荷尔”脐橙果实时所使用的浓度。
在正式试验中，挑选720 个“纽荷尔”脐橙果实，随机分成两组并进行以下处理：1）浸泡在稀释800 倍的卡多赞溶液中5 min；2）浸泡在蒸馏水（对照组）中5 min。晾干后，用聚乙烯薄膜袋（厚度：0.015 mm）对脐橙果实进行包装（每袋6 个果实，每组共60 袋）。果实包装之后放置在与预试验相同条件下贮藏180 d。贮藏期间，每隔30 d 取10袋（60 个果实）“纽荷尔”脐橙果实，用于测定“纽荷尔”脐橙细胞膜透性和ROS 代谢相关指标。
1.3.2 测定指标和方法
1.3.2.1 细胞膜透性测定 参照Jiang 等[6]的方法，从6 个“纽荷尔”脐橙果实赤道面取30 个直径为5 mm 的脐橙果实圆片、用于测定“纽荷尔”脐橙的细胞膜透性，单位为%。
1.3.2.2 O2-·产生速率测定 参照Lin 等[15]的方法，从6 个“纽荷尔”脐橙果实中取样1 g、用于测定“纽荷尔”脐橙的O2-·产生速率，单位为μmol/（min·kg）。
1.3.2.3 H2O2 含量测定 参照曹建康等[16]和陈莲等[17]的方法，从6 个“纽荷尔”脐橙果实中取样1 g、用于测定“纽荷尔”脐橙的H2O2 含量，单位为mol/kg。
1.3.2.4 MDA 含量测定 参照Lin 等[15]的方法，从6 个“纽荷尔”脐橙果实中取样1 g、用于测定“纽荷尔”脐橙的MDA 含量，单位为mol/kg。
1.3.2.5 ROS 清除酶活性测定 参照Lin 等[15]的方法，从6 个果实中取样1 g，用于测定超氧化物歧化酶（SOD）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）和过氧化氢酶（CAT）活性。参照Bradford[18]的方法，测定酶提取液的可溶性蛋白质含量。以上酶活性单位以U/mg 蛋白表示。
1.3.2.6 内源抗氧化物质含量测定 参照Lin等[15]的方法，从6 个“纽荷尔”脐橙果实中取样1 g，用于测定 “纽荷尔” 脐橙的还原型谷胱甘肽（GSH）和还原型抗坏血酸（AsA）含量，单位为g/kg。
1.3.2.7 还原力和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除能力的测定 参照Lin 等[15]的方法，从6 个“纽荷尔”脐橙果实中取样1 g，用于测定“纽荷尔”脐橙的还原力和DPPH 自由基清除能力，单位分别为g/kg 和%。
1.3.3 数据处理 上述指标都测定3 次，取其平均值。利用21.0 版IBM SPSS Statistics 对数据进行统计分析、显著性差异分析以及相关性分析。
2 结果与分析
2.1 果实外观品质和细胞膜透性
如图1 所示，“纽荷尔” 脐橙果实的外观颜色随着贮藏时间的延长由黄绿色变成橙红色，同时，腐烂的果实数量也不断增加。经过壳聚糖处理的“纽荷尔”脐橙果实外观颜色变化速度较对照组果实慢，且腐烂的果实数量也低于对照组。如在贮藏期第180 天时，对照组有79%的果实发生腐烂，而壳聚糖处理组只有37%的果实发生腐烂，对照组的果实腐烂率是壳聚糖处理组的2.1 倍。
图1 壳聚糖处理对“纽荷尔”脐橙果实贮藏期间外观品质的影响
Fig.1 Effects of chitosan treatment on the fruit appearance quality of 'Newhall' navel oranges during storage
如图2 所示，对照组和壳聚糖处理组的“纽荷尔”脐橙细胞膜透性在采后贮藏30～180 d 内都呈现为上升的趋势。统计分析结果显示，在贮藏60～180 d 内，壳聚糖处理的“纽荷尔”脐橙细胞膜透性都显著（P ＜0.05）低于对照组果实。
图2 壳聚糖处理对‘纽荷尔’脐橙果实贮藏期间细胞膜透性的影响
Fig.2 Effects of chitosan treatment on the cell membrane permeability in 'Newhall' navel oranges during storage
注：*、** 分别表示在相同贮藏时间，壳聚糖处理与对照组处理组的差异显著（P ＜0.05）或极显著（P ＜0.01）。下同。
上述结果表明，壳聚糖处理能有效延缓“纽荷尔”脐橙果实贮藏期间细胞膜透性的增加，同时减缓“纽荷尔”脐橙果实外观颜色变化和降低果实腐烂率。
2.2 果实O2-·产生速率、H2O2 和MDA 含量
“纽荷尔”脐橙果实采后贮藏期间，其O2-·产生速率、H2O2 和MDA 含量随贮藏时间的增加而上升（图3）。与对照组果实相比，壳聚糖处理能有效减缓“纽荷尔”脐橙O2-·产生速率、H2O2 和MDA 含量的上升，并维持在较低水平。其中，壳聚糖处理的“纽荷尔” 脐橙O2-·产生速率在贮藏60～180 d内显著（P ＜0.05）低于对照组果实（图3a）；H2O2 含量在贮藏90～180 d 内显著（P ＜0.05）低于对照组果实（图3b）；MDA 含量在贮藏160～180 d 内显著（P ＜0.05）低于对照组果实（图3c）。
图3 壳聚糖处理对“纽荷尔”脐橙果实贮藏期间O2-·产生速率（a）、过氧化氢含量（b）和丙二醛含量（c）的影响
Fig.3 Effects of chitosan treatment on the O2-· production rate（a）and contents of H2O2（b）and MDA（c）in 'Newhall' navel oranges during storage
上述结果表明，壳聚糖处理能有效减缓“纽荷尔” 脐橙果实贮藏期间O2-·产生速率，减少H2O2和MDA 含量的增加。
2.3 果实SOD、CAT 和APX 活性
如图4a 所示，对照组和壳聚糖处理组的“纽荷尔” 脐橙SOD 活性都在贮藏0～30 d 内增加，在30～180 d 内快速下降。与对照组果实相比，壳聚糖处理的“纽荷尔”脐橙SOD 活性在0～180 d 内都保持较高水平。其中，壳聚糖处理的“纽荷尔”脐橙SOD 活性在贮藏第60 天及贮藏120～180 d 内都显著（P ＜0.05）高于对照组果实。
图4 壳聚糖处理对“纽荷尔”脐橙果实贮藏期间超氧化物岐化酶活性（a）、过氧化氢酶活性（b）和抗环血酸过氧化物酶活性（c）活性的影响
Fig.4 Effects of chitosan treatment on the activities of SOD（a），CAT（b）and APX（c）in 'Newhall' navel oranges during storage
如图4b 所示，对照组和壳聚糖处理组的“纽荷尔”脐橙CAT 活性在贮藏0～120 d 内逐渐上升，而在120～180 d 内快速下降。与对照组果实相比，壳聚糖处理的“纽荷尔”脐橙CAT 活性在贮藏30～180 d 内都处于较高水平，且在贮藏30～90 d 内显著（P ＜0.05）高于对照组果实；在贮藏120～180 d内极显著（P ＜0.01）高于对照组果实。
对照组的“纽荷尔”脐橙APX 活性随贮藏天数的增加而下降（图4c）；而壳聚糖处理的“纽荷尔” 脐橙APX 活性在贮藏0～30 d 内快速上升，在30～180 d 内急剧下降。统计分析结果显示，壳聚糖处理的“纽荷尔”脐橙APX 活性在贮藏30～180 d内都显著（P ＜0.05）高于对照组果实。
上述结果表明，壳聚糖处理能较好维持“纽荷尔” 脐橙果实贮藏期间较高的SOD、CAT、APX 等ROS 清除酶活性。
2.4 果实AsA 和GSH 含量
“纽荷尔”脐橙果实采后贮藏期间，其AsA 和GSH 含量随贮藏时间的增加而下降（图5）。与对照组相比，壳聚糖处理的“纽荷尔”脐橙AsA 和GSH 含量都保持在较高水平。统计分析结果显示，壳聚糖处理的“纽荷尔”脐橙AsA 含量在贮藏第30 天时、贮藏90～180 d 内都显著（P ＜0.05）高于对照组果实（图5a）；壳聚糖处理的GSH 含量在贮藏120～180 d 内极显著（P ＜0.01）高于对照组果实（图5b）。
图5 壳聚糖处理对“纽荷尔”脐橙果实贮藏期间还原型抗坏血酸含量（a）和还原型谷胱甘肽含量（b）的影响
Fig.5 Effects of chitosan treatment on the contents of AsA（a）and GSH（b）in 'Newhall' navel oranges during storage
上述结果表明，壳聚糖处理能有效延缓“纽荷尔”脐橙果实贮藏期间AsA 和GSH 含量的下降。
2.5 果实DPPH 自由基清除能力和还原能力
如图6a 所示，对照组的“纽荷尔”脐橙DPPH自由基清除能力在贮藏0～180 d 内呈现不断下降的趋势；而壳聚糖处理的“纽荷尔”脐橙DPPH 自由基清除能力在贮藏0～30 d 内略有上升，30～180 d 内呈现下降趋势。与对照组果实相比，壳聚糖处理的“纽荷尔”脐橙DPPH 自由基清除能力在贮藏30～180 d 内都保持在较高水平，其中在贮藏90～180 d 内显著（P ＜0.05）高于对照组果实。
图6 壳聚糖处理对“纽荷尔”脐橙果实贮藏期间DPPH 自由基清除能力（a）和还原力（b）含量的影响
Fig.6 Effects of chitosan treatment on the DPPH radical scavenging ability（a）and reducing power（b）in 'Newhall' navel oranges during storage
如图6b 所示，对照组的“纽荷尔”脐橙还原力在贮藏0～150 d 内缓慢地下降，在150～180 d 内快速下降；而壳聚糖处理的“纽荷尔”脐橙还原力在贮藏0～30 d 内快速增加，在30～180 d 内不断地减少。统计分析结果显示，壳聚糖处理的“纽荷尔”脐橙还原力在贮藏30～180 d 内都显著（P ＜0.05）高于对照组果实。
上述结果表明，壳聚糖处理可有效减缓“纽荷尔” 脐橙果实贮藏期间DPPH 自由基清除能力和还原力的下降。
3 讨论
3.1 壳聚糖处理对“纽荷尔”脐橙果实细胞膜透性、ROS 和MDA 含量的影响及其与耐贮性的影响
线粒体是果实中产生ROS（如H2O2 和O2-·等）和自由基的主要部位，ROS 过量积累可引起线粒体蛋白氧化损伤，导致线粒体功能障碍，最终加速果实衰老[19]。正常情况下，果蔬采后ROS 的产生和清除处于平衡状态。采后果蔬成熟或衰老是一种氧化现象，会产生多余的H2O2 和O2-·等ROS，通常果蔬体内的ROS 清除酶会清除H2O2 和O2-·，进而较好地保持细胞膜完整性，减缓MDA 含量（膜脂过氧化程度的标志）的增加，延缓采后果蔬衰老[15，19]。然而，当采后果蔬体内ROS 产生-清除系统失去平衡时，其细胞内的有害ROS 大量积累，破坏细胞膜的结构和功能，导致MDA 含量增加。反之，MDA 增加会进一步破坏膜的完整性，进而加快果蔬的衰老进程，影响果蔬的耐贮性[20-22]。因此，果蔬采后耐贮性与果蔬细胞内的ROS 水平及MDA 含量密切相关。
本研究发现，对照组“纽荷尔”脐橙ROS（O2-·和H2O2）和MDA 含量都随着贮藏时间的延长而增加（图3）。同时，对照组的“纽荷尔”脐橙细胞膜透性在贮藏0～180 d 内也不断地增加（图2），且果实外观品质（图1）不断下降。相关性分析发现，对照组“纽荷尔”脐橙细胞膜透性（图2）分别与O2-·产生速率（图3a）、H2O2 含量（图3b）、MDA 含量（图3c）在贮藏30～180 d 内都呈显著（P ＜0.05）正相关，其r 值分别为0.891，0.954 和0.917。这些结果说明，ROS（O2-·、H2O2）和MDA 含量的增加与“纽荷尔”脐橙细胞膜透性的增加密切相关，即采后“纽荷尔”脐橙中的ROS 不断增加，促进MDA含量的累积，从而破坏“纽荷尔”脐橙的细胞膜结构，导致“纽荷尔”脐橙采后耐贮性下降。
此外，与对照组果实相比，壳聚糖处理能降低“纽荷尔” 脐橙细胞膜透性（图2）、O2-·产生速率（图3a）、H2O2（图3b）和MDA 含量（图3c），较好保持“纽荷尔”脐橙果实的外观品质（图1）。这些结果表明，壳聚糖处理能延缓ROS（O2-·、H2O2）的产生，抑制MDA 含量的积累，减轻细胞膜膜脂过氧化，保持细胞膜结构的完整性，减缓细胞膜透性的增加，从而增强“纽荷尔”脐橙果实采后耐贮性。
3.2 活性氧代谢在壳聚糖增强采后 “纽荷尔”脐橙果实耐贮性中的作用
为了减缓ROS 引起的氧化损伤，保持果实细胞内ROS 的平衡，采后果实形成了复杂的ROS 产生-清除系统，包括ROS 清除酶系统和非酶抗氧化防御系统[23-26]。APX、CAT 和SOD 是主要的ROS清除酶[23-26]。CAT、APX 参与催化H2O2 转换成H2O和O2[19]；SOD 是清除O2-·关键酶，能有效催化O2-·转换成H2O2 和O2[6，20，25]。AsA 和GSH 是非酶清除系统内源抗氧化物质，在清除ROS 反应过程中，AsA 被氧化为单脱氢抗坏血酸盐，再进一步脱氢抗坏血酸盐。脱氢抗坏血酸还原酶以GSH 为底物，催化脱氢抗坏血酸还原为AsA，通过维持适当水平的AsA 保护细胞成分免受氧化应激[6，27-28]。此外，活性氧清除能力常采用还原能力和DPPH 自由基清除能力进行评价[22，26]。前人研究指出，当采后果蔬保持较低的ROS 清除能力时，采后果蔬细胞内的ROS 和MDA 含量大量积累，促进膜脂过氧化，进而加速采后果蔬衰老，降低果蔬耐贮性[23-24，29]。反之，果蔬采后贮藏期间，保持较高的APX、CAT 和SOD 活性、较高的AsA 和GSH 含量及较强的还原能力和DPPH 自由基清除能力，能增强采后果蔬的ROS 清除能力，降低果蔬细胞内ROS 和MDA 含量，有效延缓膜脂过氧化，更好地保持细胞膜的完整性，进而增强采后果蔬的耐贮性[16，20，22，26]。Ma 等[29]研究发现，褪黑素通过提高脐橙果实的ROS 清除酶活性，促进非酶清除系统内源抗氧化物质含量的积累，增强了机体的ROS 清除能力，降低了脐橙果实H2O2 和MDA 含量，进而延缓脐橙果实的衰老。Zhu 等[30]研究发现，一氧化氮（NO）处理能增强脐橙果实的ROS 清除酶活性，降低O2-·和H2O2 含量，从而提高果实耐贮性。因此，采后果蔬的耐贮性与ROS 清除系统密切相关。
本研究发现，对照组的“纽荷尔”脐橙SOD（图4a）和CAT（图4b）分别在贮藏0～30 d 内和0～120 d 内呈现上升趋势，这可能是“纽荷尔”脐橙ROS清除酶对贮藏期间ROS 不断生成而响应的应激反应。然而，随着采后“纽荷尔”脐橙果实衰老和品质劣变，其SOD（图4a）和CAT（图4b）活性下降，导致ROS 清除能力下降、ROS 进一步累积（图3a、3b）；认为在贮藏前期，SOD、CAT 是分别清除“纽荷尔”脐橙O2-·、H2O2 的主要酶。另外，在贮藏期，“纽荷尔”脐橙APX 活性（图4c）、AsA（图5a）和GSH 含量（图5b）不断下降。上述结果说明，采后“纽荷尔”脐橙的ROS 清除能力下降，促进ROS 的产生和MDA 含量的累积，加快膜脂过氧化、破坏细胞膜结构，最终导致“纽荷尔”脐橙果实耐贮性下降。
与对照组对比可知，壳聚糖处理能提高贮藏前中期的“纽荷尔”脐橙SOD（图4a）、CAT（图4b）和APX（图4c）活性，保持贮藏期间较高的SOD（图4a）、CAT（图4b）和APX（图4c）活性、较高的AsA（图5a）和GSH 含量（图5b）、较高的DPPH 自由基清除能力（图6a）和还原力（图6b）及较低的O2-·产生速率（图3a）、H2O2（图3b）和MDA 含量（图3c）、较低的细胞膜透性（图2）。据此认为，壳聚糖处理增强“纽荷尔”脐橙果实耐贮性，与壳聚糖处理维持较高的 “纽荷尔” 脐橙ROS 清除酶（SOD、CAT 及APX）活性、内源抗氧化物质（AsA及GSH）含量和DPPH 自由基清除能力和还原力，从而有效提高“纽荷尔”脐橙ROS 清除能力、减轻其ROS 与MDA 的累积、降低其膜脂过氧化和较好保持其细胞膜结构有关。
4 结论
综上所述，壳聚糖（稀释800 倍的卡多赞）处理能有效维持“纽荷尔”脐橙较高的ROS 清除酶（SOD、CAT、APX）活性、较高的AsA、GSH 含量，较高的还原力和DPPH 自由基的清除能力，从而有效提高ROS 清除能力、降低ROS（O2-·、H2O2）和MDA 的产生和积累，减缓膜脂过氧化和细胞膜透性的增加，较好维持其细胞膜结构，进而减缓“纽荷尔”脐橙果实外观品质劣变进程、增强其果实耐贮性和延长果实保鲜期。
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