茶叶是世界上第二大非酒精饮料，红茶约占全球茶叶产量的78%[1]。红茶属于全发酵茶，具有红茶、红汤、红叶、香甜味醇的特征。贵州是产茶大省，具有“低纬度、高海拔、寡日照、云雾弥漫”的生态优势。在国家的支持下，贵州大力发展农村产业革命，致力于发展茶叶、食用菌等十二大贵州特色产业。贵州的遵义红茶、普安红茶、石阡苔茶是贵州省的优质名茶，均获得原国家质量监督检验检疫总局地理标志。分析贵州茶叶的优良品性，对品牌保护和真伪鉴别具有重要意义。
当下常规的红茶品质评价方式是感官评审或开展基于国标的多项检测项目，存在主观性以及操作繁琐的问题，需探寻一种快速且准确评价茶叶品质的分析方法。非靶向代谢组学是在特定条件下，对指定生物样品的的全部小分子代谢物（＜1 500 u）进行定性、定量检测[2]。核磁共振（NMR）[3]、气相色谱质谱联用（GC-MS）[4]、液相色谱-质谱联用（LC-MS）[5]等方法已被广泛运用于茶叶的非靶向代谢组学研究，以评价气候条件、地理位置、土壤等外界因素导致的不同产地或品种间植物的体内代谢物差异。鉴于四极杆静电场轨道阱（Orbitrap）高分辨质谱具有高选择性、高灵敏度、高质量准确性和对大量化合物进行快速分析的特点[6]，目前国内已有很多Orbitrap 高分辨质谱用于中药材的分析和食品安全检测方面，而食品品质分析上的应用还是偏少。本研究旨在利用UPLC-Q-Orbitrap 高分辨质谱技术分析贵州红茶的成分，简化前处理的步骤，分析贵州3 种红茶间的差异，为茶叶的真伪鉴别提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
从市场采购的70 个贵州红茶样品，包括遵义红茶、普安红茶和石阡苔茶。其中遵义红茶33 个样品，普安红茶25 个样品，石阡苔茶12 个样品。
Milli-Q 超纯水，美国Merck Millipore 公司；甲醇（分析纯级），天津科密欧化学试剂有限公司；甲醇（色谱纯级），德国Merck 公司；甲酸（色谱纯级），上海安谱实验科技股份公司。
1.2 仪器与设备
Q Exactive HF-X 静电场轨道阱高分辨质谱仪，配有Compound Discoverer 3.2 数据处理软件和高效电喷雾离子源（HESI）、Thermo Scientific SII for Xcalibur 液相色谱装置，美国Thermo Fisher Scientific 公司；SK250HP 超声波清洗器，上海科导超声仪器有限公司；Milli-Q Integra115超纯水系统，Merck Millipore 公司；BSM-220.4 电子天平，上海卓精电子科技有限公司；多功能粉碎机，安康市红太阳机电有限公司。
1.3 方法
1.3.1 样品制备 将茶叶磨成粉状，取0.2 g 茶粉放入15 mL 离心管，取70%的甲醇10 mL，在室温下超声（250 W，53 Hz）1 h，之后用0.22 μm 微孔滤膜滤过，取滤液放于2 mL 进样瓶中，用于UPLCQ-Orbitrap/MS 非靶向代谢组学检测。
从每个样品中各取200 μL 液体混合在一起，得到质量控制样本QC 样品[7]（Quality control），在对编写好的序列样品进行检测前，先连续注入QC样品运行5 次以平衡系统，在整个样品的检测过程中，每检测5 个茶叶样品就运行1 次QC 样品，以检测仪器的稳定性。每次运行完QC 样品后，注入一次空白样品，以减少样品检测过程中的残留效应[8]。
1.3.2 色谱条件 色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 RRHD（2.1 mm×150 mm，1.8 μm）；流动相：0.1%甲酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脱（0～2 min，10% B；2～25 min，10%～90%B；25～35 min，90%～10% B；35～40 min，10% B）；柱温：35 ℃，体积流量：0.3 mL/min，进样量：2 μL。
1.3.3 质谱条件 采用Exactive 质谱系统配备的高效电喷雾离子源（HESI），采用正、负离子分别扫描模式，扫描方式采用一级全扫描/数据依赖型二级质谱扫描（Full MS/dd-MS2），一级质谱Full MS的分辨率为60 000，二级质谱dd-MS2 的分辨率为15 000，扫描范围为100～1 500 m/z；离子传输管温度350 ℃，辅助器温度350 ℃，喷雾电压3.2 kV，鞘气流速为12 L/min，辅助气流速为3 L/min，碰撞电压设为阶梯电压，分别为20，40，60 eV。
1.4 数据处理
利用Compound Discoverer3.2 软件对UPLCQ-Orbitrap 检测到的原始数据进行峰对齐、峰提取、过滤、归一化处理等数据预处理。数据处理的参数设为：峰对齐保留时间偏移：2 min、化合物检测质量容许偏差：5×10-6、信噪比（S/N）：3、最小峰信号强度：1 000 000；保留所有QC 样本中相对标准偏差（RSD）小于30%的离子，利用面积归一化法对化合物进行相对定量[9]。将Compound Discover 3.2 得到的数据导入Excel 中，通过后期编辑得到二维矩阵形式的数据，导入SIMCA14.1 软件进行多元统计分析。最后采用MetaboAnalyst 在线软件和Compound Discover 3.2 的Metabolika数据库进行了代谢通路分析。火山图和箱线图由Origin 软件绘制。
2 结果与分析
2.1 方法学验证
本文利用QC 样品对分析方法的稳定性和数据的可靠性进行了检验，在图1 中可看到QC 样品密集的分布在PCA 得分图上，说明QC 样品的重复性较好，系统稳定性高，数据具有可靠性，满足分析要求[10]。
图1 QC 样品的PCA 得分图
Fig.1 PCA score plot of QC sample
注：No class：试验样；1：质控样。
2.2 代谢物鉴定
Orbitrap 高分辨质谱非靶向分析贵州红茶后，将得到的原始数据导入Compound Discoverer 3.2软件进行分析，共得到了2 638 个质谱信号。通过将化合物的准确质量、分子离子峰和碎片离子与Chemspider 和MassList 数据库进行一级谱图库的匹配以及和mzCloud 和mzVault 数据库进行二级谱图的匹配后进行代谢物的定性。利用空白样品去除背景离子后，在与mzCloud 进行匹配鉴定时，按匹配得分应大于80 分筛选代谢物；最终共鉴定得到14 类96 个代谢物。如图2 所示，其中包括黄酮类30 种（黄酮12 种、黄烷酮4 种、黄酮醇4 种、黄酮苷10 种）；氨基酸及其衍生物18 种（L-酪氨酸、L-组氨酸等）、核苷酸及其衍生物7 种（腺苷酸、尿嘧啶等）、酚酸类6 种（没食子酸、咖啡酸等）、有机酸类5 种（曲酸、柠檬酸等）、生物碱5 种（可可碱、甜菜碱等）、其它类5 种（大黄素、12 氧代植物二烯酸等）、杂环化合物4 种（2-吲哚酮、3-羟基-2-甲基吡啶等）、芳烃类4 种（肉桂酸甲酯、鞣花酸等）、木脂素3 种（罗汉松酯素、香豆素等）、脂质3 种（α-桐酸、α-亚麻酸等）、碳水化合物2种（葡萄糖酸、D-葡糖-6-磷酸）、萜类2 种（脱落酸、积雪草酸）、维生素2 种（烟酸、胆碱）。
图2 3 种贵州红茶中总的代谢物
Fig.2 Total metabolites in 3 kinds of Guizhou black tea
2.3 差异代谢物筛选
为研究3 种贵州红茶间的品种差异，将鉴定得到的96 个代谢物进行差异代谢物的筛选，根据差异倍数（Fold change，FC）、变量影响投影（Variable influence on projection，VIP）、P 值 进行筛选，筛选条件有P＜0.05 且|log2FC|＞1、VIP＞1，共得到23 个代谢物在3 种茶叶中存在差异（表1），分别为3 个单体儿茶素类、3 个黄酮类、3 个黄酮醇类、6 个黄酮苷类、4 个有机酸类、3 个生物碱、以及1 个木脂素类化合物。
表1 3 种贵州红茶的23 种差异代谢物
Table 1 23 differential metabolites among three kinds of Guizhou black tea
（续表1）
2.4 3 种贵州红茶的代谢物分布特征分析
如图3 所示，将23 种差异代谢物的的数据信息经预处理后导入SIMCA14.1 进行主成分分析，拟合后得到R2X=0.847＞0.5，则说明方程的拟合性好，以及Q2=0.582，说明方程的预测性也较好。PCA 是一种无监督的分析方法，可以直观的显示样品间的分组和相似性，PCA 得分图中样本间的距离越近则说明代谢物的含量丰度越相似。3 种贵州红茶在PCA 图上被投射为不同形状的小点，3 种红茶基本得到了区分。普安红与石阡苔茶、遵义红区分得较好，说明代谢物的差异较明显。石阡苔茶和遵义红茶有部分重叠的情况，提示2 种茶叶某些样品间的代谢物具有相似性。
图3 3 种贵州红茶基于23 种差异代谢物的PCA 得分图
Fig.3 PCA score chart of three kinds of Guizhou black tea based on 23 differential metabolites
注：1：普安红茶；2：石阡苔茶；3：遵义红茶。
图4 是根据3 种贵州红茶差异代谢物的PCA得分图得到的载荷图。可以利用主成分载荷图上变量的分布来说明相同方向上的主成分的构成情况[11]。横坐标主成分1 的正轴主要分布的物质主要有槲皮素及其糖苷衍生物、有机酸类、生物碱类组分，对应普安红茶；负轴分布的主要物质为柚皮黄酮类组分，对应遵义红茶和石阡苔茶；纵坐标主成分2 的负轴分布的主要物质为柚皮黄酮类组分，对应遵义红茶；因此，槲皮素及其糖苷衍生物、有机酸类、生物碱类、柚皮黄酮类组分可能是普安红茶区别于遵义红茶和石阡苔茶的主要代谢特征物，而柚皮黄酮类化合物组分可能为遵义红茶和石阡苔茶的区别代谢特征物。
图4 3 种贵州红茶的差异代谢物载荷图
Fig.4 Loading plots of differential metabolites of three kinds of Guizhou black tea
注：图中数字为表1 中序号。
2.5 3 种贵州红茶的差异代谢物的代谢特征分析
将3 种贵州红茶间的96 种代谢物限定在P＜0.05 且|log2FC|＞1 条件中，利用Origin 软件做出火山图。
在图5a 的火山图中，普安红茶和石阡苔茶间共有16 个差异代谢物。普安红茶与石阡苔茶相比较，普安红茶有5 种代谢物含量是显著低于石阡苔茶，分别是山奈酚、柚皮素-7-O-葡萄糖苷、木犀草素、墨沙酮、香豆素，11 种代谢物含量显著高于石阡苔茶，分别是槲皮素、槲皮苷、异槲皮苷、芦丁、山奈酚-3-O-鼠李糖苷、甜菜碱、7-甲基黄嘌呤、儿茶素、咖啡酸、异绿原酸C、新绿原酸。
图5 3 种贵州红茶的代谢物火山图
Fig.5 Volcano plots of metabolites of three kinds of Guizhou black tea
图5b 中，普安红茶和遵义红茶相比较，普安红茶和遵义红茶间共有15 个差异代谢物。普安红茶有6 种代谢物含量是显著低于遵义红茶，分别是山奈酚、柚皮素-7-O-葡萄糖苷、柚皮素、柚皮苷、表没食子儿茶素、墨沙酮，9 种代谢物含量是显著高于遵义红茶，分别是曲酸、山奈酚-3-O-鼠李糖苷、高车前素、槲皮素、槲皮苷、异槲皮苷、芦丁、7-甲基黄嘌呤、去甲猪毛菜碱。
图5c 中，遵义红茶和石阡苔茶间则是有9 种差异代谢物，遵义红茶和石茶苔茶相比较，遵义红茶有2 种代谢物含量是显著低于石阡苔茶的，分别是木犀草素、墨沙酮，7 种代谢物含量是显著高于石阡苔茶的，分别有表儿茶素、儿茶素、表没食子儿茶素、柚皮素-7-O-葡萄糖、咖啡酸、异绿原酸C、新绿原酸。
为方便3 种茶叶间进行数据对比，将数据整理成箱线图。普安红茶和遵义红茶的咖啡酸、新绿原酸和异绿原酸C 的含量都显著高于石阡苔茶。新绿原酸和异绿原酸C 是一类伴随存在的绿原酸类化合物，是由咖啡酸和奎宁酸缩合而成的酚酸类化合物[12]，酚酸是一类含有酚环的有机酸。有机酸的含量多的茶叶，酸度增大，有利于增强某些多酚氧化酶的活性，有助于红茶的发酵，可以促进茶叶优良品质以及某些香气物质的形成[13]，且酚酸类物质是合成酯型儿茶素的必要成分之一。根据Chen 等[10]、朱文卿等[12]和张燕红[14]的研究成果，咖啡酸、绿原酸虽然在茶汤内含量较低，但与茶汤的酸味和涩味存在一定的协同作用，即会对茶汤的酸味、涩味起到一定的增强作用。
儿茶素是茶多酚的主要组成成分，约占总量的60%左右，是茶汤中的重要滋味成分，遵义红茶中的儿茶素（C）、表儿茶素（EC）、表没食子儿茶素（EGC）3 种非酯型儿茶素的含量显著高于石阡苔茶，茶汤的苦涩味受茶汤中的酯型儿茶素与非酯型儿茶素的比例和含量的影响，非酯型儿茶素的含量较高，则有茶汤的苦涩味会较弱一些，口感上会更爽口[15]。
在石阡苔茶中，木犀草素和墨沙酮的含量显著高于其它两种红茶。木犀草素是在自然界分布较广的一种天然黄酮类化合物，具有抗肿瘤、抗炎症、抗氧化等药理活性[16]。墨沙酮具有明显的神经元保护作用[17]，且在淋巴细胞刺激试验中表现出免疫抑制活性[18]。
黄酮类化合物是存在于自然界的一类黄色色素，是茶叶里的主要次生代谢产物，是茶汤中重要的呈味和呈色物质[19]。山奈酚、槲皮素和杨梅素是茶叶中主要存在的3 种黄酮醇[20]，在普安红茶中，槲皮素、槲皮苷、异槲皮苷和芦丁等槲皮素类化合物的含量显著高于遵义红茶和石阡苔茶的。李辛雷等[21]的研究成果表明，异槲皮素和芦丁含量的增加能使茶汤显著变黄。在普安红中山奈酚-3-O-鼠李糖苷的含量也是最高的，Scharbert 等[22]的研究表明山奈酚-3-O-鼠李糖苷和异槲皮苷等黄烷醇-3-糖苷类物质能带来天鹅绒般的收敛味觉，同时协助咖啡因给茶汤带来苦味。黄酮苷类物质虽在鲜叶里的含量较低，但对人体有较强的生理作用。槲皮素类化合物具有抗癌作用，抗氧化功能、抗炎、降低血糖、保护心血管和神经的作用[23]。
普安红茶中7-甲基黄嘌呤的含量在3 种红茶中是最高的，7-甲基黄嘌呤是茶叶中生成可可碱、咖啡碱的中间产物[24]，而7-甲基黄嘌呤的增加可以促进咖啡碱合成酶基因的表达，进而促进咖啡碱的合成[25]。而咖啡碱的存在可以局部抑制蛋白质和酚类结合而产生的凝固作用，有利于茶汤滋味的形成。
2.6 代谢通路分析
将鉴定得到的差异代谢物信息导入Metabo-Analyst 5.0 在线软件进行代谢通路分析，则得到图7 贵州红茶的差异代谢物的代谢通路图，则有主要涉及到的代谢通路有黄酮和黄酮醇生物合成（Flavone and flavonol biosynthesis，impact=1），类黄酮生物合成（Flavonoid biosynthesis，impact=0.11）。
图7 代谢通路分析
Fig.7 Analysis of metabolic pathway
考虑到MetaboAnalyst 5.0 的通路分析仅限于利用模式生物拟南芥的代谢数据，则同时又根据Compound Discoverer 3.2 软件的Metabolika 数 据库对贵州红茶的差异物代谢通路进行进一步分析，可得到主要代谢通路有黄酮及其衍生物生物合成通路（Superpathway of flavones and derivatives biosynthesis）和异黄酮通路（通过柚皮素）（Superpathway of isoflavonoids [via naringenin]）。
从代谢通路的分析结果可以发现，黄酮类相关代谢是区分贵州3 种红茶的主要代谢通路。黄酮类化合物属于多酚类物质，是由苯丙烷代谢途径的一个特定分支合成的次级代谢产物，而苯丙氨酸是这一途径的起始产物[26]。
3 结论
采用UPLC-Q-Orbitrap 高分辨质谱分析贵州的3 种红茶，得到了14 类96 种代谢物，其中含量较高的化合物是黄酮类和氨基酸及其衍生物，黄酮类是茶叶中的重要呈色和呈味物质，而氨基酸是茶汤里鲜味的重要来源，也是茶叶香气的基础物质，对美好滋味和香气的形成具有重要贡献[27-28]，这两类物质对于形成贵州红茶的优良品质具有重要作用。利用多元统计分析筛选出了3种贵州红茶间的23 种差异代谢物，通过分析差异物的丰度可以得到普安红茶和遵义红茶中咖啡酸和绿原酸类物质的含量较高，普安红茶中槲皮素类化合物的含量较高，而石阡苔茶中含量较高的成分则是木犀草素和墨沙酮，这些化合物可能是3 种红茶形成自己独特滋味和品质的关键成分。代谢通路分析则提示，主要影响3 种红茶间差异的代谢通路是黄酮类化合物相关代谢通路。结果表明，利用代谢组学的方法可寻找不同品种红茶间的代谢物差异，利于不同品种茶叶间的鉴别。
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