棒曲霉素是一些真菌如曲霉菌、青霉菌、丝衣霉菌等的有毒次生代谢物[1]，这些物种包括土曲霉、巨大曲霉、展青霉、圆弧青霉、扩展青霉、棒型青霉和白丝衣霉等[2-3]。棒曲霉素能污染多种食品，如水果、蔬菜、谷物和奶酪等，进入身体会引起人和动物的多种健康风险。毒理学研究表明棒曲霉素能入侵皮肤、肾脏、肝脏、胃肠道和神经系统，对人体的组织和器官造成损伤[4]。在一些动物研究中，棒曲霉素还具有急性和亚急性毒性、免疫毒性、致畸形、致突变性、致癌性等[5-6]。
棒曲霉素的检测方法主要为色谱法，例如薄层色谱法、高效液相色谱法和气相色谱法等[7-9]。这几种方法虽然对检测棒曲霉素有高灵敏性和高特异性，但是需要复杂的净化步骤、大量的原材料和昂贵的仪器，难以满足实时检测的需求。有关棒曲霉毒素的新型检测方法引起广泛的研究兴趣[10-13]。免疫化学法基于高特异性抗原-抗体的相互作用，可进行有效的检测[14-15]。由抗体和脂质体纳米颗粒组成的免疫脂质体纳米颗粒在食品安全中广泛应用于检测食源性细菌、毒素和食品添加剂等有害物质[16]。抗体的存在使免疫脂质体纳米粒子对靶标具有高度特异性，能有效提高分析的灵敏度。为了开发一种棒曲霉素的快速、灵敏检测方法，本文用兔抗棒曲霉素BSA 抗体研制棒曲霉素免疫脂质体，并用于棒曲霉素的检测。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺（DPPE）、二棕榈酰磷脂酰甘油（DPPG）购于美国Avanti Polar Lipids 公司；乙酸、乙腈、硫酸铵、辛酸、乙酸乙酯、乙二胺四乙酸（EDTA）、二甲基亚砜（DMSO）、乙酰胺、棒曲霉素、棒曲霉素牛血清白蛋白（patulin-BSA）、硫酸钠、三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）、4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙烷磺酸（HEPES）、甲醇、n-辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷（OG），商业化的兔抗、蛋白质标记物、三乙胺、Tween 20、蔗糖、氯仿、胆固醇、磷酸氢钾、磷酸二氢钾、琼脂糖凝胶CL-4B、醋酸钠、叠氮化钠、碳酸钠、氯化钠、十二烷基硫酸钠（SDS）、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂和聚丙烯酰胺购于Sigma 公司；N-琥珀酰-s-乙酰硫代乙酸酯（SATA）、磺基罗丹明B（SRB）、盐酸羟胺和N-（k-马来酰亚胺基）磺基琥珀酰亚胺（sulfo-KMUS）购于Pierce 公司；透析膜（截留分子质量：12～14 ku）购于Spectrum Laboratories，Inc.公司；磁力分离器购于Dynal Inc.公司；聚碳酸酯过滤器（孔径为0.4 μm 和0.8 μm）和注射器过滤器购于Whatman 公司；96 孔微量滴定板购于SPL Life Sciences 公司；磷酸酶标记的山羊抗兔IgG 购于Kirkegaard &Perry Laboratories 公司。无棒曲霉素的苹果汁购于韩国Gyeongsan 的当地超市。兔抗棒曲霉素的BSA-IgG由韩国岭南大学食品科学与技术系，食品安全与微生物实验室制得。
1.2 仪器与设备
R100 真空旋转蒸发仪，瑞士BUCHI 公司；超声粉碎仪韩国Hitech 有限公司；Zetasizer Nano ZS90 粒径仪，英国Malvern 公司；Infinite M200 酶标仪，瑞士TECAN 公司。
1.3 脂质体和免疫脂质体的制备
DPPE、DPPC、DPPG、胆固醇和SRB 用于制备荧光染料封装的脂质体[17]。将DPPE（7.2 μmol）和SATA（14.3 μmol）溶解于1 mL 含0.7%三乙胺的氯仿溶液中，氮气吹扫下超声处理1 min 形成DPPE-SATA。DPPC（40.3 μmol）、DPPG（4.2 μmol）和胆固醇（40.9 μmol）溶解于3 mL 氯仿和0.5 mL甲醇的混合溶液中，并在45 ℃和氮气吹扫下，超声1 min 以形成脂质，然后立即向脂质混合物中加入2 mL 的密封剂（100 mmol/L SRB 溶解于0.02 mol/L HEPES 缓冲液，pH 7.5），在45 ℃和氮气吹扫下超声3 min。之后，45 ℃下旋转蒸发去除有机溶剂，留下深紫色的凝胶状悬浮液。向脂质悬浮液中再加入2 mL 的密封剂，进行1 min 超声处理，重复涡流，蒸发，超声处理直到混合物变成均匀的悬浮液。将悬浮液依次通过0.8 μm 和0.4 μm 膜过滤器，获得均匀大小的脂质体。将制得的脂质体在包含0.2 mol/L NaCl 和 0.01% NaN3（pH 7.5）的0.01 mol/L HEPES 缓冲液中，用透析膜透析过夜。收集透析后的脂质体溶液于4 ℃下避光保存备用。
制备IgG 标记的脂质体时，将溶解在VDMSO ∶V甲醇=2∶1 的混合溶剂中的sulfo-KMUS（2 mg/mL）加入到1 mL 的抗棒曲霉素-BSA IgG 溶液中，室温下以70 r/min 的振摇反应3 h，得到带有马来酰亚胺基团的衍生化IgG。被衍生化的抗棒曲霉素-BSA IgG 在4 ℃避光条件下，用透析膜在含有0.15 mol/L NaCl 和0.01% NaN3（pH 7.0）的0.02 mol/L HEPES 溶液中透析过夜。同时，将30 μL 0.5 mol/L 盐酸羟胺溶解在含有25 mmol/L EDTA（pH 7.5）的0.1 mol/L HEPES 溶液中，与300 μL脂质体溶液混合，以去除脂质体纳米颗粒上的乙酰硫代乙酸基团。用氮气吹扫1 min 后，脂质体溶液在室温下轻轻摇动反应2 h。含有巯基的脂质体溶液用0.5 mol/L HEPES 溶液调节pH 至7.0，再与带有马来酰亚胺基团的衍生化IgG 混合。混合物用氮气吹扫1 min 并在室温下培养4 h，接着在4 ℃避光条件下培养过夜。将溶解在0.02 mol/L TBS（pH 7.0）溶液中浓度为100 mmol/L 的乙基马来酰亚胺添加到反应中，在室温下70 r/min 轻轻摇晃30 min 以猝灭未反应的巯基。将混合物通过用0.02 mol/L TBS 平衡的Sepharose CL-4B 柱过滤，收集的免疫脂质体溶液并置于透析管中在0.02 mol/L TBS 溶液中透析。收集透析后的免疫脂质体并于4 ℃避光的条件下保存备用。
1.4 棒曲霉素免疫脂质体荧光检测方法的设计
用含有0.04 mol/L 蔗糖的0.01 mol/L Tris 缓冲盐水（TBS）以1∶10 比例稀释制备得到免疫脂质体原液。首先，将100 μL 抗棒曲霉素-BSA IgG（1 μg/mL）包被于96 孔微量滴定板上，4 ℃下孵育2 h。96 孔微量滴定板用200 μL 含有0.05% Tween 20 的0.01 mol/L 磷酸盐缓冲盐水（PBST）冲洗。将100 μL 稀释后的棒曲霉素溶液加入到洗涤后的96 孔微量滴定板中，4 ℃下孵育1 h。将100 μL 的稀释后的免疫脂质体溶液加入到用200 μL PBST洗涤后的96 孔微量滴定板。免疫脂质体用96 孔微量滴定板在4 ℃培养1 h 后，滴定板用200 μL的PBST 洗涤3 次。最后，将200 μL 的OG 溶液加入到96 孔微量滴定板以溶解免疫脂质体释放出荧光剂SRB。在激发波长为550 nm 和发射波长为585 nm 的条件下测量荧光强度信号。分析棒曲霉素的梯度稀释液以确定检测限。
1.5 基于免疫脂质体的荧光检测法特异性
为了验证基于免疫脂质体的荧光检测特异性，将0.01 mol/L PBS 中的赭曲霉毒素A 溶液稀释至质量浓度为10，50 μg/L 和100 μg/L。这些不同质量浓度的赭曲霉毒素A 通过开发的基于免疫脂质体的荧光检测法进行测定。同时，为了确认BSA 对所开发的测定法的副作用，苹果汁中不同浓度的BSA 也通过基于免疫脂质体的荧光检测法进行测定。
1.6 HPLC 法测定棒曲霉素含量
采用HPLC 法对人工污染10，50，100，200 μg/L 和500 μg/L 棒曲霉素的苹果汁样品进行分析。使用乙酸乙酯从人工污染的苹果汁样品中萃取棒曲霉素，乙酸乙酯用0.5%的碳酸钠和无水硫酸钠处理。滤液经真空干燥并溶解在乙酸溶液（pH 4.0）中，在配备紫外线探测器的Ultimate 3000 进行HPLC 分析。将20 μL 样品注入C18 柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），使用5%乙腈以0.5 mL/min 的恒定流速进行洗脱。检测波长为276 nm。通过标准曲线计算苹果汁样品中棒曲霉素含量。
2 结果与讨论
2.1 脂质体与免疫脂质体的表征
包封SRB 的脂质体颗粒通过反相蒸发法制得。脂质体和抗棒曲霉-BSA IgG 包被的免疫脂质体的表征如表1 所示。脂质体粒径为（179.5±1.7）nm，而在脂质体表面覆盖抗棒曲霉-BSA IgG 的免疫脂质体颗粒粒径为（211.81±0.97）nm。当其它化合物结合到脂质体表面时，脂质体粒径增大。颗粒粒径的变化表明了用抗棒曲霉-BSA IgG 包被在脂质体上成功制备了免疫脂质体。SRB 的起始浓度为100 mmol/L，所开发的脂质体和免疫脂质体的内部体积均为3.03×10-12 μL，并且浓度为3.03×10-13 μmol 的SRB 被封装在内部。如表1 所示，脂质体和免疫脂质体的多分散指数分别为0.19±0.00 和0.17±0.01，低多分散指数表明该脂质体和免疫脂质体具有良好的稳定性。纳米颗粒的zeta 电位反映了胶体系统的电位稳定性。当悬浮液中的颗粒具有较大的负或正zeta 电位时，颗粒之间会相互排斥，使悬浮液稳定。如表1 所示，脂质体和免疫脂质体都有负zeta 电位，这表明悬浮颗粒具有聚集在一起的阻力。此结果显示制备的脂质体和免疫脂质体稳定、均一，适合开发棒曲霉素快速检测新方法。
表1 脂质体和免疫脂质体的特性
Table 1 Characterization of liposomes and immuneliposomes
2.2 免疫脂质体荧光法检测棒曲霉素
如图1 所示，当棒曲霉素的质量浓度由0 μg/L 增加到150 μg/L 时，荧光强度急剧增加。该信号与棒曲霉素质量浓度有很好的线性关系，R2 达0.9641。然而，当棒曲霉素的质量浓度高于150 μg/L 后，荧光强度不再增加。以上结果表明建立的方法当棒曲霉素质量浓度高于150 μg/L 仅能给出定性检测的结果。通过线性回归计算，这种基于免疫脂质体的荧光检测法对棒曲霉毒素的检测限为8 μg/L。
图1 基于免疫脂质体的荧光分析法对棒曲霉毒素的检测
Fig.1 Detection of patulin by immuneliposome-based fluorescence
2.3 基于免疫脂质体的荧光检测法的灵敏性和特异性
用赭曲霉毒素A 作为对照毒素检验所建立的方法的特异性。当赭曲霉毒素A 的质量浓度从0 μg/L 增加到200 μg/L 时，荧光信号没有改变（图2），这表明该方法与赭曲霉毒素A 无交叉反应。如图2 所示，BSA 作为免疫原的组成部分，显示了较明显的交叉反应，当BSA 存在于食品样品中时，该结果可能限制开发的检测棒曲霉素的方法的应用。
图2 基于免疫脂质体的荧光分析法对其它毒素的交叉反应
Fig.2 Cross-reactivity of immuneliposome-based fluorescence assay with other toxins
2.4 基于免疫脂质体的荧光检测法与HPLC 的比较
比较了基于免疫脂质体的荧光检测法和HPLC 检测人工污染的苹果汁中棒曲霉素的回收率，以确认所开发方法的可靠性，结果如表2 所示。当棒曲霉素的加标质量浓度为10，50，100，200 μg/L 和500 μg/L 时，HPLC 检测到的棒曲霉素质量浓度分别为（6.19±0.31），（35.63±0.62），（74.38±6.88），（151.88±3.12）μg/L 和（481.88±1.31）μg/L，表明回收率分别为（61.88±0.03）%，（71.25±0.01）%，（74.38±0.07）%，（75.94±0.02）%，和（96.38±0.03）%。在棒曲霉素的HPLC 分析中，有机溶剂提取在过程的影响将显著影响回收率，低回收率表明在提取过程中有棒曲霉素的损耗。当棒曲霉素的加标质量浓度为10，50 μg/L 和100 μg/L 时，该方法的回收率分别为（73.24±0.06）%，（101.73±1.55）%和（98.74±4.88）%，表明该方法检测棒曲霉素是灵敏且可靠的。当棒曲霉素的加标质量浓度为200 μg/L 和500 μg/L 时，回收率为（69.97±0.17）%和（32.7±1.31）%，该结果与棒曲霉素纯溶液的检测结果，在0 至150 μg/L 的范围内具有良好的线性关系。然而，在纯溶液和人为污染的苹果汁溶液中，当棒曲霉素的质量浓度高于200 μg/L 时，该方法的线性均有所下降。Pennacchio 等[18]报道了一种近红外荧光分析方法，该方法可以检测食品中的棒曲霉素且无需提取和洗涤过程。Sadok 等[19]报道了一种结合HPLC 和二极管阵列检测草莓中棒曲霉素的方法，其检测限满足棒曲霉素监测水平的灵敏度要求。类似地，Ahmadi等[20]开发了用于棒曲霉素检测的DNA 双探针辐射荧光传感器，其线性范围为15 ng/L 至35 μg/L，检测限为6 ng/L。相较于HPLC 及相关的方法，这种基于免疫脂质体的荧光检测法非常迅速，能在3 h 之内检测苹果汁样品中的棒曲霉素。此外，该免疫脂质体荧光分析方法简便易行，无需有机溶剂提取和洗涤过程。
表2 基于免疫脂质体的荧光脂质体的荧光分析法与HPLC 方法的比较
Table 2 Comparison of HPLC and developed immunoliposome-based fluorescence assay for the detection patulin in artificial contaminated apple juice
3 结论
为了建立一种快速、灵敏的果汁中棒曲霉素检测方法，以抗棒曲霉素BSA IgG、DPPE、DPPC、DPPG、胆固醇和SRB 为原料合成了免疫脂质体，建立了基于免疫脂质体的荧光检测方法。该检测方法快速、简单、方便，检测限可达8 μg/L。当棒曲霉素质量浓度在0～150 μg/L 之间时，该方法的线性相关系数R2 为0.9641。此外，该基于免疫脂质体的检测方法环境友好，不需使用机溶剂萃取。
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