豆粕为一种植物源蛋白，具有高浓度的蛋白质和适宜的氨基酸比例，有着很高的开发利用价值[1-2]。目前，豆粕主要作为饲料直接喂养动物，其中的大豆抗原蛋白和抗营养因子，大大限制了动物对豆粕蛋白的消化吸收[3]。酶解豆粕克服了豆粕本身的缺陷，提高了蛋白质的消化率，降低其过敏性，并能生产出功能特性更好的大豆小肽。大豆小肽主要由3～6 个氨基酸组成，分子质量约1 000 u，主要分布在300～700 u 范围，除易吸收外[4]，还具有调节血压[5]，抑制慢性肾病[6]，免疫调节[7]，抗癌活性[8]，抗菌、抗病毒[9]，改善肠道微生物活性[10]，降低胆固醇和抗糖尿病[11]等生物活性。
酶解蛋白质已被广泛利用，与酸解和碱解等方式相比，酶解不仅反应温和，而且具有很强的特异性[12]。现有研究主要以液态酶解豆粕肽为主，对半固态酶解豆粕的工艺鲜有报道。半固态酶解豆粕通过加入适当的水，使豆粕以固态存在，通过调节温度、时间、加酶量等条件优化酶解工艺[13]。半固态酶解相对于液态酶解来说，半固态酶解豆粕易于烘干，有利于豆粕饲料的规模性生产。酶水解程度通常以水解度来量化，它表示被切割的肽键与初始肽键数的百分比。然而，水解度并不能完全反映酶水解情况，需以小肽含量和肽段长度共同判断[14-15]。
本试验以豆粕为原料，以豆粕水解度、豆粕肽含量、小肽分子质量和疏水值为半固态酶解的重要指标，筛选适合半固态酶解的蛋白酶，优化酶水解条件，旨在为豆粕的工业化生产提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
豆粕，中粮佳悦（天津）有限公司；碱性蛋白酶（200 U/mg）、中性蛋白酶（100 U/mg）、胰蛋白酶（250 U/mg）、角蛋白酶（70 U/mg）、木瓜蛋白酶（800 U/mg），源叶生物科技有限公司；L-甘氨酸、杆菌肽，北京索莱宝科技有限公司；Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Try-Arg，Sigma 公司；胰岛素（猪胰腺），上海阿拉丁试剂有限公司；其它试剂均为AR 级。
1.2 仪器与设备
AL104 电子天平，瑞士Mettler Toledo 公司；电热恒温鼓风干燥箱，上海新苗医疗器械制造有限公司；紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司；多功能酶标仪，美国赛默飞世尔科技公司；Agilent Technologies 1290 infinity 高效液相色谱仪（配有DAD 检测器），安捷伦科技（中国）有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 半固态酶解方法 将豆粕粉碎过60 目筛，准确称取适量的豆粕于反应器中，根据酶活力单位准确称取适量的蛋白酶加入反应器中，搅拌均匀后加入适量的蒸馏水，搅拌至水在豆粕中均匀分散，封上保鲜膜在恒温箱中反应。反应到预定时间，取出放置于105 ℃烘箱中，灭酶15 min。冷却，放到烘箱中35 ℃低温烘干，得到半固态酶解的豆粕。
1.3.2 半固态酶解豆粕中多肽液提取 称取半固态酶解豆粕0.5000 g，溶于50 mL 的离心管中恒温振荡6 h，将振荡后的豆粕酶解液置于冰箱中4℃冷藏过夜。冷藏后的豆粕酶解液4 000 r/min 离心15 min，收集上清液。
1.3.3 水解度的测定
1）豆粕完全水解液制备 称取7.5 g 豆粕于烧杯中，加入75 mL 6 mol/L HCI 密封后放入110～120 ℃烘箱中水解24 h，取出后冷却。用滤纸过滤，滤液用蒸馏水定容75 mL。吸取适量豆粕完全酶解液，用40%和2%的NaOH 调pH 值中性（pH=6），定容。取完全水解液2 mL 于25 mL 比色管中，加入1 mL 茚三酮溶液混匀，沸水浴加热15 min，然后快速冷却，加入5 mL 40%乙醇溶液反应15 min，570 nm 测吸光度。
2）工作曲线的绘制 取100 mg 甘氨酸溶于蒸馏水后定容至100 mL 作为标准溶液，取相应体积标准溶液，按上述方法测定吸光度。以甘氨酸的浓度与吸光度制作工作曲线，取线性部分做标准曲线。
3）水解液水解度的测定 取多肽提取液，稀释至可测浓度，取水解液2 mL 于25 mL 比色管中，加入1 mL 茚三酮溶液混匀，沸水浴加热15 min，冷却，加入5 mL 40%乙醇溶液反应15 min，于波长570 nm 处测吸光度，根据吸光度计算蛋白质含量[16]。按下式计算水解度：
式中，A——蛋白质质量（mg）；M——样品质量（g）；V1——水解液的总体积（mL）；V2——显色时所用的稀释液的体积（mL）。
1.3.4 小肽含量的测定 参考余勃等[17]的方法。取等体积的三氯乙酸（0.4 mol/L）加入酶解液中，混匀反应30 min，反应结束以10 000 r/min 离心10 min，取上清液1 mL 加入4 mL 双缩脲试剂，混匀室温放置30 min，于波长540 nm 处测吸光度。
1.3.5 酶解液分子质量测定 参考文献[18]和[19]的方法。采用Agilent Technologies 1290 infinity高效液相色谱仪（配置Agilent Technologies 1200 series DAD 检测器）对制备的豆粕酶解液进行分子质量分布的测定。色谱柱：TSKgeL2000 SWXL（300 mm×7.8 mm）；流动相：水（0.1%三氟乙酸）；检测波长：214 nm；流速：0.6 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。
1.3.6 疏水值的测定 参考文献[20]和[21]的方法。用0.01 mol/L pH 6.5 的磷酸缓冲液将豆粕酶解液稀释至质量分数0.02%，0.04%，0.06%，0.08%，0.10%，并配制8.0 mmol/L ANS 溶液。取2 mL 上述配制稀释液，加入10 μL ANS 立即混匀。在荧光分光光度计中于激发波长390 nm、发射波长470 nm 检测荧光强度，激发和发射夹缝宽均为5 mm。以荧光强度为纵坐标，豆粕质量分数为横坐标进行线性回归，以线性回归斜率为疏水值指数。
1.3.7 蛋白酶的筛选 以豆粕肽的得率、水解度、分子质量分布和疏水值为指标，考察胰蛋白酶、角蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶5种蛋白酶在适宜的条件下酶的水解特性，确定最佳蛋白酶的类型。
表1 5 种蛋白酶酶解条件
Table 1 Enzymatic hydrolysis conditions of 5 proteases
1.3.8 单因素实验 在豆粕质量30 g，酶解温度50 ℃，酶解时间36 h，液固比为1 mL/g 的条件下，考察加酶量（10，20，30，40，50，60 mg/g）对水解度的影响。
在豆粕质量30 g，酶解温度50 ℃，酶解时间36 h，加酶量40 mg/g 的条件下，考察液固比（0.5，1，1.5，2，2.5 mL/g）对水解度的影响。
在豆粕质量30 g，酶解温度50 ℃，液固比为1 mL/g，加酶量40 mg/g 的条件下，考察酶解时间（12，24，36，48，60，72 h）对水解度的影响。
在豆粕质量30 g，酶解时间36 h，液固比为1 mL/g，加酶量40 mg/g 的条件下，考察温度（30，40，50，60，70，80 ℃）对水解度的影响。
在酶解温度50 ℃，酶解时间36 h，液固比为1 mL/g，加酶量40 mg/g 的条件下，豆粕质量（10，20，30，40，50，60 g）对水解度的影响。
1.3.9 响应面优化试验 在单因素实验基础上，应用Box-Behnken Design 进行响应面优化试验。选择试验中可优化因素（豆粕质量、酶解温度和液固比）进行优化，因素与水平见表2。
表2 响应面设计因素水平表
Table 2 Level table of response surface design factors
2 结果与分析
2.1 蛋白酶的筛选
2.1.1 不同蛋白酶对水解度的影响 由图1 可知，木瓜蛋白酶和角蛋白酶随着加酶量的增大，水解度先增大后降低，在酶添加量为30 mg/g 时达到顶点，木瓜蛋白酶的水解效率最高，角蛋白酶水解效率偏低。胰蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶均随加酶量的增大，水解度持续增大，到达一定值后，水解度上升趋于平缓，可能是由于水解产物中氨基酸和小肽的不断增加，酶被底物完全饱和。蛋白酶浓度增加，豆粕中的蛋白质会被高度水解，当酶浓度超过最佳浓度时，酶活性会显著减弱，过量的蛋白酶聚集导致底物扩散抑制增加，反应速率饱和，进而导致水解度降低[20-22]。由图1 可以看出，木瓜蛋白酶的水解效果最好，豆粕大部分被酶解成游离的氨基酸和不同链长的多肽，胰蛋白酶和碱性蛋白酶的水解度比木瓜蛋白酶低，而呈现上升的趋势，胰蛋白酶水解度上升趋势明显，随着加酶量升高，水解度高于碱性蛋白酶，与木瓜蛋白酶相接近。
图1 5 种蛋白酶对豆粕水解度的影响
Fig.1 Effects of 5 proteases on hydrolysis degree of soybean meal
2.1.2 不同蛋白酶对豆粕肽得率的影响 由图2可知，随着加酶量的增大，胰蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶均随着加酶量的增多，豆粕肽得率呈递增趋势。图1、图2 结果显示木瓜蛋白酶的水解度较高，呈现先增后减的趋势，豆粕肽得率最低且持续增长，这可能主要是由于木瓜蛋白酶在酶解过程中，前期豆粕蛋白主要被酶解为长链肽。然而随着加酶量增多，底物抑制增强，形成长链肽的速率降低，短链肽形成速率增加，总体酶解速率降低。通过对豆粕肽得率的研究发现，胰蛋白酶、碱性蛋白酶、角蛋白酶酶解产物的豆粕肽得率较高，木瓜蛋白酶酶解产物中多肽浓度处于较低水平。
图2 5 种蛋白酶对豆粕肽得率的影响
Fig.2 Effects of 5 proteases on peptide yield of soybean meal
2.1.3 分子质量的测定 从表3 可知，角蛋白酶酶解产物中分子质量＞1 000 u 的肽占比较高，说明角蛋白酶酶解产物中含有大量的长链肽，其它蛋白酶酶解产物中分子质量＜1 000 u 的低分子肽含量较高，其中胰蛋白酶、中性蛋白酶的酶解产物中，分子质量在150～500 u 的肽含量较高，主要为二肽和三肽的小肽，研究表明，短链的大豆肽具有特定的生物活性，其中二肽和三肽比完整蛋白或者游离氨基酸更容易消化，因此被认为是人类营养合适的蛋白质来源[23]。木瓜蛋白酶的酶解产物中分子质量＜150 u 的肽含量较高。结果表明，胰蛋白酶和中性蛋白酶的酶解产物中小肽含量高，可以有效增加产品品质，促进消化吸收。角蛋白酶酶解后大分子肽含量高，木瓜蛋白酶酶解产物主要以游离氨基酸为主，在制备豆粕肽的工艺中效果欠佳。
表3 5 种蛋白酶最适条件下分子质量分布表
Table 3 Molecular weight distribution of 5 proteases in optimal conditions
2.1.4 疏水值测定 ANS 荧光探针法测得的疏水性指数，可以在一定程度上反映肽链上疏水氨基酸的含量。表面疏水值越高，说明肽链中的疏水性氨基酸残基越多，所产生的苦味就越强[24]。从表4可以看出，角蛋白酶的酶解产物表面疏水值为60.47，是所有蛋白酶酶解产物中的最低水平。碱性蛋白酶作为一种内切酶，与疏水性和碱性残基C 末端结合的特异性较差[25]，疏水性指数在5 种蛋白酶中最高。胰蛋白酶主要作用于精氨酸和赖氨酸残基，具有很强的特异性，疏水性指数变化不大，中性蛋白酶是一种外源性蛋白酶，对肽键的专一性不强，疏水值变化明显。因此角蛋白酶的酶解产物苦味较淡，易于接受。胰蛋白酶和中性蛋白酶酶解产物的苦味适中，中性蛋白酶酶解产物受反应条件影响，口味差异大。碱性蛋白酶在水解过程中，非极性基团在蛋白质三级结构中暴露出来，酶解的产物苦味较重。
表4 5 种蛋白酶最适条件下的疏水值
Table 4 Hydrophobic values of 5 proteases under optimal conditions
综合考虑蛋白酶酶解产物以上几种因素，胰蛋白酶的水解度较高，豆粕肽得率达到18.06%，是几种蛋白酶中肽得率最高的，而且豆粕肽主要为二肽、三肽，品质较优，苦味偏淡，故选择胰蛋白酶作为最优的水解酶。
2.2 单因素实验结果
2.2.1 加酶量对酶解的影响 由图3a 可知，当加酶量达到40 mg/g 时，豆粕的水解度和豆粕肽得率的变化趋势都逐渐变缓。表明随着酶添加量的不断增多，豆粕蛋白转化为豆粕多肽的数量增加。然而，当酶添加量到达一定值时，酶与酶之间会产生竞争性抑制，随着酶添加量增加，酶解反应速率不会产生显著性变化。在图3b 中随加酶量增加，分子质量＞1 000 u 和分子质量在500～1 000 u 之间的豆粕肽占比逐渐减小，分子质量在150～500 u之间的占比逐渐增加。结合图3a 的豆粕肽得率可以看出，随加酶量逐渐增加，酶解产生的长链肽增量逐渐减少，一方面，豆粕蛋白大分子大部分被酶催化，另一方面，酶的浓度过大，一部分酶转移方向，开始酶解长链的豆粕肽。当酶添加量超过40 mg/g 时，豆粕肽得率处于近乎停滞的状态，豆粕肽的分子质量分布也没有明显变化，从经济成本和效率综合考虑，胰蛋白酶的加酶量确定为40 mg/g。
图3 加酶量对酶解的影响
Fig.3 Effect of enzyme dosage on enzymatic hydrolysis
2.2.2 酶解时间对酶解的影响 如图4a 所示，当酶解时间达到36 h 时，豆粕的水解度和肽得率随酶解时间的延长，增长趋势明显。超过36 h 后，一方面反应时间延长，参加酶促反应的底物减少，另一方面胰蛋白酶可能受到多肽和氨基酸的抑制，豆粕的水解度和肽得率增长趋于平缓甚至降低。从图4b 可以看出，豆粕肽分子质量在150～1 000 u 之间的占比处于一个相对稳定的状态，随酶解时间的延长，只会产生更多氨基酸。这是由于胰蛋白酶具有广泛的特异性，主要切割精氨酸或赖氨酸的肽键，因此在36 h 内，胰蛋白酶的酶解程度增加速率不断上升，酶解物主要与酶切位点的偏好有关。酶解时间超过36 h，豆粕肽的得率逐渐减少，水解度上升，这是因为水解反应一直在进行，反应生成的豆粕肽一部分被降解成游离的氨基酸[26]，故酶解36 h 是最优的酶解时间。
图4 酶解时间对酶解的影响
Fig.4 Influence of enzymatic hydrolysis time on enzymatic hydrolysis
2.2.3 豆粕量对酶解的影响 如图5a 所示，当豆粕添加量达到30 g 时，豆粕的水解度和肽得率达到最高。在底面积相同的容器中，随着豆粕量的增加，豆粕的表面积和内部面积发生变化，表面易干燥内部水分迁移较弱，表面温度与内部温度不同等问题都会影响豆粕的酶解。当酶添加量超过30 g 时，豆粕的水解度和肽得率降低，长链的豆粕肽占比不断增大，说明豆粕添加量的变化会对胰蛋白酶的作用产生影响，豆粕添加量为40 g 时，小分子肽占比略高于豆粕添加量为30 g，而肽得率明显下降。故确定豆粕量为30 g。
图5 豆粕量对酶解的影响
Fig.5 Influence of soybean meal content on enzymatic hydrolysis
2.2.4 酶解温度对酶解的影响 如图6a 所示，随着温度的升高，豆粕的水解度和肽得率不断上升，当温度达到50 ℃时，豆粕的水解度和肽得率效果最好，分别达到14.8%和16.13%。升高温度，蛋白的活化能和酶的活性都会升高，豆粕的水解度和肽得率也会提高。然而随温度的进一步升高会导致酶失活，酶解的速度降低。在酶解温度为50 ℃的条件下，豆粕肽的二肽、三肽含量最高，说明适宜的温度有助于蛋白的解离，蛋白酶更容易到达适宜的酶切位点，酶解产物多为豆粕肽。当温度超过50 ℃，解聚的蛋白亚基会重新聚集成团，不利于豆粕的酶解，而且酶解多发生在折叠的豆粕蛋白表面，产物中多为游离氨基酸，因此选择酶解温度50 ℃为最适温度。
图6 酶解温度对酶解的影响
Fig.6 Influence of enzymatic hydrolysis temperature on enzymatic hydrolysis
2.2.5 液固比对酶解的影响 如图7a 所示，当液固比为1 mL/g 时，豆粕的水解度、肽得率，还有二肽、三肽的含量占比均最高，胰蛋白酶来自动物的胰脏，其酶解特性更加接近于生物，当液固比不断增大，水解度和肽得率都会随之降低，豆粕被直接酶解成游离的氨基酸，适宜的液固比，更容易得到酶解的中间产物豆粕肽。从生产成本角度而言，液固比越高，后续的干燥成本就越高，故液固比确定为1 mL/g。
图7 液固比对酶解的影响
Fig.7 Influence of liquid-solid ratio on enzymatic hydrolysis
2.3 响应面优化试验结果
2.3.1 响应面试验设计及回归模型的建立 以单因素实验结果为基础，以液固比（A）、豆粕量（B）、温度（C）3 个因素为相应变量，以肽得率（Y）为响应值，设计3 因素3 水平试验17 组，结果见表5。
表5 试验方案和结果
Table 5 Experimental scheme and results
采用Design-Expert 8.0.6 软件程序对以上试验数据进行二次多元回归拟合，分析结果得出胰蛋白酶酶解豆粕制备豆粕肽的回归方程为：
由表6 可知，回归模型P＜0.001，说明胰蛋白酶酶解豆粕制备豆粕肽的模型极显著，同时失拟值P 为0.4909＞0.05 不明显，说明该模型合理，数据可信，且模型的R2=0.9881 说明该模型与实际试验拟合较好，自变量与响应值之间的线性关系显著，可以进行分析与预测。
表6 回归模型方差分析及回归方程系数显著性检验
Table 6 Regression model variance analysis and regression equation coefficient significance test
注：*.表示差异显著（0.001＜P＜0.05），**.表示差异极显著（P＜0.001）。
从回归分析的结果可以得出，一次项中A 影响极显著，B 影响显著，C 影响不显著，说明单因素中液固比在豆粕肽得率的影响更加显著。根据F 值的大小，可以判断3 个因素对豆粕肽得率的影响是液固比（A）＞酶解温度（C）＞豆粕量（B）。
2.3.2 响应曲面分析图示 由图8 可知，设计的3 个因素中对豆粕肽得率影响最大的是液固比，其次是酶解温度，最后是豆粕量，与表中方差分析的显著性结果一致。
图8 各因子交互作用的等高线图和曲面图
Fig.8 Contour diagram and surface diagram of interaction of various factors
2.3.3 最佳酶解工艺确定 采用Design-Expert 8.0.6 软件对上述回归方程进行分析，确定最佳酶解工艺：液固比为1.13 mL/g，豆粕质量为28.61 g，温度为50.34 ℃，豆粕肽得率预测值为18.81%。
2.3.4 试验可行性 考虑到试验的可行性和实际操作方便，修正酶解工艺条件为：液固比1 mL/g，豆粕量30 g，温度50 ℃。在此条件下经过3 次平行试验，测得豆粕肽得率为18.87%，与理论值基本吻合，证明响应面分析法对豆粕酶解制备豆粕肽的条件优化是可行的。
3 结论
随着酶制剂的发展逐步成熟，通过酶解手段提取豆粕肽将成为一种主流，半固态酶解工艺相较于液态酶解操作简易，生产成本低，更容易被市场接受。曹梦笛等[27]通过半固态酶解制备全谷物多肽，其抗氧化、ACE 抑制活性显著高于液态酶解产物，说明半固态酶解工艺具有可行性。碱性蛋白酶的水解能力较强[28]，然而在本次试验中，豆粕肽得率和水解度都低于胰蛋白酶，主要原因可能是碱性蛋白酶具有一定的耐碱性，可以在碱性水解液中酶解，碱性水解液使碱性蛋白酶更容易接近蛋白分子内部的催化位点，然而在固态酶解中碱性蛋白酶失去优势。胰蛋白酶作为一种内肽酶，对蛋白质的肽键具有专一性，酶解产物主要以多肽、小肽的形式存在，风味趋于稳定。通过疏水值的测定，反映出胰蛋白酶酶解产物具有较低的苦味，适宜作为一种低苦味肽进行生产。在此基础上，本试验通过单因素实验中，对豆粕肽分子质量分布的测定，可以更加直观的看出各种因素对酶解产物的影响。在响应面优化试验中，温度对酶解的影响不显著，与液态酶解有差异[29]，主要是因为固态酶解主要在烘箱中反应，设置的温度差与酶解物感受到的温度差有一定差距。
本试验采用半固态酶解豆粕工艺，通过豆粕肽得率、豆粕水解度、豆粕肽分子质量和荧光探针法确定的苦味值，综合考虑选出酶解效果较佳的胰蛋白酶进行酶解。通过单因素实验选取对酶解影响较大的3 个因素，然后通过响应面分析优化豆粕肽得率，得到最优的酶解条件：液固比为1 mL/g，豆粕质量为30 g，温度为50 ℃。本试验工艺简单，豆粕肽得率高，小分子肽占比高，操作成本低，在规模化生产中起着重要作用，为豆粕资源的合理开发利用提供理论参考。
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