新疆喀什塔什库尔干塔吉克自治县简称塔县[1]，它处于新疆东南部的帕米尔高原，距喀什市290 km，平均海拔4 000 m 以上，有特殊的地理环境，高原海拔，气候条件差。塔吉克族人民有独特的饮食文化，许多日常食品与维吾尔族相似。如使用牦牛奶、羊奶、牛奶、酥油等奶制品制作的酸奶、奶疙瘩、奶皮子、奶酪等是塔吉克族日常生活中必不可少的食品。奶酪是一种营养丰富，用途广泛的乳制品，是生鲜乳在发酵剂与凝乳酶作用下发生凝固并经一定时间成熟而制成的[2]。在日常生活中用牦牛奶手工制作奶酪，不同家庭手工制作方式不同，因此不同家庭做出来的奶酪质地、酸度都有所不同。牦牛乳奶酪因独特风味、较高的营养价值，而深受塔吉克族人民的喜爱。帕米尔高原因较偏远，人们生活方式独特，那里的发酵乳制品等很多饮食结构仍处于原生态，没有城市化和工业化的痕迹。传统发酵乳制品更是如此，仅用传统的发酵引子和手工容器。传统乳制品中蕴含着优质且独特的益生菌资源，有待研究。
随着人们对牦牛乳制品的关注，对微生物多样性以及乳酸菌和酵母菌分离方面的研究报道较多，而对帕米尔高原区域发酵乳制品中微生物多样性及微生物分离方面尚未有文献报道，是一个“研究盲区”。全面了解该地区传统发酵牦牛乳制品中微生物的多样性，挖掘优势微生物资源，具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 样品 从喀什帕米尔高原塔县地区不同牧民家庭中采集6 份发酵牦牛乳生奶酪。
1.1.2 试剂与培养基 改良MRS 培养基、MC 培养基、改良YGC 培养基，青岛高科园海博生物技术有限公司；全式基因组提取试剂盒（EE101-01），北京全式金生物技术有限公司；PCR 试剂盒，生工生物工程（上海）股份有限公司。
1.1.3 仪器与设备 生物显微镜（Ci-L 型），上海千欣仪器有限公司；PCR 仪（LNB48+型），上海皓庄仪器有限公司；离心机（BLF6 型），上海一恒科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 样本的准备 将6 份样本在无菌环境下分别装入灭菌处理的5 mL 离心管中密封，置于-80 ℃冰箱冻存。样本信息见表1。
表1 样本信息
Table 1 Sample information
1.2.2 样本高通量测序及数据分析 高通量测序由上海美吉生物医药科技有限公司完成，数据由上海美吉生物医药科技有限公司平台处理。所选引物见表2。
表2 引物表
Table 2 Primer table
1.2.3 菌株的分离纯化 取500 μL 混匀的样品加入4 500 μL 无菌生理盐水中，以稀释法进行梯度稀释。将样品梯度稀释后涂布于MRS、MC 和YGC 平板培养皿中，将MRS 和MC 平板培养皿置37 ℃培养48 h，YGC 平板培养皿置28 ℃培养48 h。挑取特征单菌落反复划线分离，直至可在显微镜下清晰看到纯菌种为止。将分离纯化的细菌进行革兰氏染色[3]，将酵母菌进行美兰染色[4]，并用甘油管保存于-80 ℃。
1.2.4 基因组DNA 提取及其电泳检测 基因组DNA 的提取：DNA 的提取步骤按基因组提取试剂盒说明书，并将提取的DNA 保存于-20 ℃。基因组DNA 电泳：采用1.0%的琼脂糖凝胶对提取的DNA 进行电泳，电压80 V，时长40 min[5]，观察电泳结果。
1.2.5 PCR 扩增细菌16S rDNA 序列和酵母菌26S rDNA D1/D2 隔间区序列
1）细菌16S rDNA 序列PCR 扩增体系[6]见表3。
表3 细菌16S rDNA 序列PCR 扩增体系及扩增程序
Table 3 PCR amplification system and procedure of 16S rDNA sequence of bacteria
PCR 产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，最终将PCR 产物寄到上海生工生物工程股份有限公司测序，并将得到的序列在NCBI 上使用BLAST进行相似序列搜索程序比对。
2）酵母菌26S rDNA D1/D2 隔间区PCR 扩增体系[7]见表4。
表4 26S rDNA D1/D2 隔间区PCR 扩增体系及扩增程序
Table 4 PCR amplification system and procedure of 26S rDNA D1/D2 region
PCR 产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳检测，将PCR 产物寄到上海生工生物工程股份有限公司测序，并将得到的序列在NCBI 上使用BLAST 进行相似序列搜索程序比对。
2 结果与分析
2.1 测序质量分析
细菌16S rDNA 基因V3-V4 区共获优化序列945 432，平均序列长度428 bp，所有序列按97%的相似度进行OTU 聚类，从18 个样本中共检测到1 界、5 门、7 纲、12 目、18 科、22 属、30 种、32 OTU；真菌ITS 区域共获优化序列1 302 962，平均序列长度281 bp，所有序列按97%的相似度进行OTU 聚类，从18 个样本中共检测到1 界、5门、15 纲、35 目、59 科、81 属、100 种、121 OTU。稀释曲线可用来比较测序数量不同的样本物种丰富度[8]。由图1a、1b 可知，不同奶酪样品的稀释曲线均趋于平缓，说明本次测序数据量充足，测序量合理，可用来研究细菌和真菌的群落结构。
图1 不同样本稀释曲线
Fig.1 Dilution curves of different samples
2.2 不同奶酪样品中微生物Alpha 多样性分析
常见的Alpha 多样性指数包括香农指数、辛普森指数、Chao1 指数、Ace 指数和Coverage 指数等[9]。群落丰富度指数包括Ace 指数和Chao1 指数，通常用这两个指标来衡量物种的丰富度。它们越大表示该样本中的物种越丰富。群落多样性指数包括香农指数和辛普森指数，通常用这两个指标来衡量样本的多样性。香农指数值越大，辛普森指数值越小表示群落多样性越高。Coverage 指数主要用来检测测序对物种的覆盖度，Coverage 指数值越高，样本中序列没被测出的概率越低。Coverage 指数反映样品测序结果是否具有真实性。
由表5 和表6 可知，D 号样品的Ace 指数最大，说明D 号奶酪样品中细菌和真菌最丰富。A 号样品的Chao1 指数最大，说明A 号奶酪样品中细菌和真菌的群落丰富度最大。A 号样品的香农指数最大，辛普森指数最小，说明A 号奶酪样品的细菌和真菌群落多样性相比其它奶酪样品要高。Coverage 指数对所有样本的覆盖率均在99%以上，说明样本测序结果具有真实性。
表5 不同样品细菌α-多样性分析
Table 5 Analysis of bacterial alpha diversity in different samples
注：同列不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
表6 不同样品真菌α-多样性分析
Table 6 Analysis of fungal alpha diversity in different samples
注：同列不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
2.3 不同奶酪样品中微生物群落在门和属水平上的组成分析
为了得知优势物种在个样本中的丰度和变化情况，对微生物的群落组成进行分析。
在门水平上，从6 份奶酪样本中共检测到5个细菌门【分别是厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidota）、蓝藻菌门（Cyanobacteria）、放线菌门（Actinobacteriota）】和5 个真菌门【分别是子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）、未分类的真菌类群（unclassified_k_Fungi）、被孢 霉门（Mortierellomycota）、新丽鞭菌门（Neocallimastigomycota）】，其中厚壁菌门为优势细菌门，子囊菌门为优势真菌门。
在属水平上，6 份奶酪样品中乳杆菌属（Lactobacillus）、链球菌属（Streptococcus）都占绝对优势。其中每组样品中乳杆菌属、链球菌属、醋酸杆菌属（Acetobacter）所占比例不同（图2 所示）。
图2 不同样品细菌属水平柱状图
Fig.2 Bar diagram of bacterial genus level in different samples
在属水平上，每组奶酪样品中微生物所占比例都有所不同，其中A 号和F 号样品中微生物最丰富。A 号样品中伊萨酵母属（Issatchenkia）占绝对优势，F 号样品中有孢圆酵母属（Torulaspora）占绝对优势，其它4 组样品中克鲁维酵母属（Kluyveromyces）占绝对优势（图3 所示）。
图3 不同样品真菌属水平柱状图
Fig.3 Bar diagram of fungal genus level in different samples
2.4 不同奶酪样品中微生物Beta 多样性分析
主坐标轴分析（Principalco-ordinates analysis），是一种对数据进行降维的非约束性分析方法，可反映不同样本的群落组成相似性和差异性[8]。
细菌PC1 贡献率为53.35%，PC2 贡献率为37.82%。6 份传统牦牛乳发酵生奶酪样品中A 号样品与其它5 组样品距离较远，说明具有差异性，然而B、C、D、E、F 相对较近，也有重叠现象，说明这5 组奶酪样品细菌群落结构具有相似性（图4所示）。
图4 基于加权Unifirac 距离的不同样品细菌PCoA 图
Fig.4 Bacterial PCoA diagram of different samples based on weighted unifirac distance
真菌PC1 贡献率为79.47%，PC2 贡献率为18.84%。6 份传统牦牛乳发酵生奶酪样品中A 和F 号样品与其它4 组样品距离较远，这说明A 号和F 号生奶酪样品中真菌的群落结构比较独立，且与其它4 份生奶酪样品的真菌群落结构之间是有一定的差异的，而B、C、D、E 有重叠现象，说明这4 组奶酪样品真菌群落结构具有相似性（图5所示）。
图5 基于加权Unifirac 距离的不同样品真菌PCoA 图
Fig.5 PCoA diagram of fungi in different samples based on weighted unifirac distance
2.5 菌株的分离与纯化
6 份传统牦牛乳发酵生奶酪中细菌和酵母菌有丰富的微生物多样性，研究发现其中细菌和酵母菌的总数在108～1012 CFU/g 之间。6 份奶酪样品，在改良的MRS 平板上共分离纯化得到46 株细菌，在MC 平板上共分离纯化得到6 株细菌，在改良YGC 平板上共分离纯化得到46 株酵母菌，观察菌株的形态学特征。菌株的菌落形态或大而凸起、或小而扁平，菌落颜色有白色或乳白色，菌落边缘整齐不透明。
2.6 16S rDNA 序列分析结果
以52 株细菌的基因组DNA 为模板，采用引物27F、1495R 扩增出16S rDNA 序列，并对扩增产物进行电泳，电泳条带在1 500 bp 左右。鉴定结果见表7。
表7 细菌鉴定结果
Table 7 Bacterial identification results
由表7 可知，52 株细菌经分子鉴定归属为7个属11 个种，其中TM-1、TM-7、TM-10、TM-25、TM-28 属于耐久肠球菌，TM-3、TM-16、TM-20、TM-24 属于粪 肠球菌，TM-9、TM-22、2TM-9、3TM-2、3TM-3、3TM-4、3TM-5、3TM-6、4TC-2、4TM-5、4TM-6、4TM-7、4TM-9、4TM-10、5TM-1、5TM-10、5TC-1、5TC-2、6TM-1、6TM-3、6TM-5、6TM-10、6TM-12 属于热 带芽孢杆菌，2TC-1、2TM-6、2TM-12、3TC-3 属于蜡样芽孢杆菌，5TC-3 属于类副粘杆菌，TM-26、TM-27、TM-31 属于副干酪乳杆菌，TM-30 属于鸡乳杆菌，TM-21 属于希腊假单胞菌，3TM-9 属于霍氏肠杆菌，3TM-1、3TM-10、3TM-11、4TM-1、4TM-11、5TM-3、6TM-6、6TM-8 属于细黄链霉菌，5TM-4 属于表皮葡萄球菌。
2.7 细菌系统发育树的构建
采用MEGA 7.0 软件构建系统发育树（Neighbor-Joining 法），结果如图6 所示。
图6 细菌系统进化树
Fig.6 Bacterial phylogenetic tree
2.8 26S rDNA D1/D2 隔间区序列分析结果
以46 株酵母菌的基因组DNA 为模板，采用通用引物NL1、NL4 扩增出26S rDNA D1/D2 隔间区序列，并对扩增产物进行电泳，电泳条带在600 bp 左右。鉴定结果见表8。
表8 酵母菌鉴定结果
Table 8 Yeast identification results
（续表8）
由表8 可知，46 株酵母菌经分子鉴定归属为8 个属9 个种，其中TY-6、TY-7 属于解脂耶氏酵母，TY-17 属于诞沫假丝酵母，TY-20 属于发酵毕赤酵母，2TY-1、2TY-2、2TY-3、2TY-4、2TY-5、2TY-6、2TY-7、2TY-8、2TY-10、3TY-1、3TY-2、3TY-3、3TY-4、3TY-5、3TY-6、3TY-8、3TY-11、4TY -1、4TY -2/4TY -3、4TY -4、4TY -8、5TY -3、5TY-4、5TY-5、5TY-6、5TY-8、5TY-9、5TY-10、6TY-1、6TY-4 属于库德毕赤酵母，TY-25 为普兰久浩酵母，2TY-9、4TY-9、6TY-6 属于异常威克汉逊酵母，4TY-5、4TY-6、4TY-11、5TY-1 属于马克思克鲁维酵母，5TY-2、5TY-6 属于东方伊萨酵母，6TY-2 属于酿酒酵母。
2.9 酵母菌系统发育树构建
将采用MEGA 7.0 软件构建系统发育树（Neighbor-Joining 法）。如图7 所示。
图7 酵母菌系统进化树
Fig.7 Yeasts phylogenetic tree
2.10 高通量测序与传统培养法在属水平上的比较
高通量测序结果与实验室通过传统培养方法分离鉴定出来的菌之间也有差异性，见表9。
表9 两种方法在属水平上的分析
Table 9 Analysis of two methods at genus level
由表9 可知，通过高通量测序技术检出的细菌和酵母菌除了链球菌属、醋酸杆菌属、有孢圆酵母属、地霉菌属、双足囊菌属、Banhegyia 酵母属以外，都可通过可培养的方法分离出来。未分离出的细菌和酵母菌说明传统培养方法的局限性，也有可能是选择的培养基不全面。今后可继续改良培养基以分离更多与高通量测序结果一致的优势菌。
3 结论与讨论
本文的高通量测序结果显示，细菌16S rDNA基因V3-V4 区共获得优化序列945 432。真菌ITS区域共获得优化序列1 302 962。在属水平上，优势细菌属为乳杆菌属和链球菌属，优势真菌属为克鲁维酵母属、有孢圆酵母属、伊萨酵母属和未分类的真菌类群。张冬蕾[10]通过高通量测序技术对新疆昭苏县和特克斯县采集酸牛奶样品中的微生物资源进行分析，在属水平上，乳杆菌属是优势细菌属，酿酒酵母属是优势真菌属；玛依拉·艾海提[9]对南疆传统酸奶中微生物多样性的分析表明，乳杆菌属和链球菌属为优势细菌属，酵母菌属和克鲁维酵母属为优势真菌属。本研究结果表明，喀什帕米尔高原牦牛乳传统发酵生奶酪微生物结构与其它地区发酵乳制品微生物结构有明显的差距，具有自己的微生物多样性。主坐标轴（PCoA）分析表明，6 份样品的群落结构之间既有相似性也有差异性，这是由不同家庭的手工制作方式和制作环境的不同所致。
通过在实验室纯培养方法分离鉴定了52 株细菌，将其归为7 个属11 个种；分离鉴定了46 株酵母菌，将其归为8 个属9 个种。这个结果说明塔县传统牦牛乳发酵奶酪中细菌和酵母菌资源种类丰富。刘珊春等[11]、Ao 等[12]在我国传统牦牛乳中发现了耐久肠球菌和副干酪乳杆菌。Dolci 等[13]在传统奶酪（Castelmagno PDO）中发现副干酪乳杆菌。不同地区乳制品中都发现耐久肠球菌、粪肠球菌和副干酪乳杆菌，说明本研究分离出来的耐久肠球菌、粪肠球菌、副干酪乳杆菌是生奶酪中常见的乳酸菌。肠球菌作为非发酵剂乳酸菌（NSLAB）存在于各种奶酪中[14]。副干酪乳杆菌广泛存在与奶酪中，不仅能增进发酵食品的营养价值，改善口感和风味，还能产生抗菌物质，延长发酵食品的保存时间[15]。Lopandic 等[16]、Jakobsen 等[17]在奶酪乳制品中发现了解脂耶氏酵母、诞沫假丝酵母、酿酒酵母和马克斯克鲁维酵母。李宇辉等[18]、芦文娟等[19]、王冠群等[20]、李王强等[21]、王远微等[22]在新疆传统奶酪乳制品中发现了发酵毕赤酵母、酿酒酵母、马克思克鲁维酵母、库德毕赤酵母、东方伊萨酵母。这说明本研究分离的解脂耶氏酵母、诞沫假丝酵母、发酵毕赤酵母、库德毕赤酵母、马克思克鲁维酵母、东方伊萨酵母、酿酒酵母是生奶酪乳制品中常见的酵母菌。解脂耶氏酵母中含有的大量脂肪酶和酯酶，是在奶酪成熟过程中发挥重要作用的分解脂肪的菌株之一[23]，这一特性需进一步研究。
本研究中还发现了热带芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、类副粘杆菌、希腊假单胞菌、鸡乳杆菌、霍氏肠杆菌、细黄链霉菌、表皮葡萄球菌等。Von 等[24]从生牛奶中分离出希腊假单胞菌。文献报道假单胞菌属是原料奶样品和半成品奶制品中最普遍和最丰富的属。这些菌在低温下生长良好，能分解乳中蛋白质导致牛乳胨化，分解脂肪导致牛乳产生哈喇味，引起乳制品腐败变质。帕米尔高原地区温度较低，为假单胞菌生长提供了良好的条件。霍氏肠杆菌是正常的肠道微生物。任冬艳等[25]在传统奶酪样品中发现了霍氏肠杆菌为优势菌群。王晓雯等[26]在塔城奶酪中发现了表皮葡萄球菌，它是滋生于生物体表面的一种正常细菌，大多数为非致病菌。这些细菌虽不是致病菌，但影响奶的质量和口感，它反映生奶酪制作过程中不良的卫生条件。
综上所述，喀什帕米尔高原塔县地区传统牦牛乳发酵生奶酪中微生物资源丰富。本研究结果为今后该地区传统发酵生奶酪微生物资源开发提供了参考。
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