四甲基吡嗪（2，3，5，6-Tetramethylpyrazine，TTMP）又名川芎嗪，最早是从中草药川芎的根茎中分离出来的一种生物活性成分，是可可豆或大豆发酵食品中检测到的主要吡嗪之一[1]，具有令人愉快的焙烤、坚果、可可等香气[2-3]，可以赋予食品特殊的风味，也是构成发酵食品酱香的重要物质基础[4-5]。此外，TTMP 具有扩张血管，改善微循环及抑制血小板积聚[6]，降低脑萎缩伤害[7]，防止肝纤维化等功效[8]，能赋予食品健康功能。目前，TTMP作为构成酱香风味的重要成分，受到食醋、白酒、酱油等发酵食品研究人员的广泛关注，其在发酵过程中的积累及其机制成为研究热点[9-11]。有研究发现中国白酒中TTMP 的产生与微生物的代谢密切相关，而非过去认为的美拉德反应[12]。积累TTMP 的微生物以及其生物合成机制成为研究重点。
芽胞杆菌是发酵食品中常见的微生物。近年来，Zhu 等[13]从酱香型白酒高温大曲中筛选出1 株枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）XZ1124，经优化其TTMP 积累量达4.08 g/L。吴博华等[14]从高盐稀态酱醪中筛选出3 株具有吡嗪类物质积累能力的菌株，发现贝莱斯芽胞杆菌（B.velezensis）合成TTMP 的能力最强。可以看出，芽胞杆菌对发酵食品中TTMP 的积累具有良好的促进作用。贝莱斯芽胞杆菌是近几年在发酵食品中筛选发现的具有TTMP 积累潜力的菌种，其在酱油[15]、豆瓣酱[16]、醋[17]中均被发现具有提升酱香风味的作用。然而，贝莱斯芽胞杆菌是2016 年才获得种的地位[18]，对其在发酵食品中的基础研究及相关代谢机制还不明晰，阻碍了其在发酵食品中增进酱香的应用。随着测序技术的发展，基因组学研究特别是功能基因组学研究在发掘菌种功能特性[19]、注释代谢途径及调节机制上发挥了较大的作用[20]，为优良菌种的利用奠定了良好的理论基础。Chandrima 等[21]通过对阿氏芽胞杆菌（Bacillus aryabhattai AB211）的全基因组测序、注释和分析，预测出AB211 的部分代谢能力并得到验证，这说明贝莱斯芽胞杆菌利用基因信息来指导TTMP 的生物合成具有可行性。本研究对筛选自高盐稀态酱醪的贝莱斯芽胞杆菌CS1.13 开展基因组学研究，注释生物合成TTMP 相关基因，结合发酵试验分析TTMP 的合成通路及影响其积累的关键物质。通过添加代谢通路中的关键物质对TTMP 积累实施调控，为有效提升发酵食品的酱香风味，增进健康功能奠定基础。
1 材料和方法
1.1 试验材料
1.1.1 菌种与原料 菌种：贝莱斯芽胞杆菌（Bacillus velezensis）CS1.13，分离自湖南某酱油厂的高盐稀态酱醪，由湖南省调味品发酵工程技术研究中心（长沙理工大学分中心）保藏。原料：蒸煮豆粕、焙炒小麦（炒麦），湖南某酱油厂。
1.1.2 主要药品与试剂 2-甲基-3-庚酮（色谱纯），德国Dr.Ehrenstorfer 公司；TTMP（98%），上海麦克林生化科技有限公司；乙偶姻（Acetoin，ACT）（97%），上海麦克林生化科技有限公司；2，5-二甲基吡嗪（2，5-Dimethylpyrazine，2，5-DMP）（98%），上海麦克林生化科技有限公司；2，3，5-三甲基吡嗪（2，3，5-Trimethylpyrazine，2，3，5-TMP）（99%），上海麦克林生化科技有限公司；2，3-丁二醇（分析纯级），西安天茂化工有限公司；2，3-丁二酮（双乙酰）（98%），上海麦克林生化科技有限公司；氢氧化钠（分析纯级），广东光华化学厂有限公司，甲醛（分析纯级），湖北奥生新材料科技有限公司；丙酮酸（98%），上海麦克林生化科技有限公司；醋酸（分析纯级），上海埃彼化学试剂有限公司；其它药品与试剂均为分析纯级，国药集团化学试剂有限公司。
1.1.3 培养基 种子培养基：蛋白胨10 g/L、牛肉膏3 g/L、NaCl 5 g/L，pH 7.0～7.2，121 ℃灭菌20 min；
发酵培养基：蒸煮豆粕∶炒麦∶水以10∶5∶4质量比混匀后取30 g 装入250 mL 锥形瓶，自然pH，121 ℃灭菌20 min。
1.2 仪器与设备
436GC/EVOQ TQ/PAL 气相色谱-质谱联用仪，美国Bruker Daltonics 公司；DB-5MS 色谱柱，美国Agilent 公司；PE28 pH 计，上海梅特勒-托利多仪器有限公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS 固相微萃取针，美国Supelco 公司；ZWY-2102C 恒温振荡培养箱，上海智城分析仪器制造有限公司；LRH-250 型生化培养箱，上海一恒科技有限公司；SW-CT-2F 型无菌操作台，上海博讯实业有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 基因注释 贝莱斯芽胞杆菌CS1.13 基因序列已上传至 NCBI SRA 数据库（SRR 23959637），采用Glimmer 对基因组中的编码序列（CDS）进行预测。采用BLAST、Diamond、hmmscan等软件对Glimmer 预测结果进行GO（Gene ontology）注释、COG（Clusters of orthologous groups of proteins）注释、KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）注释和碳水化合物活性酶（CAZyme）注释。
1.3.2 种子培养 将保藏的贝莱斯芽胞杆菌CS1.13 斜面活化并转接至种子培养基中，37 ℃，180 r/min 培养14 h，用无菌生理盐水离心洗涤菌液3次，制成浓度为108 CFU/mL 的种子悬液，备用。
1.3.3 TTMP 固态发酵 将制备好的种子悬液以8%的接种量接入TTMP 发酵培养基中，40 ℃恒温发酵72 h，分别取培养8，16，24，32，40，48，56，64，72 h 的发酵样测定其生物量、pH 值、还原糖、总糖、氨基酸态氮、总酸含量及TTMP 的积累量。
1.3.4 发酵调控试验 向灭菌后的TTMP 发酵培养基中接种8%的种子悬液，在发酵前分别添加关键物质：质量浓度为0，2，4，6，8，10 mg/g 的苏氨酸；0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/g 的醋酸、丙酮酸和0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0 mg/g 的2，3-丁二醇，于40℃恒温发酵72 h。取72 h 发酵样，测定生物量及TTMP 生物合成途径中关键挥发性物质含量。
1.4 分析方法
1.4.1 CS1.13 生物量的测定 生物量测定采用倾注倒平板法[22]。选择1.00 g 样品，用生理盐水梯度稀释，选择合适的稀释菌液1.00 mL 于无菌平皿中，倒入融化后冷却至45 ℃的牛肉膏蛋白胨培养基，混合均匀，待凝固后于37 ℃培养箱倒置培养24 h，计数，结果以CFU/g 样品（干质量）计。
1.4.2 发酵培养基pH 值的测定 取1.00 g 样品加入30 mL 去离子水研磨，充分混匀后测定pH值。
1.4.3 发酵培养基还原糖、总糖、氨基酸态氮及总酸的测定 还原糖：参照《食品中还原糖的测定》（GB 5009.7-2016）的直接滴定法[23]；总糖：参考武平等[24]的3，5-二硝基水杨酸法测定；氨基酸态氮：参照《食品中氨基酸态氮的测定》（GB 5009.235-2016）的甲醛滴定法；总酸：参照《食品中氨基酸态氮的测定》（GB 5009.235-2016）的氢氧化钠滴定法[25]，结果均以g/kg 样品（干质量）计。
1.4.4 TTMP 及关键挥发性物质的测定（外标法）
1）样品处理 准确称取1.00 g 固态发酵样于50 mL 离心管中，加水稀释16 倍，振荡混匀后4 000 r/min 离心10 min，取上清2 mL 于20 mL 顶空瓶中，加入质量分数为30%的NaCl，最后添加5 μL 质量浓度为0.816 μg/μL 的2-甲基-3-庚酮作为内标物。
2）样品分析 采用SPME-GC-MS 方法测定。进样条件：振荡器温度50 ℃，样品加热振荡10 min，吸附萃取20 min，解析5 min；色谱条件：进样口温度250 ℃，传输线温度250 ℃，柱温箱起始温度40 ℃，保持4 min，以5 ℃/min 升温至120℃，保持2 min，再以15 ℃/min 升温至230 ℃，保持4 min，载气为高纯氦气，流速1.0 mL/min，无分流。质谱条件：EI 源，电子能量70 eV，发射电流200 μA，离子源温度250 ℃，质量扫描范围（m/z）30～500。
3）标准曲线 以不同浓度TTMP、2，3，5-TMP、2，5-DMP、ACT、2，3-丁二醇、双乙酰标准品的质量浓度为横坐标，以上述物质与内标物2-甲基-3-庚酮的峰面积之比为纵坐标绘制标准曲线，得到标准曲线的回归方程，分别为：TTMP：y=0.9323x+1.8649（R2=0.9993）；2，3，5-TMP：y=0.925x+1.7342（R2=0.9991）；2，5-DMP：y=1.1176x+1.8329（R2=0.9990）；ACT：y=0.9123x-0.8568（R2=0.9987）；2，3-丁二醇：y=0.9381x -1.3055（R2=0.9982）；双乙酰：y=0.8483x+0.1314（R2=0.9984），结果以mg/kg 样品（干质量）计。
1.5 数据分析
采用Origin 2022 绘图；挥发性物质含量数据经标准化处理，用TBtools 软件绘制热图。
2 结果与分析
2.1 CS1.13 碳氮代谢能力及合成TTMP 相关基因分析
2.1.1 CS1.13 代谢能力基因组学分析 TTMP 是含2 个对称氮原子的六元杂环化合物，其生物合成需要充足的碳源及氮源。对贝莱斯芽胞杆菌CS1.13 的前期研究表明其具有良好的淀粉和蛋白质的水解能力[13]，为TTMP 的合成提供了丰富的小分子碳源及氮源。为进一步发掘其TTMP 的积累潜力，采用COG 注释及GO 注释从基因组水平对其进行碳、氮代谢能力的研究，结果见图1 和图2。
图1 COG 注释分类统计图
Fig. 1 COG annotation classification statistics chart
图2 GO 注释分类统计图
Fig. 2 GO annotation classification statistics chart
由图1 可知，COG 数据库共注释到3 004 个基因，占所预测基因总数的72.19%。去掉COG 基因注释中功能未知的基因数量，对剩余基因进行功能分类，注释到CS1.13 参与氨基酸代谢及转运（Amino acid transport and metabolish）的相关基因292 个，碳水化合物代谢及转运（Carbohydrate transport and metabolish）的相关基因224 个，转录（Transcription）相关基因236 个。除未知功能基因外，上述3 类已知功能基因位居注释基因数量的前三，分别占12.98%，9.96%，10.49%，表明CS1.13 具有较完善的碳水化合物及氨基酸代谢途径，能够提供充足的碳源和氮源，具有TTMP 生物合成的基础能力。
由图2 可知，GO 数据库共注释到2 765 个基因，占预测基因总数的66.45%。其中归类为膜的整体组成（Integral component of membrane）、ATP结合（ATP binding）、氧化-还原过程（Oxidationreduction process）、细胞质（Cytoplasm）、DNA 结合（DNA binding）和细胞质膜（Plasma membrane）的基因数量最多，分别为837，322，302，280，262，196 个基因，占注释基因总数的72.19%，7.74%，7.26%，6.73%，6.30%，4.71%，说明CS1.13 在物质跨膜运输、维持胞内渗透压平衡等功能上有明显优势。加之能分泌大量胞外淀粉酶及蛋白酶，其作用产生充足的小分子碳源及氮源能顺利进入胞内，为TTMP 生物合成提供底物。
2.1.2 CS1.13 碳水化合物活性酶基因组学分析CAZy 数据库是关于合成或分解复杂碳水化合物和糖复合物的一个酶类数据库，为了更详细了解贝莱斯芽胞杆菌CS1.13 的碳水化合物降解能力，利用CAZy 数据库对CS1.13 编码的碳水化合物活性酶基因进行注释，结果见表1。CS1.13 编码碳水化合物活性酶基因共122 个，其中编码糖苷水解酶基因数量最丰富，其次是糖基转移酶和碳水化合物酯酶，这3 种基因分别占碳水化合物活性酶基因总数的36.07%，31.15%，23.77%。糖苷水解酶作用于碳水化合物之间的糖苷键，将大分子多糖水解为小分子糖，为CS1.13 提供可发酵性糖，从而更有利于TTMP 的合成。
表1 碳水化合物活性酶注释详情表
Table 1 Table of details of carbohydrate-active enzyme annotation
2.1.3 CS1.13 合成TTMP 通路分析 KEGG 数据库中丰富的通路信息有助于从系统水平了解CS1.13 合成TTMP 相关基因的生物学功能。使用Diamond 比对软件对CS1.13 合成TTMP 通路相关基因进行对比注释，结果见图3（方框内为基因注释到的TTMP 合成相关通路）。从图3 可以看出，CS1.13 的丁酸代谢途径中被注释到完整的TTMP关键底物——ACT 的代谢通路。其中24 个基因参与丁酸代谢，包括与ACT 合成直接相关的乙酰乳酸合酶基因（IlvB）和乙酰乳酸脱羧酶基因（AlsD），以及代谢支路中可能影响ACT 产量的丁二醇脱氢酶基因/双乙酰还原酶基因（ButB）。通过KEGG注释可以预测贝莱斯芽胞杆菌CS1.13ACT 的代谢途径是由葡萄糖经糖酵解生成丙酮酸，再由乙酰乳酸合成酶缩合合成乙酰乳酸，最后通过乙酰乳酸脱羧酶脱羧形成ACT。该合成途径为CS1.13 在氨/铵及质子供体存在下缩合ACT 形成TTMP 提供了物质基础。除此外，基因信息还注释到2，3，5-TMP 及2，5-DMP 的前体物质氨基丙酮的合成通路。从图3 可以看出L-苏氨酸经苏氨酸脱氢酶生成L-2-氨基乙酰乙酸，L-2-氨基乙酰乙酸通过非酶促反应可直接生成氨基丙酮，这为CS1.13 合成2，3，5-TMP 及2，5-DMP 提供了理论基础。在CS1.13 注释到的L-苏氨酸代谢通路中还发现苏氨酸脱氨酶，L-苏氨酸经苏氨酸脱氨酶生成α-酮丁酸，并产生TTMP 合成所需要的氨，证明氨基酸代谢可为TTMP 合成提供氨基供体。
图3 菌株CS1.13 中KEGG 注释的ACT 生物合成通路
Fig. 3 ACT biosynthetic pathway of KEGG annotation in strain CS1.13
2.2 CS1.13 发酵过程参数变化及TTMP 合成情况分析
TTMP 是氮杂环化合物，其合成需要充足的碳源及氮源。结合菌株CS1.13 具有良好的碳氮代谢能力及TTMP 合成基础的基因注释特征，选择富含蛋白质的豆粕和富含淀粉的小麦作为原料对菌株CS1.13 进行TTMP 发酵研究，其发酵过程参数变化及TTMP 的积累见图4 和图5。
图4 发酵过程中生物量、pH 及总酸变化
Fig. 4 The changes of biomass，pH and total acid during fermentation
图5 发酵过程中还原糖、总糖、氨基酸态氮及TTMP 含量变化
Fig. 5 The changes of reducing sugar，total sugar，amino acid nitrogen and TTMP content during fermentation
由图4 可知，发酵0～16 h 时生物量快速升高，最高达1.48×1010 CFU/g；发酵16～32 h 时，生物量快速降低，pH 也从开始的6.69 降至5.92，推测可能是酸性环境不利于CS1.13 的生长；发酵32～72 h 时，pH 变化较小，维持在5.80 左右，生物量维持在107 CFU/g 左右。总酸含量在整个发酵过程中持续升高，不仅利用部分碳源，而且造成pH 值降低。过酸的环境不利于TTMP 的合成，豆粕中氮源丰富，充足的氮源降解生成氨基酸，而氨基酸脱氨作用产生的氨既为TTMP 的合成提供了氮源，又中和了部分酸性物质，缓和碳源降解过程中形成的有机酸导致pH 值下降带来的不利影响，从而保证菌株CS1.13 积累产物所需的生物量。
由图5a 可知，发酵0～16 h 时，还原糖从12.16 g/kg 快速升至最高值141.99 g/kg，分析原因是CS1.13 快速增殖，产生大量的胞外淀粉酶，促进淀粉的分解；发酵16～72 h 时，还原糖开始波动并趋于稳定，这主要是由于还原糖的生成和消耗达到动态平衡的结果；总糖含量则由发酵开始时的528.90 g/kg 降至416.99 g/kg，说明CS1.13 将原料中的淀粉水解成可发酵性糖并利用可发酵性糖，CS1.13 碳代谢的通畅为TTMP 合成提供了碳架供体，同时也证实基因注释的结果。由图5b 可知，发酵0～72 h，氨基酸态氮含量一直上升，最高达11.87 g/kg。氨基酸态氮的不断积累为TTMP 的生成提供了部分氨基供体，因此发酵过程中TTMP处于持续积累状态，72 h 时产量最高，为159.86 mg/kg。可以看出，CS1.13 的氮代谢能力对TTMP积累起良好的支撑作用，证实基因注释的氮代谢特征。
2.3 CS1.13 TTMP 生物合成的发酵调控
根据KEGG 注释到的TTMP 合成通路（见图3），可以发现苏氨酸不仅是2，5-DMP 及2，3，5-TMP 合成的前体——氨基丙酮的重要供体物质，而且苏氨酸可以通过苏氨酸脱氨酶为TTMP 供给氨，促进TTMP 的合成。有文献报道[26-27]，ACT 和氨进一步反应生成Schiff 碱（氨基酮）的过程需要质子供体参与，可以选择常见的质子供体——醋酸、丙酮酸来探索其对TTMP 生成的促进作用。此外，KEGG 注释到丙酮酸还可作为α-乙酰乳酸的前体，促进ACT 的生成，从而提高TTMP 的积累量。从KEGG 注释到的CS1.13 ACT 合成通路中发现，2，3-丁二醇可通过2，3-丁二醇脱氢酶与ACT互相转化，进而影响TTMP 的合成。综上，选择苏氨酸、醋酸、丙酮酸及2，3-丁二醇作为发酵调控物质来探究其对TTMP 积累的影响。
添加苏氨酸的发酵结果如图6a 所示。随着苏氨酸添加量的增多，TTMP 含量增加，当添加量为2 mg/g 时，TTMP 含量达最高值370.10 mg/kg，较对照组提高了32.82%，其原因是由于苏氨酸通过苏氨酸脱氨酶作用生成氨，2 分子ACT 在氨存在下缩合生成TTMP，促进TTMP 的积累。随着苏氨酸添加量的增多，TTMP 含量开始下降，而2，5-DMP及2，3，5-TMP 含量持续增加，最高分别达1 029.57 mg/kg 和542.89 mg/kg，分析原因是苏氨酸通过苏氨酸脱氢酶作用生成L-2-氨基乙酰乙酸，进一步生成氨基丙酮，氨基丙酮可以自发脱水缩合生成3，6-二氢-2，5-二甲基吡嗪，后者很容易被氧化生成2，5-DMP[28-29]，这时2，5-DMP 积累量上升；同时，氨基丙酮也可与ACT 生成的2-氨基-3-丁酮经脱水缩合成2，3，5-TMP，从而提高2，3，5-TMP产量。由于较多的ACT 及氮源被2，5-DMP 与2，3，5-TMP 所利用，最终影响TTMP 的合成，导致TTMP 含量降低。随着苏氨酸添加量的增加，3 种吡嗪积累量之和与CS1.13 生物量也随之增加，CS1.13 的生物量由5.70×109 CFU/g 增至1.20×1010 CFU/g，说明适量添加苏氨酸有利于CS1.13 的生长及吡嗪类物质的积累。
图6 关键物质添加对TTMP 生物合成途径中生物量及各物质产量的影响
Fig. 6 Effects of key substances addition on the biomass and yield of substances in TTMP biosynthesis pathway
注：标尺Ⅰ表示通过0-1 标准化（
）后的生物量【lg（CFU/g）】，标尺Ⅱ表示通过0-1 标准化（
）后的挥发性物质含量（mg/kg）。
添加醋酸的发酵结果如图6b 所示。当醋酸添加量为0.2 mg/g 时，TTMP 含量最高达307.34 mg/kg，较对照组提高了10.30%，可能是由于添加少量醋酸，提供了质子供体，促进ACT 和氨反应，同时醋酸为发酵培养基增加了碳源，从而提高了TTMP 的积累量。随着醋酸添加量的增多，TTMP含量降低，3 种吡嗪积累量之和也随之降低，生物量呈持续增加，主要是因为酸性环境不利于TTMP生成，而从生物量的变化情况看，酸性环境未造成CS1.13 生物量下降。
添加丙酮酸的发酵结果如图6c 所示。当丙酮酸添加量为0.2 mg/g 时，TTMP 含量最高达781.69 mg/kg，较对照组提高了222.46%，其原因是由于丙酮酸是α-乙酰乳酸的前体，其促进乙酰乳酸和ACT 的合成，同时丙酮酸也为TTMP 的合成提供质子供体，从而提高了TTMP 的积累量。随着丙酮酸添加量的增多，TTMP 含量降低，3 种吡嗪积累量之和也随之降低，生物量持续增加，再次说明酸性环境对CS1.13 TTMP 的合成不利。
添加2，3-丁二醇的发酵结果如图6d 所示。随着2，3-丁二醇添加量的增多，TTMP 含量增加，当添加量为0.8 mg/g 时，TTMP 产量最高达632.54 mg/kg，较对照组提高了160.93%，其原因是2，3-丁二醇脱氢酶催化2，3-丁二醇与ACT 的可逆平衡反应，少量添加2，3-丁二醇促进平衡，利于ACT 的积累，进而提高了TTMP 的积累量。随着2，3-丁二醇添加量的增多，TTMP 产量开始降低，然而，较对照组仍有所提高，此时ACT 积累，反馈调节了乙酰乳酸合成ACT 的途径，过量的ACT 则流向双乙酰的合成，导致双乙酰含量增加，而3 种吡嗪积累量之和也呈先升后降的趋势。适量添加2，3-丁二醇有利于增加CS1.13 的生物量。
3 结论
在完成贝莱斯芽胞杆菌CS1.13 全基因测序的基础上，对其进行COG、GO、碳水化合物活性酶注释，结果发现CS1.13 参与氨基酸代谢及转运、碳水化合物代谢及转运，编码糖苷水解酶基因丰富，结合发酵过程中还原糖、总糖、氨基酸态氮及TTMP 含量等变化，说明CS1.13 具有良好的碳源及氮源代谢能力及TTMP 合成潜力。KEGG 注释TTMP 关键前体物质ACT 的代谢通路，预测CS1.13 生物合成TTMP 及其相关产物的途径，筛选苏氨酸、醋酸、丙酮酸及2，3-丁二醇等关键物质，并研究其TTMP 生物合成的调控，结果发现随着上述物质添加量的增加，CS1.13 的TTMP 积累量呈先升后降的趋势，除氨基供体苏氨酸外，碳架供体醋酸、丙酮酸或2，3-丁二醇在较低浓度下更利于3 种吡嗪（TTMP、2，5-DMP 及2，3，5-TMP）的积累，过多的碳架供体反而有利于丁二酮系化合物的积累。基因注释与发酵试验的结合证实贝莱斯芽胞杆菌CS1.13 的TTMP 生物合成途径及其部分调控特征，这为进一步提高菌株TTMP 等吡嗪类物质积累提供了一条可行的途径。随着代谢组学方法的发展，将进一步明晰TTMP 的生物合成途径，为其高效积累提供更为系统的调控方案。
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