微生物污染是导致食品腐败和致病的主要原因，食源性腐败菌不仅会降低食品的营养价值，还会产生有害化合物，如亚硝酸盐和亚硝胺[1]、苯酚[2]、硫化氢[3]等，对人体肝、肾和中枢神经系统造成损害并诱发癌症[4-6]。此外，一些食源性致病菌，例如志贺氏菌[7]和沙门氏菌[8]可引起呕吐、腹泻，中毒甚至死亡[9-10]，严重危害人类健康和经济发展。据世界卫生组织（WHO）统计，全球每年有6 亿人因食品污染而患病，由食品腐败造成的经济损失多达几百亿美元[11-12]。防控食品微生物污染是确保食品安全的重要措施，而食品防腐剂的应用是常见的手段。目前的食品防腐剂一般分为化学防腐剂和天然生物防腐剂两大类。天然生物防腐剂具有高效、安全、环境友好等诸多化学防腐剂无法比拟的优势，是当前防腐剂行业的发展重点。天然的生物防腐剂按来源可分为植物、动物和微生物源三大类[13]。其中微生物源的防腐剂因微生物种类丰富，繁殖周期短，生长条件要求低，成为天然生物防腐剂的重要来源以及新型天然防腐剂的重要发展方向[14]。
微生物源防腐剂主要来源于具有抑菌防腐功效的微生物本身或其产物，具有安全无毒、天然高效的特点，可通过微生物大规模培养进行工业化生产[15]。微生物源防腐剂中的微生物主要是一些食品发酵菌，其在食品发酵过程中，不仅能赋予食品特殊的风味以及益生功能[16-18]，还通过产生乳酸[19-20]、乙酸[21]、苯乳酸[22]、细菌素[23]等代谢物及多肽抑制食源性腐败菌的生长及繁殖，实现对食品的抑菌防腐，这些既能促进发酵又能实现抑菌防腐的微生物被称为抑菌功能微生物，主要是发酵食品中的乳酸菌等产酸细菌。Divyashree 等[24]筛选具有益生功能的干酪乳杆菌（MYSRD 108）和植物乳杆菌（MYSRD 71），这两株菌的无细胞上清液均能抑制副伤寒沙门氏菌，使副伤寒沙门氏菌生物膜减少75%以上。张欢等[25]研究了植物乳杆菌等5 株乳酸菌和1 株木糖葡萄球菌的发酵液对产气荚膜梭菌的抑制作用，发现植物乳杆菌因具备产酸和细菌素的能力，故能有效抑制产气荚膜梭菌的芽胞萌发和生长。姚佳明[26]诱变获得解淀粉芽胞杆菌B815-1 能产生Surfactin、六肽等多种抑菌成分，随着纯化过程中单一成分纯度的提高，抑菌活性反而降低，进一步试验发现Surfactin、六肽和乳酸存在抑菌的协同增效作用。可以看出，乳酸菌以及具有发酵作用的葡萄球菌等产酸细菌能发酵产生多种抑菌物质，其粗发酵液具有抑菌功能，直接使用不仅成本低廉，还具有多种物质协同抑菌的优势，成为抑菌功能微生物应用的发展方向。本文以分离自发酵食品中的产酸细菌为研究对象，筛选抑菌功能微生物，研究其发酵液抑菌的影响因素以及抑菌物质组成，为其抑菌性能提升及在食品防腐方面的应用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌种 菌株：植物乳杆菌（Lactobacterium plantarum）L04-1，腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）JL03、JL03 -1，香料葡萄球菌（Staphylococcus condimenti）JL04、JL20，鱼发酵葡萄球菌（Staphylococcus piscifermentans）JL15，肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）JL06、JL07、JL10、JL11、JL12、JL13、JL14、JL16、JL17、JL19，分离自高盐稀态酱醪和泡菜样品，保藏于湖南省调味品发酵工程技术研究中心。指示菌株：地衣芽胞杆菌（Bacillus licheniformis）、巨大芽胞杆菌（Bacillus megaterium）分离自变质酱油，保藏于湖南省调味品发酵工程技术研究中心；变形杆菌（Proteus species）（CCTCC AB 91103）、伤寒沙门氏菌（Salmonella typhi）（CCTCC AB 94010）、大肠杆菌（Escherichia coli）（CCTCC AB 93154）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）（CCTCC AB 91093），中国典型培养物保藏中心。
1.1.2 培养基与试剂 MRS 液体培养基：蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母膏3 g、柠檬酸氢二铵2 g、葡萄糖40 g、氯化钠5 g、乙酸钠5 g、磷酸氢二钾2 g、硫酸镁0.58 g、硫酸锰0.25 g、吐温-80 1 mL、蒸馏水1 000 mL，pH 6.5。牛肉膏蛋白胨培养基[27]，不添加琼脂粉为液体培养基，添加质量分数1%的琼脂粉为半固体培养基。
乳酸链球菌素A（Nisin A，BR，900 IU/mg），广州佳途科技股份有限公司；乳酸（HPLC），美国斯坦福化学制剂有限公司；草酸（AR）、L-苹果酸（98%）、柠檬酸（AR）、琥珀酸（AR）、甲酸（AR）、硫酸锌（AR）、亚铁氰化钾（AR），国药集团化学试剂有限公司；乙酸（AR）、富马酸（AR）、甲醇（HPLC）、磷酸（AR），上海麦克林生化科技有限公司；其它试剂均为分析纯级，购自国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
FE28 pH 计，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；Eppendorf 5424R 高速台式冷冻离心机，德国Eppendorf 公司；ZWY-2102C 恒温振荡培养箱，上海智城分析仪器制造有限公司；岛津LC-20A高效液相色谱仪，日本岛津公司；Elipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，美国Agilent 公司。
1.3 试验方法
1.3.1 菌种培养
1.3.1.1 试验菌株的培养及抑菌液的制备 将保存在甘油冻管中的试验菌株活化后转接至MRS液体培养基中，37 ℃，180 r/min 摇瓶培养24 h 制备种子液，调整种子液菌悬浓度至108 CFU/mL，以体积分数1%的接种量转接至MRS 液体培养基中，37 ℃，180 r/min 摇瓶发酵48 h，4 000 r/min 冷冻离心10 min，取上清用0.22 μm 滤膜过滤所得的无细胞滤液即抑菌液，4 ℃冰箱冷藏备用。
1.3.1.2 指示菌活化 将指示菌活化后接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37 ℃，180 r/min 摇瓶培养24 h，调整菌悬浓度为107 CFU/mL。
1.3.2 抑菌效价（Antibacterial potency，AP）测定
1.3.2.1 抑菌圈试验（牛津杯法）参照翟佳琳等[28]的研究方法，改进如下：在Φ15 cm 平皿中倒入50 mL 牛肉膏蛋白胨固体培养基，凝固后均匀置于牛津杯中，将200 μL 指示菌悬液与50 mL 牛肉膏蛋白胨半固体培养基混匀倒入平皿上层，冷却后拔出牛津杯，每孔加入100 μL 抑菌液，加样后将平皿置4 ℃冰箱冷藏扩散4 h，37 ℃静置培养8 h。按式（1）计算抑菌圈面积S（mm2）。
式中
为抑菌圈直径的平均值，mm
为牛津杯孔直径的平均值，mm。
1.3.2.2 抑菌液效价 参照Delgado 等[29]的方法，以不同浓度Nisin A 标准品对应的抑菌效价（AP0）的对数值为横坐标，抑菌面积（S）为纵坐标，绘制Nisin A 对巨大芽胞杆菌的抑制活性标准曲线，该曲线的拟合方程为：S=172.52lgAP0-333.58（R2=0.9950）。以Nisin A 为基准，按式（2）计算待测抑菌液的抑菌效价AP1（IU/mL）。
式中：S 为抑菌液进行抑菌圈试验的抑菌面积，mm2。
1.3.3 抑菌液稳定性研究
1.3.3.1 抑菌液的酸碱稳定性 调节抑菌液的pH 值分别为1.0，3.0，5.0，7.0，9.0，11.0，保持3 h后调回其初始pH 值，以未处理的抑菌液为对照，测定抑菌效价的变化情况。
1.3.3.2 抑菌液的热稳定性 分别采用20，40，60，80，100 ℃水浴处理抑菌液20 min，以未处理的抑菌液为对照，测定抑菌效价变化情况。
1.3.3.3 抑菌液的紫外照射稳定性 使用30 W的紫外灯分别照射抑菌液1，2，3，4，5 h，距离25 cm，以未照射的抑菌液为对照，测定抑菌效价变化情况。
1.3.4 抑菌液中的抑菌物质研究
1.3.4.1 抑菌液的排酸试验 分别调节抑菌液的pH 值为4.0 与6.5，空白MRS 液体培养基的pH值为4.0，按照图1 进行排酸试验并测量抑菌圈直径d1、d2、d3，横向排布3 孔为平行试验。d1 表示酸性物质及非酸物质的抑菌能力，d1-d2 表示酸性物质抑菌能力，d1-d3 表示非酸物质抑菌能力。
图1 抑菌物质类型判别试验原理示意图
Fig. 1 Principle diagram of antibacterial substance type discrimination test
1.3.4.2 抑菌液中酸性抑菌物质分析 有机酸标准曲线：称取草酸0.20 g、L-苹果酸0.075 g、乙酸0.20 g、柠檬酸0.10 g、琥珀酸0.05 g、富马酸0.05 g、甲酸0.20 g、乳酸0.20 g，定容100 mL，配制混标液。将混标液稀释成浓度梯度液，以各有机酸的出峰时间为横坐标，响应值为纵坐标，绘制有机酸分离色谱图（图2）。以各有机酸的浓度为横坐标，出峰面积为纵坐标，得到8 种有机酸标准曲线的回归方程，见表1。
表1 有机酸标准曲线
Table 1 Organic acid standard curve
图2 标准有机酸分离液相色谱图
Fig. 2 Standard organic acid separation liquid chromatogram
样品准备与色谱条件：取2 mL 抑菌液与5 mL 硫酸锌溶液、5 mL 亚铁氰化钾溶液混合定容100 mL，静置30 min 除去蛋白杂质后取上清，用0.22 μm 滤膜过滤。以V（0.1%磷酸）∶V（甲醇）=95 ∶5）为流动相，流速0.6 mL/min 进行等度洗脱，进样量10 μL，柱温30 ℃，扫描时间15 min，紫外检测波长210 nm。
1.3.5 抑菌液与有机酸混合液效价比较 按照1.3.1.1节处理，分别获得菌株JL03 和L04-1 的抑菌液。按菌株JL03 抑菌液中各有机酸质量浓度（草酸0.35 g/L，L-苹果酸0.38 g/L，乳酸4.64 g/L，乙酸2.66 g/L，柠檬酸0.23 g/L，琥珀酸0.30 g/L，富马酸0.25 g/L）配制有机酸混合液A1，以巨大芽胞杆菌为指示菌对比测定JL03 抑菌液与有机酸混合液A1 的抑菌效价。按菌株L04-1 抑菌液中各有机酸质量浓度（草酸1.10 g/L，L-苹果酸1.17 g/L，乳酸4.55 g/L，乙酸3.44 g/L，柠檬酸0.61 g/L，琥珀酸1.51 g/L，富马酸0.53 g/L）配制有机酸混合液A2，以巨大芽胞杆菌为指示菌对比测定L04-1 抑菌液与有机酸混合液A2 的抑菌效价。
1.3.6 数据分析 采用Excel 2021 进行数据平均值及标准差计算，采用Origin 2021 进行数据可视化分析，采用SPSS 软件进行差异显著性检验和多重比较。
2 结果与分析
2.1 抑菌功能微生物筛选结果
为了得到具有优良抑菌性能的功能菌株，以革兰氏阳性（G+）的地衣芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌、巨大芽胞杆菌以及革兰氏阴性（G-）的大肠杆菌、变形杆菌、伤寒杆菌为指示菌，对16 株试验菌株进行抑菌能力比较，结果见表2。16 株菌的抑菌液对G+和G-菌均具有不同的抑制效果，其中对G-菌，如大肠杆菌、变形杆菌有很强的抑制活性，对3 种G+菌的抑制作用不如G-菌，表明试验菌株的抑菌液对G-菌的抑制效果强于G+菌，推测原因是革兰氏阳性菌对抑菌物质耐受性更强，这与翟佳琳等[28]的研究结果一致。综合比较后菌株L04-1对地衣芽胞杆菌和巨大芽胞杆菌的抑制效果最好，对其它4 种指示菌也有很好的抑制效果。菌株JL03 对金黄色葡萄球菌的抑制效果显著优于其它菌株（P ＜0.05），对其它5 种指示菌的抑制效果也很突出，表明这两菌株具有优良的抑菌特性和广泛的抑菌谱，可作为抑菌功能菌进行后续研究。
表2 抑菌活性的测定结果
Table 2 Determination results of antibacterial activity
注：+.抑菌面积0～150 mm2；++.抑菌面积150～300 mm2；+++.抑菌面积300～450 mm2；++++.抑菌面积450～600 mm2；+++++.抑菌面积600～750 mm2。
2.2 抑菌功能微生物抑菌液抑菌性能的影响因素
研究表明微生物代谢产生的抑菌物质主要是一些有机酸、多肽或者前体肽。其中，有机酸是弱酸，通常以游离态存在，熔点、沸点较低，容易挥发或分解。多肽或前体肽在某些物理或化学因素的影响下，其特定的空间构象易被破坏，导致理化性质改变、功能活性丧失，进而影响抑菌性能。pH值、温度及活性氧等是主要因素。本研究分别考察pH 值、温度以及紫外照射条件下菌株JL03 和L04-1 抑菌液抑菌效价的变化情况。
2.2.1 抑菌液的pH 值稳定性 pH 值影响抑菌液中某些抑菌成分的表面电荷性质、电离度或者溶解度等性质，从而对抑菌液的理化性质和抑菌活性产生影响[30]。菌株JL03、L04-1 未经处理的抑菌液的pH 值分别为3.89 和3.82，具有较好的抑菌活性，对它们的抑菌液进行不同pH 处理，抑菌效价变化见图3。与对照组相比，经不同pH 处理的两株菌抑菌液的抑菌活性有变化且趋势较为一致，均呈先升后降的趋势。两株菌的抑菌液在pH 1.0～3.0 条件下均保持较高的抑菌活性，pH 3.0 时抑菌活性变化最小，两株菌抑菌液效价分别由5 730.69 IU/mL 和5 772.35 IU/mL 下降到5 190.12 IU/mL 和5 122.20 IU/mL，均保持原有活性的85%以上，表明抑菌液在酸性环境中更为稳定。抑菌活性随pH 值（5.0～11.0）的升高而显著降低（P ＜0.05），推测原因是抑菌液中的酸性物质被逐步中和消耗所致。研究发现，大多数蛋白质类抑菌物质（如抗菌肽）在酸性条件下能保持抑菌活性稳定，而在中性或碱性处理后抑菌活性降低甚至丧失，可能的原因是抑菌液中的抗菌肽分子在碱性条件下发生碱裂解[31]。推测两株菌的抑菌液中，除酸性物质外还存在抗菌肽类物质。此外，由抑菌效价变化率可以看出，在pH 1.0～3.0 范围，菌株JL03 抑菌活性的变化小于菌株L04-1，说明菌株JL03 的代谢产物对低pH 值的耐受性较好。在pH 5.0～11.0 范围，菌株JL03 抑菌活性变化大于菌株L04-1，说明菌株L04-1 的代谢产物在碱性条件下保持更好的抑菌活性。
图3 不同pH 处理的抑菌液抑菌效价的变化
Fig. 3 The changes in the antibacterial potency of antibacterial fermentation broth under different pH treatments
注：不同小写字母表示显著性差异（P ＜0.05）。
2.2.2 抑菌液的热稳定性 温度的变化影响抑菌液中多肽及蛋白质类抑菌物质的活性变化[32]，以及有机酸的电离程度和挥发性有机酸浓度[33]，从而影响抑菌液的效价。采用不同温度处理抑菌液，研究其热稳定性，结果见图4。菌株JL03 抑菌液的抑菌效价随温度的升高而降低，其抑菌效价的最大变化率为19.93%，且在40～100 ℃处理条件下不存在显著性差异，说明菌株JL03 抑菌液中抑菌物质比较稳定，未大量失活。该菌株在100 ℃处理条件下，抑菌效价由5 730.69 IU/mL 下降至4 588.52 IU/mL，仍保持80%以上的抑菌活性，说明菌株JL03 抑菌液中抑菌物质的热稳定性较好。菌株L04-1 的抑菌效价在20～60 ℃条件下没有显著性变化，而随着温度升至80～100 ℃时，抑菌活性显著降低（P ＜0.05），最大变化率达到44.11%，其抑菌物质热稳定性不如菌株JL03。
图4 不同温度处理的抑菌液抑菌效价的变化
Fig. 4 The changes of antibacterial potency of antibacterial fermentation broth under different temperature treatments
注：不同小写字母表示显著性差异（P ＜0.05）。
2.2.3 抑菌液紫外线照射稳定性 紫外照射能激发一些化学物质进入激发态，这些化学物质能够与氧分子结合并形成活性氧。活性氧是一类高度反应性的氧化剂，可与许多分子中的双键或硫醚键等反应，造成氧化损伤，从而影响物质的结构和功能[34]，进而引起抑菌活性的改变甚至丧失。采取紫外照射对抑菌液，以照射时间控制强度，结果见图5。随着照射时间的延长，菌株JL03、L04-1 抑菌液的抑菌效价逐渐降低。当照射1 h 时抑菌活性均显著降低，而照射时间3 h 时，菌株JL03 和L04-1 的抑菌效价分别由5 730.69 IU/mL 和5 772.35 IU/mL 下降到4 697.29 IU/mL 和4 437.52 IU/mL，抑菌活性均保持在原有活性的70%以上，说明这两株菌的抑菌物质对短时间的紫外线照射不敏感，1～3 h 内没有显著差异，具有良好的抗氧化性。此外，在1～5 h 照射过程中，菌株L04-1 的抑菌活性变化均大于菌株JL03，说明菌株JL03 的代谢产物对紫外线的耐受性比菌株L04-1 强，这表明不同菌株抑菌物质的稳定性和抗紫外线能力存在差异。
图5 不同紫外线照射时间下抑菌液抑菌效价的变化
Fig. 5 The changes of antibacterial potency of antibacterial fermentation broth under ultraviolet irradiation at different time
注：不同小写字母表示显著性差异（P ＜0.05）。
2.3 抑菌液中抑菌物质鉴别及影响抑菌效价的有机酸
2.3.1 排酸试验鉴别抑菌物质类型 由抑菌性能影响试验结果可知，菌株JL03 和L04-1 兼具酸性物质抑菌能力和抗菌肽类等非酸物质抑菌能力。为进一步验证两株菌抑菌液的抑菌作用类型，设计图1 排酸试验，测定两株菌酸性物质及非酸性物质抑菌能力的占比，初步判断其抑菌物质类型。排酸试验是将抑菌液的pH 值中和至空白MRS 液体培养基的初始pH 值6.5（测量抑菌圈直径d2），以pH=4.0（菌株JL03、L04-1 发酵结束时未经处理抑菌液的pH 值分别为3.89 和3.82，统一调整为4.0）的抑菌液为对照（测量抑菌圈直径d1），其中d1 表示总抑菌能力，d1-d2 表示酸性物质抑菌能力。模拟未处理抑菌液的pH 值，调节空白MRS 液体培养基的pH=4.0（测量抑菌圈直径d3），以pH 4.0 的抑菌液为对照，d1-d3 表示非酸物质抑菌能力，结果见表3。由表3 可知，菌株JL03 和L04-1的d1-d2 分别为10.30 mm 和13.43 mm，d1-d3 分别为4.49 mm 和3.72 mm，均大于0，表明两株菌抑菌液的抑菌作用类型均为酸性物质抑菌和非酸物质抑菌共同作用，其酸性物质抑菌能力分别占总抑菌能力的58.03%和64.32%，非酸物质抑菌能力占比分别为25.30%和17.82%，两株菌以酸性物质抑菌为主。菌株JL03 和L04-1 的酸性物质抑菌能力占比与非酸物质抑菌能力占比之和分别为83.33%和82.14%，并未达到100%，分析原因，可能是为减少抑菌液样品pH 值的差异，将菌株JL03 和L04-1 抑菌液由pH 3.89 和pH 3.82 统一调整至4.0 时，中和了部分酸性抑菌物质，同时pH 值的调整也导致了一些非酸抑菌物质抑菌能力受到影响，因此，进一步定量研究抑菌物质更为重要。
表3 抑菌物质类型判别及其酸性物质和非酸物质抑菌能力占比
Table 3 Identification of antibacterial substance types and the proportion of acidic and non acidic substance antibacterial abilities
2.3.2 抑菌液中有机酸组成及含量变化 排酸试验表明：菌株JL03 和L04-1 抑菌液的抑菌作用类型均为酸性物质抑菌和非酸物质抑菌两种类型共同作用，并以酸性物质抑菌为主。利用HPLC 测定菌株JL03 和L04-1 抑菌液中的有机酸种类及含量，结果见图6。在菌株JL03 和L04-1 发酵72 h的抑菌液中均可检测到草酸、L-苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸和富马酸7 种有机酸，总含量分别为9.64 g/L 和13.46 g/L。由图6a 可知，菌株JL03 发酵72 h 代谢生成的有机酸以乳酸为主，其含量达到最大，为6.76 g/L，占7 种有机酸总含量的70.12%，说明菌株JL03 具有较好的产乳酸性能，并随发酵时间的延长，乳酸含量呈不断增长的趋势。相比之下，草酸、乙酸、柠檬酸、富马酸以及琥珀酸的占比较少，随发酵时间呈先升后降的趋势，且总含量变化不大，表明这些有机酸无法像乳酸一样大量积累。
图6 抑菌液中有机酸种类及含量的变化
Fig. 6 The changes of types and contents of organic acids in antibacterial fermentation broth
由图6b 可知，菌株L04-1 发酵72 h 代谢生成的主要有机酸为乳酸、乙酸和琥珀酸，其含量分别为5.75，3.01，1.32 g/L，占7 种有机酸总含量的74.89%以上。其变化动态情况与总有机酸相似，说明乳酸、乙酸和琥珀酸是菌株L04-1 发酵过程中有机酸的重要组成部分。其中，主要有机酸为乳酸，其含量随发酵时间的延长呈增长的趋势，在36 h 增速开始放缓，在60 h 达到最大值5.75 g/L，随后保持该含量至72 h，这可能是由于菌株L04-1 在发酵过程中同型或异型乳酸发酵占比较大，大部分葡萄糖转化为乳酸的结果。草酸、L-苹果酸、乙酸、柠檬酸的含量呈先升后降的趋势，说明它们在发酵初期积累，而随发酵时间的延长含量下降。分析原因可能是发酵后期一些有机酸成分转化为其它成分或者被菌株代谢消耗。
2.3.3 影响抑菌效价的关键有机酸 为深入研究影响菌株JL03 和L04-1 抑菌液抑菌效价的关键有机酸，将发酵0～72 h 过程中各有机酸含量的变化与其对巨大芽胞杆菌的抑菌效价变化进行相关性分析，结果见图7。相关性结果显示，菌株JL03和L04-1 抑菌液的抑菌效价与7 种有机酸总含量之间呈显著正相关关系（菌株JL03 的相关系数为0.81，菌株L04-1 的相关系数为0.88），说明有机酸含量对这两株菌抑菌液的抑菌效价有较大的影响，该结论与排酸试验抑菌物质主要为酸性抑菌物质的结果一致。由图7a 可知，乳酸与菌株JL03抑菌液的抑菌效价存在显著正相关关系（P ≤0.01），L-苹果酸与菌株JL03 抑菌液的抑菌效价存在显著正相关关系（P ≤0.05），说明乳酸和L-苹果酸（发酵72 h 含量为0.43 g/L）是菌株JL03 抑菌液中关键有机酸，其浓度及占比增大时，抑菌液的抑菌效果会相应增强。由图7b 相关性结果显示，乳酸与菌株L04-1 抑菌液的抑菌效价呈显著正相关关系（P ≤0.01），琥珀酸和富马酸与L04-1 菌株的抑菌效价呈显著正相关（P ≤0.05），说明这3 种有机酸是影响菌株L04-1 抑菌效价的关键有机酸，乳酸、琥珀酸和富马酸（发酵72 h 含量为0.32 g/L）的积累对菌株L04-1 抑菌液的抑菌效价有增进作用。此外，图7a 结果显示：JL03 抑菌液的关键有机酸——乳酸和L-苹果酸之间存在显著的正相关关系。图7b 结果显示：L04-1 抑菌液的关键有机酸——乳酸、琥珀酸和富马酸之间也存在显著的正相关关系，表明抑菌功能菌抑菌液组分中的关键有机酸之间存在增效作用。
图7 有机酸与抑菌效价的相关性分析
Fig. 7 Correlation analysis of organic acids and antibacterial potency
注：** 表示在0.01 水平上显著相关；* 表示在0.05 水平上显著相关。
2.4 抑菌液与有机酸混合液抑菌效果的比较
为比较菌株JL03 和L04-1 抑菌液与其对应有机酸混合液的抑菌效果，参照两株菌发酵48 h时各自产生的有机酸种类及含量，配制有机酸混合液。以巨大芽胞杆菌为指示菌，比较抑菌液与有机酸混合液之间的抑菌效价差异，结果见图8。菌株JL03 抑菌液的抑菌效价是有机酸混合液A1 的2.04 倍，菌株L04-1 抑菌液的抑菌效价是有机酸混合液A2 的1.77 倍，抑菌液效价明显高于配制的有机酸混合液。分离自发酵食品中的抑菌功能微生物具有良好的安全性，其抑菌液获取成本低于用纯化有机酸试剂配制的有机酸混合液，因此，在食品防腐的应用方面更具优势。
图8 抑菌液与有机酸混合液抑菌效果比较
Fig. 8 The comparison of the antibacterial effect of antibacterial fermentation broth and organic acid mixtures
3 结论
采用牛津杯法，以地衣芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌、巨大芽胞杆菌、变形杆菌、伤寒杆菌以及大肠杆菌为指示菌，对分离自高盐稀态酱醪和泡菜的16 株产酸细菌进行抑菌能力比较，筛选并获得了对6 种指示菌均有良好抑制效果的抑菌功能菌——植物乳杆菌L04-1 和腐生葡萄球菌JL03。研究抑菌液抑菌效价的影响因素，发现两株菌的抑菌液在pH 3.0 处理下，抑菌效果保持原有活性的85%以上，紫外照射3 h 后保持原有活性的70%以上，100 ℃处理JL03 抑菌液20 min，60 ℃处理L04-1 抑菌液20 min，抑菌效果仍保持原有活性的80%以上，具有良好的耐酸、耐热以及耐紫外照射特性。排酸试验发现菌株JL03 和L04-1 的抑菌物质以酸性物质为主，其抑菌能力分别占总抑菌能力的58.03%和64.32%。HPLC 分析，两株菌抑菌液中的酸性抑菌物质主要为草酸、L-苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸和富马酸。相关性分析发现L-苹果酸、乳酸是菌株JL03 抑菌液中的关键有机酸，乳酸、琥珀酸和富马酸是菌株L04-1 抑菌液中的关键有机酸，且关键有机酸组分间存在增效作用。比较抑菌效价发现，两株菌抑菌液的效价明显高于配制的有机酸混合液。抑菌功能微生物的筛选及其抑菌物质研究，为开发及工业化应用低成本、高效的天然生物防腐剂奠定了基础，同时为食品的防腐保鲜提供了一个新思路。
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