帕金森病（Parkinson's disease，PD）是一种典型的神经退行性疾病，目前尚无有效的治疗和控制方法，已成为世界范围内主要的社会和医疗问题之一。PD 发病与环境和遗传等多种因素有关，其典型症状表现为运动“开关”异常，且伴随静止性震颤、僵硬、运动迟缓和步态障碍[1]。此外，还多发神经行为障碍、认知障碍和自主神经功能障碍等[2-3]。随着临床研究的深入，研究者发现PD 患者通常在表现出行为异常前，便已出现明显的便秘等胃肠功能异常等症状。近年来，“肠-脑”轴病理性变化与运动、认知功能损害之间的关系受到广泛关注。研究证实，肠道菌群可诱导肠神经系统（ENS）中α-突触核蛋白（α-SYN）的积累，并通过迷走神经传递到大脑，进而诱发PD[4-5]，而调节肠道菌群微环境可有效改善PD 相关症状，肠道菌群或将成为防治PD 的重要靶点[6]。
南极磷虾油（Kill oil，KO）富含虾青素（Astaxanthin，AST）、生育酚及二十碳五烯酸（Eicosapentaenoic acid，EPA）、二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid，DHA）等ω-3 不饱和脂肪酸等生物活性物质，且ω-3 不饱和脂肪酸多存在于磷脂中[7]。目前研究表明，KO 具有改善空间记忆能力、全身炎症和抑郁症状等多种功能[8]，对血脂异常、冠心病、肠道炎症等疾病亦有明显的改善作用[9-11]。为探究KO 对帕金森病小鼠脑黑质多巴胺能神经元及肠道菌群的影响，本研究采用神经毒性药物1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（1-Methyl -4 -phenyl -1，2，3，6 -tetrahydropyridine，MPTP）对小鼠实施为期7 d 的腹腔注射，构建经典PD 亚急性模型，并以KO 对PD 小鼠进行干预，采用免疫组化技术及16S rDNA 高通量测序技术评价KO 对PD 模型小鼠多巴胺能神经元损伤的改善作用，并探究KO 对PD 模型小鼠肠道菌群的影响。本研究首先明确KO 防治PD 的功效，并从肠道微生态平衡的角度揭示KO 防治PD 的作用机制，为以KO 为基础的PD 防治药物的研发提供重要的参考依据。
1 材料与仪器
1.1 试验材料
南极磷虾油，实验室自制；E.Z.N.A.R Stool DNA Kit，美国Omega 公司；组织固定液、PBS 缓冲液、抗原修复液、苏木素染液、盐酸分化液、氨水水溶液返蓝液，北京索莱宝科技有限公司；TBE，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；GelRed，美国Biotium 公司；TH 一抗、通用二抗，德国Sigma 公司；DNA marker，日本TaKaRa Bio 公司；Phusion Hot start flex 2X Master Mix，美国NEB 公司。
1.2 仪器及设备
显微镜NIKON ECLIPSE E100，日本株式会社尼康；PCR 仪、电泳仪，美国BioRad 公司；超低温冰箱，海尔智家股份有限公司；冷冻离心机，株式会社日立制作所；KD-P 组织摊片机51A011，浙江金华科迪仪器设备有限公司；生物组织石蜡包埋设备，湖北贝诺医疗科技有限公司；切片机HistoCoreBIOCUT，徕卡显微系统上海有限公司。
2 实验方法
2.1 实验动物
C57BL/6 雄性小鼠（40 只，6 周龄），购自浙江省医科院动物实验中心，于浙江省医科院动物实验中心SPF 屏障环境中饲养，保持相对湿度50%～60%和环境温度（25±1）℃，日光灯模拟光照/黑暗12 h/12 h，不限制进食和饮水。1 周后，随机选择5只小鼠合笼混养并分组编号。
2.2 实验分组
实验分组：对照组（Control）、PD 模型组（PD）、KO 干预组（KO_PD）、KO 对照组（KO），每组10 只小鼠。PD 模型小鼠参照Vernice 等[12]的方法。具体分组处理如下：对照组和PD 组灌胃无菌生理盐水，KO_PD 组和KO 组灌胃KO，剂量为1 g/kg，每日1 次，连续8 周。PD 组和KO_PD 组于最后1 周给予MPTP 腹腔注射，给药剂量为30 mg/kg，每日1 次，连续7 d。最后一次注射MPTP，隔日，灌注取脑，并无菌收集各组小鼠粪便。
2.3 组织固定取材
参考Wu 等[13]的方法，小鼠经戊巴比妥钠麻醉后，四肢固定，腹部向上，小心开胸移除多余组织，暴露心脏。头皮针刺入左心室，并用止血钳固定，在无菌PBS 灌注的同时剪开右心耳，待完全失血后换成4%多聚甲醛继续灌注。灌注结束后取结肠组织和脑组织，浸入固定液中过夜。每组随机选取3 只。
2.4 HE 染色
取出固定液中的小鼠结肠组织，经脱水、浸蜡、凝固后修整蜡块，并连续环状横切，切片厚度为4 μm。切片经样本脱蜡、水化、苏木素染色、分化与返蓝、伊红染色与脱水、风干封片等操作后，于显微镜下观察并拍照。
2.5 TH 免疫组化染色
取出固定液中的小鼠脑组织，经脱水、浸蜡、凝固后修整蜡块。根据小鼠脑定位图谱定位至黑质区后进行连续切片，切片厚度为4 μm。将薄片在40 ℃温水中展平，取出载玻片，放在60 ℃烘箱中烘烤。切片用二甲苯浸泡脱蜡，经无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇和75%乙醇水化后进行抗原修复、封闭过氧化氢酶、抗体杂交、显色、复染、脱水、透明和封片等操作。最后于显微镜下镜检，采集图像。
2.6 16S rDNA 测序
2.6.1 细菌总DNA 提取 采用E.Z.N.A.R Stool DNA Kit 试剂盒提取小鼠粪便细菌的总DNA，采用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计对DNA 进行评估和定量[14]。
2.6.2 V3+V4 区PCR 扩增 引物序列：341F（5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’）和805R（5’-GACT ACHVGGGTATCTAATCC-3’）。
反应体系：模板DNA（25 ng）+Phusion Hot start flex 2X Master Mix（12.5 μL）+正向引物（2.5 μL）+反向引物（2.5 μL）+PCR 级纯水（加至总体积25 μL）。
PCR 扩增程序：98 ℃30 s，（98 ℃10 s，54 ℃30 s，72 ℃45 s）循环35 次，72 ℃10 min，4 ℃保存。采用2%琼脂糖凝胶电泳对PCR 扩增产物进行验证。
2.6.3 平台测序及生信分析 根据LC-Bio 提供的方法，样品按照制造商的建议在Illumina NovaSeq 平台测序。使用fqtrim（v0.94）对原始数据进行质量过滤，使用Vsearch（v2.3.4）对嵌合序列进行过滤。用DADA2 进行解调，得到特征表和特征序列。通过归一化到相同的随机序列来计算α 多样性和β 多样性，再用SILVA（release 132）分类器，根据每个样本的相对丰度对特征丰度进行归一化。采用QIIME2 计算α 多样性和β 多样性，采用Blast 对序列进行比对，采用SILVA 数据库对特征序列进行注释，采用PICRUSt2 进行基因序列的功能预测。每组随机选取5 只小鼠的粪便用于16S rDNA 测序[14]。
2.7 统计分析
采用SPSS 21.0 对数据进行显著性分析，所有试验数据均以“平均值±标准偏差”表示。统计学分析通过MetaboAnalyst 3.0 以及联川在线分析平台（https：//www.omicstudio.cn/index）实现。
3 结果与分析
3.1 一般情况观察
首次注射MPTP 后，多数小鼠于10 min 左右出现严重颤抖，步态不稳，竖毛，翘尾等现象，1 h左右症状有所减轻。随着给药次数的增加，症状持续的时间越长，自发活动能力越弱，步态不稳和间歇震颤的现象越明显。最后一次注射时，PD 组小鼠出现剧烈颤抖、毛发直立、弓背直立和流涎现象，急性症状缓和后，小鼠几乎停止活动。而KO_PD 组症状较PD 组有所减轻。对实验周期内各组小鼠的体重变化进行监测，如图2 所示。
由图2 可知，在MPTP 造模之前，各组小鼠体质量均呈增加趋势，而灌胃KO 的小鼠体质量增长率小于灌胃生理盐水的小鼠，这可能与KO 有助于降低血脂水平，从而限制体质量快速增加有关。而MPTP 造模期间，接受MPTP 腹腔注射的小鼠体质量增长减缓。可能是由于长时间注射MPTP导致小鼠的生理机能出现持续性损害，PD 症状的显现影响小鼠的饮食行为和消化道功能，从而导致体质量增长缓慢。
3.2 南极磷虾油对小鼠黑质区多巴胺能神经元的保护作用
小鼠黑质区TH 免疫组化染色结果见图3。结果显示：对照组和KO 组小鼠黑质区TH 阳性细胞数量较多且排列较为紧密，神经纤维长且丰富；而PD 组黑质区TH 阳性细胞大量丢失，神经纤维染色边界不清，提示PD 组小鼠黑质多巴胺能神经元受损。KO_PD 组小鼠黑质区TH 阳性细胞数量、神经纤维数量及长度较PD 组均显著增加，提示KO 干预有助于缓解帕金森脑部黑质多巴胺能神经元损伤及神经元丢失。
3.3 南极磷虾油对小鼠结肠组织结构的影响
小鼠结肠组织的HE 染色情况见图4。相较于对照组而言，PD 组肠黏膜固有层肠腺稍稀疏，腺上皮杯状细胞减少，化生为立方上皮样细胞，提示PD 组小鼠结肠部位固有结构受损病变。KO 组与对照组HE 染色结果无明显差异。而与PD 组相比，KO_PD 组的肠腺稀疏和上皮杯状细胞数量减少等现象均有所改善，表明KO 有助于改善PD 小鼠结肠组织结构的改变。
3.4 南极磷虾油对肠道菌群测序分类的影响
比较各实验组feature 的差异，并绘制Venn图5。图5 显示，对照组共有3 360 个OUTs，其特有OUTs 数量最多，为2 063 个；PD 组含有2 903个OUTs，其中1 870 个为特有；KO_PD 组含有2 276 个OUTs，其特有OUTs 数量最少，为1 170个；KO 组含有3 260 个OUTs，其中1 968 个为特有。4 组间共同存在的OUTs 为396 个，而PD 组、KO_PD 组和KO 组与对照组共有的OUTs 数量依次为722，773 和955 个。由此可知，相较于PD组，经KO 干预的KO_PD 组小鼠肠道菌群种类与对照组更为接近。
3.5 南极磷虾油对肠道菌群多样性指数的影响
3.5.1 α 多样性分析 α 多样性指数是表征菌群丰富度和均匀度的综合指标，Chao1 反映样本中的物种总数，而不考虑每个物种的均匀度；Shannon 和Simpson 反映物种的多样性，前者与物种多样性呈正相关，后者与物种多样性呈负相关[15]。肠道菌群多样性分析结果显示样本测序覆盖度在99%以上，表明样本测序覆盖度较好，符合后续分析要求。各组小鼠肠道菌群的α 多样性分析结果见表1。PD 组和KO_PD 组小鼠肠道菌群α 多样性指数较对照组有所下降，表明MPTP 腹腔注射改变小鼠肠道菌群的多样性和丰富度。
表1 各组小鼠肠道菌群α 多样性指数分析
Table 1 Analysis of intestinal microflora diversity index of rats in each group
3.5.2 β 多样性分析 与α 多样性分析不同，β 多样性分析主要反映不同样本间菌群组成的相似程度。采用主成分分析（Principal component analysis，PCA）不同实验组小鼠肠道微生物群落结构，结果见图6。主成分1（PC1）对样品差异的贡献值为52.05%，主成分2（PC2）对样品差异的贡献值为14.65%，两者合计66.70%。4 组样本组内聚类良好，其中，KO 组、KO_PD 组和PD 组之间相距较远，表明3 组小鼠肠道菌群组成存在显著差异。
3.6 各个分类水平上菌群丰度分析
3.6.1 门水平菌群丰度分析 由各组小鼠在门水平上肠道菌群种类及丰度可知，小鼠肠道菌群主要由拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）和放线菌门（Actinobacteria）等构成。各组小鼠肠道菌群中相对丰度存在显著性差异的菌门见图7。由图7 可知，相较于对照组，PD 组的拟杆菌门相对丰度（51.40%）显著降低（P ＜0.05），厚壁菌门（44.06%），变形菌门（1.62%）和Epsilonbacteraeota（1.40%）相对丰度显著升高（P ＜0.05）；与PD 组相比，KO_PD组小鼠肠道菌群中拟杆菌门的相对丰度（72.59%）显著增加（P ＜0.05），而厚壁菌门（23.12%）和Epsilonbacteraeota（0.35%）相对丰度显著减少（P ＜0.05）。
研究表明，厚壁菌门和变形菌门丰度改变与炎症反应有关，变形菌门的增加提示肠道菌群失调和局部炎症[16]。本研究中PD 组小鼠肠道菌群的厚壁菌门/拟杆菌门（F/B）比值为0.86，显著高于对照组（0.69，P ＜0.05）；PD 组小鼠肠道菌群中变形菌门/拟杆菌门（P/B）比值为0.031，显著高于对照组（0.0161，P ＜0.05），而KO_PD 组F/B 和P/B比值较PD 组显著回调，表明MPTP 腹腔注射引起PD 小鼠的肠道损伤，而KO 干预有助于改善这一现象。
3.6.2 科水平菌群丰度分析 科水平上，PD 组小鼠中Muribaculaceae 相对丰度（33.42%）显著低于对照组（50.80%，P ＜0.05），而毛螺菌科（Lachnospiraceae）、普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）、螺旋杆菌科（Helicobacteraceae）和理研菌科（Rikenellaceae）相对丰度显著高于对照组（P ＜0.05）。此外，丹毒丝菌科（Erysipelotrichaceae）和链球菌科（Streptococcaceae）相对丰度明显低于对照组，而差异不具有统计学意义。KO_PD 组小鼠中Muribaculaceae（64.69%）、丹毒丝菌科和链球菌科相对丰度较PD 组显著升高（P ＜0.05），而毛螺菌科、理研菌科、梭菌科（Clostridiaceae）和螺旋杆菌科的相对丰度较PD 组显著下降（P ＜0.05）。KO 组中链球菌科、毛螺菌科相对丰度较对照组显著下降（P ＜0.05），而普雷沃氏菌科、酵母菌科（Saccharimonadaceae）、厌氧原体科（Anaeroplasmataceae）和坦纳菌科（Tannerellaceae）相对丰度显著增加（P ＜0.05）。各组小鼠肠道菌群的科水平差异分析结果见图8。
3.6.3 属水平菌群丰度分析 分析不同实验条件下小鼠肠道菌群在属水平上的变化情况，并根据各实验组小鼠肠道菌群分布的相似性进行属水平聚类，如图9 所示。KO 组与KO_PD 组小鼠肠道菌群结构较为接近，首先聚为一类，后与对照组聚为一大类，而PD 组小鼠因肠道菌群组成与其它组存在较大差异，单独聚为一类。具体而言，PD 中另枝菌属（Alistipes）、毛螺菌科_ 未知菌属（Lachnospiraceae_unclassified）、厌氧棒菌属（Anaerotignum）、螺杆菌属（Helicobacter）、瘤胃梭菌属（Ruminiclostridium）、梭菌目未知菌属（Clostridiales_unclassified）、罗宾氏菌属（Robinsoniella）、丁酸球菌属（Butyricicoccus）、肠杆菌属（Enterorhabdus）和普雷沃氏菌属 _UCG -001（Prevotellaceae_UCG-001）等菌属相对丰度显著高于对照组（P ＜0.05），而杜氏杆菌属（Dubosiella）、Muribaculaceae_unclassified 和链球菌属（Streptococcus）等菌属相对丰度显著低于对照组（P ＜0.05）。与PD组相比，KO_PD 组中Muribaculaceae_unclassified、另枝菌属、链球菌属、杜氏杆菌属、Paramuribaculum、毛螺菌科_ 未知菌属、梭菌目未知菌属、厌氧棒菌属和螺杆菌属等菌属相对丰度显著回调（P ＜0.05）。
上述不同分类层次的分析结果表明，MPTP 腹腔注射诱发小鼠脑黑质多巴胺能神经元病变和肠道组织结构改变，同时还引起小鼠肠道菌群结构的紊乱，而KO 干预可显著改善小鼠脑黑质多巴胺能神经元损伤，并维持小鼠肠道组织结构和肠道微生态平衡。
3.7 PICRUSt2 功能预测
对各组肠道菌群进行PICRUSt2 功能预测，结果见图10。KO 的干预可能对其肠道内草酰乙酸脱羧酶（Oxaloacetate decarboxylase）、UDP-N-乙酰壁酰五肽赖氨酸N（6）-丙氨酸转移酶[UDP-Nacetylmuramoylpentapeptide-lysine N（6）-alanyltransferase]、十一碳烯醇激酶（Undecaprenol kinase）、三酰甘油脂肪酶（Triacylglycerol lipase）、三磷酸核糖去磷酸辅酶A 合酶（Triphosphoribosyldephospho-CoA synthase）、二酰甘油激酶（ATP）[Diacylglycerol kinase（ATP）]、短链酰基辅酶A 脱氢酶（Short-chain acyl-CoA dehydrogenase）、5'-磷酸合成酶（5'-phosphate synthase）、[柠檬酸（pro-3S）-裂解酶]连接酶〔[Citrate（pro-3S）-lyase]ligase〕、γ-D-谷氨酸介导二氨基新戊酸肽酶（Gamma-D-glutamyl-meso-diaminopimelate peptidase）、3-羟基丁基-CoA 脱氢酶（3-Hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase）、柠檬酸裂解酶-[酰基载体蛋白] 合酶（Citrate lyase holo-[acyl-carrier protein] synthase）、6-磷酸果糖激酶（6-phosphofructokinase）、DNA 拓扑异构酶（ATP 水解）[DNA topoisomerase（ATP-hydrolyzing）]等酶的功能产生显著影响。
图1 实验周期示意图
Fig. 1 Schematic diagram of the experimental period
图2 各组小鼠体质量增长率变化情况
Fig. 2 The changes in body weight growth rate of mice in each group
图3 各组小鼠黑质区TH 免疫组化染色结果
Fig. 3 Immunohistochemical staining results of TH in the substantia nigra of mice in each group
图4 南极磷虾油对小鼠结肠组织结构的影响
Fig. 4 Effect of Antarctic krill oil on the structure of colon tissue in mice
图5 各组的Venn 图分析
Fig. 5 Venn diagram comparison of all groups
图6 肠道菌群的主成分分析
Fig. 6 Principal component analysis of gut microbiome
图7 基于门水平的肠道菌群组成
Fig. 7 Composition of gut microbiome based on the phylum level
图8 基于科水平的肠道菌群组成
Fig. 8 Composition of gut microbiome based on family level
图9 各组小鼠肠道菌群热图（基于属水平）
Fig. 9 Heatmap of gut microbiome of mice in each groups（based on genus level）
图10 KO_PD 组和PD 组功能预测差异分析
Fig. 10 Functional differences between KO_PD group and PD group
4 讨论
肠道微生物群由胃肠道中多样化的细菌群落组成，其寄生在肠道内，维持着肠道微生态的平衡，且与个体健康密切相关。现有研究表明，肠道微生物群的组成和丰度的生态失调可能影响肠道神经系统（ENS）和中枢神经系统（CNS），从而诱发或加重中枢神经系统疾病[17]。而肠道和大脑之间的相互作用理论被称为“肠-脑”轴（GBA）理论[18]，相关研究的陆续开展揭示了肠道菌群与大脑功能的种种关联。多项研究表明，PD 患者肠道微生态存在失调，表现为肠道微生物群组成结构以及菌群代谢产物的改变。如临床研究发现，约80%的PD 患者存在肠道菌群失调，表现出严重的胃肠症状，并已在肠神经中观察到α-SYN 的积累[19]。目前，关于PD 肠道菌群多样性的研究仍存争议，患者患病阶段、饮食习惯和样本取样方式等的不同均可能导致结果的差异。如Barichella 等[20]临床研究表明意大利PD 患者的肠道菌群具有更高的α多样性；Petrov 等[21]报道PD 患者肠道菌群Chao1指数偏低；而Cirstea 等[22]研究表明加拿大地区的PD 患者与健康人群的肠道菌群α 多样性不具备统计学差异。本研究显示，PD 小鼠肠道菌群α 多样性较对照组下降，而差异不具有显著性。β 多样性分析结果表明，PD 组与对照组小鼠存在显著差异。由此可知，MPTP 腹腔注射对小鼠肠道菌群α多样性的影响较小，而对β 多样性的影响更为显著。
另有报道显示，肠道微生物的结构变化可促使小胶质细胞活化和肠道通透性改变，造成α-SYN 在肠道内的聚积和磷酸化，并引发中枢神经系统的炎症反应，进而诱发PD[23]。这一观点得到病理生理学证据的支持，如α-SYN 内含物可出现在ENS 的早期，并可通过舌咽和迷走神经到达大脑[24]。然而，肠道菌群变化与疾病发生之间孰为因果尚无定论，肠道微生态失调不仅是导致肠道炎症的原因，也可能是肠道炎症的后果[25]。尽管如此，通过调节氧化应激损伤、炎症反应和肠道菌群失调减少α-SYN 的积累已被认为是治疗PD 的潜在方法。南极磷虾是一种新型海洋生物资源，其生物蕴藏量庞大，且富含EPA、DHA 等ω-3 不饱和脂肪酸、虾青素、生育酚、磷脂等多种生物活性物质，因而具有丰富的营养价值和巨大的开发潜力。据报道，南极磷虾油具有护肝明目，调节血脂和血压，改善痛经，抗炎消炎，活化血管和延缓衰老等功效[26-27]。然而，KO 是否具有改善PD 的功效，以及其发挥功效的具体途径及机制尚未明确。本研究通过采用腹腔注射1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（1-Methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP）构建PD 模型小鼠，并采用KO 对PD 小鼠进行干预，通过免疫组化实验明确KO 对多巴胺能神经元的保护作用。
鉴于肠道功能障碍是PD 患者的常见病症，而肠道屏障损伤是引起功能障碍的重要原因之一[28]，对结肠组织进行切片观察。结果表明，给予KO 灌胃处理的小鼠可以有效改善PD 诱导的结肠上皮组织结构变异和肠腺稀疏，同时上皮杯状细胞数量的下降幅度减弱。上述结果表明，KO 具有改善PD 小鼠肠道屏障通透性和完整性的功能。从肠道微生态平衡的角度探究KO 干预对PD小鼠肠道菌群的影响，结果显示，在门水平，PD 小鼠的肠道菌群与正常小鼠相比发生显著变化，而KO 干预显著改善了PD 小鼠肠道菌群的异常变化。临床研究表明，PD 患者粪便中的细菌总数较健康人群低，其中PD 患者粪便中拟杆菌门丰度显著下降[29]。安云英[30]的研究表明，PD 组小鼠肠道菌群中拟杆菌门的相对丰度较对照组显著降低，而厚壁菌门和脱铁杆菌门（Deferribacteres）的相对丰度显著升高，与本研究结果一致。拟杆菌门和厚壁菌门是小鼠肠道的主要菌群类别，研究表明拟杆菌门可将多糖分解代谢成低聚糖或短链脂肪酸（SCFA），其可加速肠黏膜中血管生成，提高宿主免疫力，并维持肠道微生态平衡[31]。此外，研究显示拟杆菌门和厚壁菌门的比值与机体代谢水平相关，而拟杆菌门下降和厚壁菌门升高均有助于促进肥胖[32]。本研究表明，PD 小鼠肠道菌群中拟杆菌门的相对丰度较对照组显著下降，而厚壁菌门显著增加，导致PD 组小鼠肠道菌群中F/B 的比值显著升高。而KO 干预使F/B 值发生显著回调。
各实验组小鼠肠道菌群在属水平上也发生明显的变化。Muribaculaceae 是小鼠肠道优势菌之一，研究表明，Muribaculaceae 具有抗氧化和抗应激特性的能力[33]，其通过免疫调节和肠道稳态调节，促进肠道代谢[34]。Wan 等[35]发现杜氏杆菌属与结肠组织中Nrf-2，HO-1，Gpx1，Gpx2 和IL-10 的mRNA 表达高度相关，表明杜氏杆菌属可能具有抗氧化和抗炎的作用。本研究显示，PD 小鼠肠道菌群中杜氏杆菌属和Muribaculaceae_unclassified属相对丰度均显著低于对照组，通过KO 干预，PD小鼠肠道菌群属水平失调现象得到显著改善。PICRUSt2 功能预测分析显示，KO 可能通过影响肠道菌群执行糖代谢、氨基酸代谢、脂质代谢等生命功能发挥肠道及神经保护作用。
综上所述，KO 有助于改善MPTP 诱导的小鼠中脑黑质多巴胺能神经元损伤和肠道组织结构损伤，并有助于在各分类水平上维持小鼠肠道菌群的稳态。本研究为以KO 为基础开发抗PD 新型保健品及临床治疗药物提供了参考依据，同时为日常膳食干预预防神经退行性疾病提供了理论依据。后续将进一步研究KO 干预下肠道菌群和中脑黑质多巴胺能神经元的互作机制，以全面揭示KO 抗PD 的内在机制。
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