姜黄素是从姜黄属植物中提取的一种天然的亲脂性多酚[1]，已被证明具有多种潜在的健康益处，包括抗氧化[2]、抗癌[3]、抗菌[4]和抗炎[5]等生物活性，在医药和食品领域受到广泛关注。姜黄素的水溶性差，化学稳定性差，生物利用度低，阻碍了其广泛应用[6]。寻找提高姜黄素水溶性和化学稳定性的方法至关重要。在以往研究中，提出了许多应对策略，例如：利用乳液、纳米颗粒、脂质体、微胶囊和胶束等纳米递送系统来包裹姜黄素[7]。这些递送系统主要由天然聚合物制备，例如：将姜黄素与无机颗粒、多糖、蛋白质等纳米颗粒络合，来提高姜黄素的水分散性和化学稳定性[2]。特别是基于蛋白质的纳米颗粒，因无毒和生物相容性，故被广泛用作姜黄素的纳米载体[8]，其制备简单，不需要复杂的设备和有毒化学品，同时，基于蛋白质的纳米颗粒可以有效地提高姜黄素在无脂肪环境中的溶解度和生物利用度，使其适合应用于功能性食品和饮料系统[9]。例如大豆分离蛋白-姜黄素[10]、米糠白蛋白-姜黄素[11]、乳清分离蛋白-姜黄素[12]等纳米颗粒，它们都可以大大提高姜黄素的水溶性、抗氧化活性和生物利用度。然而，关于豌豆蛋白在姜黄素递送系统中的研究鲜有报道。豌豆蛋白（PPI）具有与大豆蛋白、乳清蛋白同等重要的工业应用和学术研究价值，具有大量的必需氨基酸和良好的消化率，并且因其良好的乳化性能和简单的制备方法，故使豌豆蛋白成为皮克林稳定剂和制造新型结构纳米颗粒的候选者[13]。此外，最近有研究报道豌豆蛋白可用于食品和饮料中[14]。
本研究以影响豌豆蛋白-姜黄素纳米颗粒（PPI-Cur）装载效率的3 大因素（姜黄素质量浓度、pH 组合、豌豆蛋白质量浓度）设计单因素实验，并用响应面试验优化PPI-Cur 纳米颗粒制备条件，得到以装载效率和负载量为评价指标的最优制备工艺。对最优工艺得到的PPI-Cur 纳米颗粒，从粒径、ζ 电位、外观形貌、紫外光谱和二级结构含量方面进行系统性表征，旨在为制备以豌豆蛋白为输送载体的纳米递送系统提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
豌豆蛋白粉（PPI，蛋白质≥72%），烟台东方蛋白科技有限公司；姜黄素（Cur，≥98%），萨恩化学技术有限公司；其它化学品和溶剂均为分析纯级。
SPS202F 分析天平、FE20K 型pH 计，梅特勒-托利多公司；3K15 冷冻离心机，德国Sigma 公司；NanoZS Zetasizer ZS90 激光粒度仪，英国Malvern Instruments 公司；SU8020 扫描电子显微镜，日本Hitachi 公司；UV-1780 紫外可见分光光度计，日本SHIMADZU 公司；Chirascan V100 圆二色 谱仪，英国Applied Photophysics 公司。
1.2 试验方法
1.2.1 豌豆蛋白姜黄素纳米复合物的制备单因素实验 豌豆蛋白纳米复合物的制备采用pH 驱动法，参照Chen 等[8]的制备方法，稍有修改。豌豆蛋白-姜黄素纳米复合物（PPI-Cur）制备的单因素实验是分别考察姜黄素质量浓度、pH 组合、豌豆蛋白质量浓度对豌豆蛋白纳米复合物中，姜黄素装载效率和负载浓度的影响。
1）配制质量浓度为50 mg/mL 的豌豆蛋白悬液，使用1 mol/L NaOH 溶液将豌豆蛋白悬液分别调pH 值为9，10，11，12，13，经600 r/min 磁力搅拌1 h 平衡后，将不同质量浓度（0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 mg/mL）的姜黄素晶体添加到豌豆蛋白分散液中，并在室温下避光搅拌30 min，使用1 mol/L HCl 溶液将豌豆蛋白悬液分别调pH 值为6，7，8，避光磁力搅拌1 h 后，将样品溶液在20 ℃，8 000 r/min 下离心15 min，取上清液透析过夜，置于4℃冰箱。
2）分别配制质量浓度为40，50，60 mg/mL 的豌豆蛋白悬液，使用1 mol/L NaOH 溶液将豌豆蛋白悬液分别调pH 值为12，13，经600 r/min 磁力搅拌1 h 平衡后，添加姜黄素晶体（终质量浓度为0.6 mg/mL），并在室温下避光搅拌30 min，使用1 mo/L HCl 溶液将样品pH 值分别调至7.0 和8.0，避光磁力搅拌1 h 后，将样品溶液在20 ℃，8 000 r/min 下离心15 min，取上清液透析过夜，置于4 ℃冰箱。
1.2.2 姜黄素装载效率（EE）和负载量（LC）的测定 对姜黄素装载效率（EE）和负载量（LC）的评估参照Zhang 等[15]的方法，并稍有修改。使用无水乙醇从PPI-Cur 纳米复合物中获得负载的姜黄素，将0.2 mL PPI-Cur 复合物与1.8 mL 无水乙醇混合并剧烈摇动，将混合物在10 000 r/min，25 ℃离心15 min，使用紫外可见分光光度计在波长426 nm 处测定，使用溶解在无水乙醇中的游离姜黄素（0～10 μg/mL）绘制标准曲线y=0.0904x+0.004（R2=0.9973），计算姜黄素的负载质量浓度。此外，使用BCA 试剂盒（Beyotime）测定样品中可溶性蛋白的浓度，用紫外可见分光光度计在波长562 nm处测定吸光度，以0.05～0.5 mg/mL 牛血清蛋白为标准品，测定其吸光度并绘制标准曲线，根据标准曲线计算样品的可溶性蛋白含量。使用式（1）和式（2）计算EE 和LC。
1.2.3 响应面优化试验设计 为进一步研究变量之间交互作用的影响关系，以装载效率和负载量为指标，使用响应面分析法筛选最优制备工艺。基于Box-Behnken 采样原理，选择对装载效率和负载量有影响的3 个因素：pH 组合、姜黄素质量浓度、豌豆蛋白质量浓度，设计3 因素3 水平的响应面分析试验。试验样本共计17 个，其中中心组5个，响应面试验因素水平见表1，响应面试验设计见表2。
表1 响应面因素水平
Table 1 Response surface factor and level
表2 响应面试验设计
Table 2 Response surface test design
1.2.4 粒径、ζ 电位的测定 豌豆蛋白-姜黄素纳米颗粒的平均粒径和ζ 电位的测定参考Liu 等[7]的方法，稍作修改。将PPI、PPI-Cur 稀释到适当质量浓度后，使用激光粒度仪测定平均粒径和ζ 电位，所有测量均在室温下进行，并重复3 次。
1.2.5 扫描电子显微镜 大豆蛋白-姜黄素纳米颗粒的微观形貌观察参考Yuan 等[16]的方法，稍作修改。使用扫描电子显微镜观察PPI、PPI-Cur 的形态特征，采用喷金制样，将样品粉末进行喷金操作，使其被一层金属覆盖，然后在3 kV 下观察样品的微观结构。
1.2.6 紫外光谱 使用紫外-可见分光光度计在波长200～600 nm 范围，测定Cur、PPI 和PPI-Cur的紫外吸收光谱，用去离子水或乙醇适当稀释样品，并用去离子水或无水乙醇作空白对照[17]。
1.2.7 圆二色谱 圆二色谱表征参照Jiang 等[18]的方法，稍作修改。使用圆二色谱仪测定PPI、PPICur 的二级结构，制备蛋白质量浓度为0.1 mg/mL的样品溶液，置于光程为0.1 cm 的石英皿中，设定步长0.2 nm，带宽2.0 nm，光谱范围190～250 nm，扫描速度200 nm/min。处理圆二光谱数据时需要将每个光谱扣除缓冲液的基线光谱，使用Jasco 软件将得到的光谱数据值转换为摩尔椭圆率（θ），并用CDPro 软件对样品的CD 光谱进行二级结构含量分析。
1.2.8 统计分析 所有试验均测定3 次，使用SPSS 20.0 软件分析，数值以“平均值±标准差”表示；使用Design-Expert 13 根据Box-Behnken 设计试验方案，制作响应面优化设计；使用Origin 2021 绘制图表。
2 结果与分析
2.1 PPI-Cur 纳米颗粒制备的单因素实验分析
从PPI-Cur 纳米颗粒制备的单因素实验结果可知，姜黄素的装载效率与pH 组合、姜黄素质量浓度以及豌豆蛋白质量浓度密切相关。由图1a～1e 可知，不同pH 组合制备的PPI-Cur 纳米颗粒，在9-6，9-7，9-8，10-6，10-7，10-8，11-6，11-7，11-8，12-6 和13-6 的pH 组合制备条件下，姜黄素的装载率均极低，并且在不同姜黄素质量浓度（0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 mg/mL）下，装载率仅不到5%，该结果表明在这些pH 组合环境下，不适合进行PPI-Cur 纳米颗粒的制备，原因可能是在pH 值为9，10，11 的弱碱环境下，豌豆蛋白内部的疏水基团无法充分展开，从而使得豌豆蛋白与姜黄素未充分接触，减少了与姜黄素分子的接触面积，导致在固定时间内，附着的姜黄素减少，影响姜黄素负载；在pH 值为6 的弱酸性环境下，未形成“熔球”结构从而影响豌豆蛋白负载姜黄素[19]。然而在12-7，12-8，13-7，13-8 的pH 组合制备条件下，PPI-Cur 表现出良好的装载率，并且显著高于其它pH 组合（P＜0.05）。pH 13 和pH 8 组合在相同姜黄素添加量的条件下，各样品的姜黄素装载效率均高于其它pH 组合，并且随着姜黄素添加量的变化，姜黄素装载效率均保持在45%以上，相比之下，pH 组合13-7 的各样品姜黄素装载效率略低于13-8 的pH 组合，此外，pH 组合12-7、12-8 与上述两组的装载效率相比较低。因此，在响应面试验中选取pH 组合为12-7，13-7，13-8，作为3 个水平进行优化。
图1 PPI-Cur 纳米颗粒制备的单因素实验结果
Fig. 1 Single-factor test results for PPI-Cur nanoparticle preparation
注：在豌豆蛋白质量浓度（50 mg/mL）恒定下，分别添加姜黄素为0.1 mg/mL（a），0.2 mg/mL（b），0.4 mg/mL（c），0.6 mg/mL（d），0.8 mg/mL（e）时，各pH 组合下的姜黄素装载率结果；f 为姜黄素质量浓度（0.6 mg/mL）恒定，不同豌豆蛋白质量浓度下的姜黄素装载率结果。图中不同小写字母标注的样本具有显著性差异（P ＜0.05）。
由图1a～1e 不同姜黄素添加量对装载率影响的结果得出，在50 mg/mL 豌豆蛋白悬液中分别添加不同质量浓度（0.1～0.8 mg/mL）的姜黄素晶体，各pH 驱动组合下装载率的变化趋势相似，其中在姜黄素质量浓度为0.1，0.2，0.4 mg/mL 时，姜黄素的装载效率较高，最高约90%，随着姜黄素质量浓度提高至0.6，0.8 mg/mL 时，姜黄素的装载效率下降，最高仅为60%左右。然而，考虑到投入的姜黄素质量浓度过高，而能够进行自组装的豌豆蛋白质量浓度有限，使得豌豆蛋白-姜黄素纳米颗粒的装载效率降低，可能在未来的工业化生产中造成浪费，因此，选取姜黄素质量浓度为0.4，0.6，0.8 mg/mL 进行响应面优化试验。
由图1f 可知，在pH 值组合为12-7，12-8，13-7，13-8 条件下，豌豆蛋白质量浓度为50 mg/mL 的姜黄素装载率显著高于40 mg/mL 和60 mg/mL 的豌豆蛋白组（P＜0.05）。因此，在响应面试验中选取以50 mg/mL 的豌豆蛋白质量浓度为浓度中心进行工艺优化。
2.2 响应面优化试验方差分析
在前期单因素实验的基础上，建立响应面模型拟合及方差分析，以pH 组合（A）、姜黄素质量浓度（B）、豌豆蛋白质量浓度（C）为考察因素，以装载率和负载量为评价指标，利用Design-Expert 10.0.1 软件对试验数据进行统计分析，得到二次多项式回归方程：Y装载率=58.878+4.57625A -7.4175B+0.38375C -0.5175AB -0.41AC -0.4325BC-27.329A2+1.7285B2-0.744C2；Y 负载量=6.452+0.4225A -0.06125B -0.25125C -0.005AB+0.09AC -0.1025BC -2.94475A2 -0.69225B2 -0.00225C2。为了更好检验模型的有效性，对响应装载率和负载量预测数学模型分别进行方差统计分析，回归模型的方差分析结果如表3、4 所示。
表3 装载率回归模型的方差分析
Table 3 Analysis of variance for load factor regression models
注：R2=0.9374，Radj2=0.8568，RPred2=0.6289；*.差异显著，P＜0.05；**.差异极显著，P＜0.01。
由表3 装载率回归模型方差分析可知，回归模型的F 值为11.64，P 值为0.0019（＜0.01），表示该回归模型极显著，失拟项F 值为0.58，P 值为0.6601（＞0.05），表示失拟项不显著，此外，影响装载效率的不同工艺参数按贡献大小排序为：姜黄素质量浓度（B）＞pH 组合（A）＞豌豆蛋白质量浓度（C），模型的决定系数R2 为0.9374，校正后决定系数Radj2=0.8568，表明模型具有高显著性。
由表4 负载量回归模型方差分析可知，回归模型的F 值为47.26，P 值＜0.0001（＜0.01），表示该回归模型极显著，失拟项F 值为1.45，P 值为0.3544（＞0.05），表示失拟项不显著，此外，影响负载量的不同工艺参数按贡献大小排序为：pH 组合（A）＞豌豆蛋白质量浓度（C）＞姜黄素质量浓度（B），该模型的决定系数R2 为0.9838，说明模型拟合优度较高，并且Radj2=0.9630，能够解释试验96.30%的响应值变化，并与预测相关系数RPred2 相差不大，表明该模型具备较高预测精准度。
表4 负载量回归模型的方差分析
Table 4 Analysis of variance for the loadings regression model
注：R2=0.9838，Radj2=0.9630，RPred2=0.8530；*.差异显著，P＜0.05；**.差异极显著，P＜0.01。
综上所述，该模型对真实情况的模拟准确，此预测模型可以用于豌豆蛋白-姜黄素纳米颗粒制备工艺的优化。
2.3 PPI-Cur 纳米颗粒最佳制备工艺的验证试验
图2 是pH 组合、姜黄素质量浓度和豌豆蛋白质量浓度三因素之间的交互作用，对姜黄素装载率、负载量影响的响应面图和等高线图。由图2a 和2d 可知，pH 组合和姜黄素质量浓度间的交互作用对装载率和负载量影响的等高线图为马鞍状，这表明pH 组合和姜黄素质量浓度间的交互作用对姜黄素的装载率和负载量影响显著。相较而言，pH 组合和姜黄素质量浓度的交互作用对负载量的影响更显著。由图2b 和2e 可知，pH 组合和豌豆蛋白质量浓度间交互作用对装载率和负载量影响不显著，等高线图未呈马鞍状。此外，姜黄素质量浓度和豌豆蛋白质量浓度间交互作用对装载率和负载量影响亦不显著，其等高线图未呈马鞍状。
图2 pH 组合、姜黄素质量浓度和豌豆蛋白质量浓度对姜黄素装载率、负载量的影响
Fig. 2 Effect of pH combination，curcumin mass concentration and pea protein mass concentration on loading rate and loading of curcumin
为进一步确定最优解，以装载率、负载量最大为综合优化目标，根据Design-Expert 10.0.1 软件运行结果，在pH 组合、姜黄素质量浓度、豌豆蛋白质量浓度的共同影响下，最优制备工艺为：pH组合为13-8，姜黄素质量浓度为0.455 mg/mL，豌豆蛋白质量浓度为43.64 mg/mL，在此条件下模型预测的装载率为64.648%，负载量为6.256 μg/mg。根据软件预测结果，结合实际工艺的可行性，取pH 组合为13-8，姜黄素质量浓度为0.46 mg/mL，豌豆蛋白质量浓度为43 mg/mL，进行3 次平行试验，得到平均装载率为62.55%，平均负载量为6.10 μg/mg，这与模型预测结果接近，表明基于该响应面模型分析优化装载率和负载量的工艺有效可行。此外，相关研究报道了游离姜黄素在PBS 中的溶解度为88.54 ng/mL[20]。而本研究得到的PPI纳米复合物中包裹的姜黄素在中性水溶液中的溶解度为287.73 μg/mL，使姜黄素的水溶性显著提高。
2.4 PPI-Cur 纳米颗粒的粒径、ζ 电位和微观形态
在纳米输送载体评价中，严格的将平均粒径为1～1 000 nm 的颗粒，统称为纳米颗粒[21]。纳米颗粒的尺寸对生物活性物质的输送特性以及对其生物利用度的增效作用密切相关。当载体的粒径小于500 nm 时，可显著提高被输送的生物活性物质的生物利用度[22]。表5 为PPI-Cur 纳米颗粒的平均粒径和ζ 电位结果，该豌豆蛋白平均粒径为（1 619.0±34.22）nm，通过pH 驱动法制备的豌豆蛋白-姜黄素纳米颗粒的平均粒径为（254.5±9.00）nm，经过pH 驱动法处理后颗粒粒径减小了约85%，这与Zhao 等[23]的试验结果相似。ζ 电位是纳米粒子表面电荷的指示物，一般来说，分子或分散粒子越小，ζ 电位的绝对值越高，体系越稳定[24]。PPI 的ζ 电位为（-28.7±0.71）mV，通过pH 驱动装载Cur 后，PPI-Cur 纳米粒子的ζ 电位显著变为（-39.7±0.14）mV（P＜0.05），这一现象证明Cur 与PPI 蛋白分子相结合且PPI-Cur 体系稳定。
表5 PPI、PPI-Cur 的平均粒径、ζ 电位
Table 5 Mean particle size and ζ-potential of PPI，PPI-Cur
使用扫描电镜观察了PPI 和PPI-Cur 纳米颗粒的微观形貌，如图3 所示，PPI 颗粒呈规则的球状，结构紧凑，表面光滑，pH 驱动包埋姜黄素后，PPI-Cur 纳米颗粒变得更细小，尺寸约为200 nm左右，这与动态光散射（DLS）测量的平均粒径测定结果相似。
图3 PPI（a）、PPI-Cur（b）的扫描电镜
Fig. 3 Scanning electron microscopy of PPI（a），PPI-Cur（b）
2.5 紫外光谱
紫外吸收光谱法经常被用来分析蛋白质与小分子的相互作用以及微环境的变化。如图4 所示PPI-Cur 纳米颗粒的形成导致豌豆蛋白在波长260～280 nm 处的吸收峰面积增加，并发生蓝移，这与Li 等[17]在大豆蛋白纳米包封姜黄素的研究中的结果一致。此外，在波长275 nm 处的吸收峰是豌豆蛋白中芳香氨基酸（Tyr 和Trp）残基的特征吸收峰[25]，姜黄素使PPI-Cur 的光谱在波长410 nm处出现了新的特征吸收峰，对比单独的姜黄素在波长430 nm 处的特征吸收峰，该处吸收峰发生了蓝移，这些现象表明豌豆蛋白与姜黄素之间存在络合作用。
图4 Cur、PPI 和PPI-Cur 的紫外光谱
Fig. 4 UV spectra of Cur，PPI and PPI-Cur
2.6 圆二色谱
使用圆二色谱评价了PPI、PPI-Cur 纳米颗粒的二级结构变化。由图5a 可知，豌豆蛋白和豌豆蛋白-姜黄素纳米颗粒在波长210～220 nm 处产生负峰，说明β-折叠是豌豆蛋白主要的二级结构[26]，并且与豌豆蛋白对比，豌豆蛋白-姜黄素纳米颗粒受到pH 驱动的影响，波峰发生了红移，表明PPI纳米颗粒的构象由无序向有序过度[27]。利用CDNN 软件计算了PPI、PPI-Cur 纳米颗粒的二级结构含量，如图5b 所示，相比于PPI，当Cur 被包封后，PPI 纳米颗粒的二级结构发生了一些改变，β-折叠由33.6%显著减少至25%（P＜0.05），无规卷曲从23%显著增加至31%（P＜0.05），α 螺旋增加了约5%，该现象与Li 等[17]在大豆蛋白分离物纳米包封姜黄素的研究结果相似。
图5 PPI 和PPI-Cur 的圆二色谱（a）和二级结构（b）
Fig. 5 Circular dichroism（a）and secondary structure（b）of PPI and PPI-Cur
3 结论
通过单因素实验考察了pH 组合、姜黄素质量浓度和豌豆蛋白质量浓度对豌豆蛋白-姜黄素纳米颗粒装载率的影响，并以装载率、负载量最大为综合优化目标，利用响应面法筛选出PPI-Cur 纳米颗粒的最优制备工艺：pH 组合为13-8，姜黄素质量浓度为0.455 mg/mL，豌豆蛋白质量浓度为43.64 mg/mL。最佳工艺获得的PPI-Cur 纳米颗粒的平均粒径为（254.5±9.0）nm，并且ζ 电位显示了PPI-Cur 纳米颗粒体系稳定，扫描电子显微镜、紫外光谱和圆二色谱结果显示姜黄素被成功地负载到了PPI 纳米复合物中，并且姜黄素与豌豆蛋白之间存在络合作用。综上，本研究为PPI-Cur 纳米颗粒的制备提供了理论支撑，也为深入开发植物蛋白基输送系统在递送生物活性化合物方面奠定了基础。
【致谢】
本文得到 “中轻集团科技创新基金项目（ZQ2022JC-QN08）”的支持。
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