氨肽酶作为一种蛋白酶被应用于食品加工，可以减少食品的苦味并增加游离氨基酸含量，提高食品营养价值及风味[1]。欧洲药典适应性证书（CEP）研究了由转基因丝状真菌（A.oryzae）菌株NZYM-BU 产生亮酰氨肽酶的口服毒性，并匹配了过敏源，证明该酶在预期的使用条件下不会引起安全问题[2]。氨肽酶广泛存在于动、植物，微生物及原生动物等多种生物体内[3]。其中动、植物体内氨肽酶含量较低[4]，且提取难度大[5]，而通过微生物发酵生产氨肽酶效率高且成本低。产氨肽酶的微生物的种类很多，而大多数菌种因产酶能力低或者产生潜在风险因子等问题而不适合大规模生产氨肽酶[6]。有文献报道用于氨肽酶工业生产的野生菌种主要有曲霉菌、芽孢杆菌和乳酸菌[7]。芽孢杆菌属（Bacillus）是一类革兰氏阳性菌，好氧或兼性厌氧，产生的芽孢对高温、紫外线、电离辐射等具有较强抗性，且营养需求简单，生长速度快，适应范围广，广泛存在于土壤、水、空气以及动物肠道等处[8]，其中地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）含有丰富的酶类，包括脯氨酰亚氨基氨肽酶（Pep I）、广谱性氨肽酶（Pep N、Pep C）、X-脯氨酰-二肽酰基-氨肽酶（Pep X）等肽酶[9-10]。
不同菌株产氨肽酶的种类不同，其酶学性质也不尽相同。随着氨肽酶在工业生产中的应用需求日益增加，寻求新的或更好性能的氨肽酶成为当今的研究热点[11]。为了适应工业需求，在极端生存条件中筛选菌种，以获得性能好的氨肽酶也成为重要的筛选方式[12]。豆酱作为我国传统的发酵调味品之一，其盐度普遍在20%左右。豆酱发酵过程中通过增加盐度制造高渗环境，以抑制杂菌生长[13]。邓扬龙[14]研究发现豆酱发酵后期，芽孢杆菌属为优势菌，占总分离菌株的55%，其中海洋芽孢杆菌含量达到总分离菌株的16%。本文从传统发酵豆酱中筛选出高产氨肽酶的芽孢菌株，对其进行鉴定，采用单因素实验和响应面试验优化该菌株产酶培养条件，并探究该氨肽酶的部分酶学性质，为进一步扩大氨肽酶生产及其应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
发酵豆酱采自安徽民间作坊，放置于无菌取样盒中4 ℃保存。
KH2PO4、Na2HPO4、L-亮氨酸-对硝基苯胺（LLeu-PNA）、L-精氨酸-对硝基苯胺（L-Arg-PNA）、L-缬氨酸-对硝基苯胺（L-Val-PNA）、L-脯氨酸-对硝基苯胺（L-Pro-PNA）、CoCl2、CuCl2、CaCl2、MgSO4、FeCl2、ZnCl2、苯甲磺酰氟（PMSF）、乙二胺四乙酸（EDTA）、胃蛋白酶抑制剂（Pepstatin）、二硫苏糖醇（DTT）、十二烷基硫酸钠（SDS）、Tris、浓盐酸、无水乙醇等试剂，均为分析纯级，上海吉至生化科技有限公司。
1.2 仪器与设备
BKM-SRG-006 型电热恒温水浴锅，特科锶（广州）科技服务有限公司；UV-2102C 型紫外-可见分光光度计，北京东南仪诚实验室设备有限公司；YP10002B 型电子分析天平，特科锶（广州）科技服务有限公司；生化培养箱，高教研（北京）科技有限公司；BK-LTG210A 型台式高速离心机，广州科大恒新技术有限公司；LC-101-3B 型高温烘干箱，北京金优科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 氨肽酶产生菌的筛选
1.3.1.1 菌株初筛 称取1 g 样品于装有100 mL无菌水的锥形瓶中振荡均匀，80 ℃水浴20 min[15]，取1.0 mL 混于无菌水中的样品接入富集培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）中37 ℃培养24 h，取富集培养菌液稀释涂布到分离培养基[蔗糖30 g/L，牛肉膏5 g/L，L-Leu-PNA 0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KH2PO4 1.0 g/L，琼脂粉20 g/L，pH 7.0；培养基中无色的对硝基苯胺（LNA）可以被分解生成黄色对硝基苯胺]中，根据生成的水解圈直径大小筛选出目的菌株[16]，用于后续试验。
1.3.1.2 菌株复筛 将初筛菌株接种于产酶培养基（MRS 培养基）37 ℃培养24 h，取菌液测定氨肽酶酶活，根据酶活高低筛选出目的菌株。
1.3.2 氨肽酶活力的测定 采用LNA 法[17]测定氨肽酶活力，具体步骤如下：取样品酶液0.5 mL，加入6 mL pH 9.0 Tris-HCl 缓冲液，58 ℃下预热5 min 后加入0.5 mL 26 mmol/L LNA-乙醇溶液，空白对照加入0.5 mL 的无水乙醇，水浴反应10 min。反应结束后立即放入冰浴终止反应。测定反应液在波长405 nm 处的吸光值，根据下列公式计算酶活。
式中：A 为由样品测得的吸光度根据标准曲线计算得到的对硝基苯胺含量，μg；N 为稀释倍数。
酶活性单位的概念：在40 ℃时，每分钟溶解L-Leu-PNA 生成1 μg 的对硝基苯胺所需酶量，即为一个酶活单位U。
1.3.3 氨肽酶产生菌的鉴定
1.3.3.1 形态学观察 观察菌株单菌落的颜色、形状、质地等形态特征；油镜下观察革兰氏染色后的菌体；并通过扫描电镜观察菌体形态[18]。
1.3.3.2 生理生化检测 用细菌微量生化鉴定管对分离出的菌落进行生理生化鉴定[19-21]。
1.3.3.3 分子鉴定 由上海生工生物有限公司测定，并在GenBank 数据库中对比同源关系序列，MEGA 6.0 系统构建进化树。
1.3.4 氨肽酶产生菌耐盐能力的测定 按3%的接种量将菌液于添加不同质量分数（10%，20%，30%，40%）NaCl 的MRS 液体培养基中，37 ℃下培养24 h 后观察菌株的生长情况，测定菌株在波长600 nm 处的吸光值[22]。
1.3.5 单因素实验优化产酶培养条件
1.3.5.1 培养温度的选择 以培养温度为自变量，保持培养时间48 h、起始pH 7.0 等其它培养条件不变，根据1.3.5 节中氨肽酶活力的测定方法，分析不同培养温度（35，36，37，38，39 ℃）对菌株XYY1 产氨肽酶活力的影响，试验重复3 次，计算平均值。
1.3.5.2 培养时间的选择 以培养时间为自变量，保持培养温度为36 ℃、起始pH 7.0 等其它培养条件不变，根据1.3.5 节中氨肽酶活力的测定方法，分析不同培养时间（12，24，36，48，60 h）对菌株XYY1 产氨肽酶活力的影响，试验重复3 次，计算平均值。
1.3.5.3 起始pH 值的选择 以起始pH 值为自变量，保持培养温度为36 ℃、培养时间48 h 等其它培养条件不变，根据1.3.5 节中氨肽酶活力的测定方法，分析不同起始pH 值（4.5，5.5，6.5，7.5，8.5，9.5，10.5）对菌株XYY1 产氨肽酶活力的影响，试验重复3 次，计算平均值。
1.3.6 响应面试验 根据菌株的基础培养条件，在单因素实验的基础上，按照Box-Behnken 中心的综合工程设计基本原理，系统设计了三因素三水平的响应面解析试验，一共17 个测试点，当中12 个为析因点，另外5 个零点重复，以计算测试偏差，即对每毫升酶液的氨肽酶活性的最大响应值（Y）。培养时间的3 个水平分别是36，48，60 h；培养温度的3 个水平分别是35，36，37 ℃；起始pH值的3 个水平，依次是5.5，6.5，7.5[23-25]。
表1 Box-Behnken 设计因素及水平表
Table 1 Box-Behnken design factors and levels table
1.3.7 部分酶学性质的研究
1.3.7.1 粗酶液的制备及其性质研究 1.3.6 节中优化的培养条件下培养菌株获得发酵液，在4 ℃、8 000 r/min 离心20 min，弃去沉淀，上清液为粗酶液[26]，且将本试验筛选出的地衣芽孢杆菌所产的氨肽酶命名为Lap-Y。
1.3.7.2 最适反应温度测定试验 将酶液分别在30，35，40，45，50，55，60，65，70 ℃恒温水浴中保温10 min，按照1.3.2 节的方法测定氨肽酶活，以50℃条件下的测得的酶活为100%，计算其它温度下的相对酶活（对照组酶活平均值减去试验组酶活平均值的绝对值与对照组酶活平均值的比值），取3 次试验的平均值作为试验结果，比较不同温度对酶活性的影响。
1.3.7.3 热稳定性测定试验 将等量的酶液置于不同温度（50，60，70，80，90 ℃）的培养箱中保温1 h 后，分别于0，5，10，15，30，60 min 取样，按照1.3.2节的方法测定氨肽酶活，于最适反应温度下测定酶活，以保温前酶液的酶活为100%，计算出其它相应温度下的相对酶活（同1.3.7.2 节中相对酶活定义），取3 次试验的平均值作为试验结果，得温度稳定性曲线。
1.3.7.4 最适反应pH 值测定试验 配制不同pH值梯度（6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0）的反应缓冲液，按照氨肽酶活的测定方法，于最适反应温度下测定酶活，以pH 9.0 条件下的酶活为100%，计算其它梯度下的相对酶活（同1.3.7.2 节中相对酶活定义），取3 次试验的平均值作为试验结果，比较不同pH 值对酶活性的影响。
1.3.7.5 pH 值稳定性测定试验 用不同pH 值的缓冲液，将原始酶液进行相同倍数的稀释，使得酶液达到相应的pH 值（6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0），室温条件下保存1 h 后，按照氨肽酶活的测定方法，于最适反应温度与最适pH 值条件下测定酶活，以标准条件下pH 9.0 的酶液测得的酶活为100%，计算其它梯度下的相对酶活（同1.3.7.2 节中相对酶活定义），取3 次试验的平均值作为试验结果，得出pH 值稳定性曲线。
1.3.7.6 金属离子对酶活的影响 在酶液中分别加入Co2+、Ca2+、Cu2+、Fe2+、Mg2+、Zn2+等金属离子，且设定0.1，1，10 mmol/L 的浓度梯度[27]，按照氨肽酶活的测定方法，于最适反应温度与最适pH 值条件下测定酶活，以不添加金属离子的样品为对照，计算其它样品的相对酶活（同1.3.7.2 节中相对酶活定义），比较不同浓度的金属离子对酶活性的影响。
1.3.7.7 抑制剂对酶活的影响 将酶液溶于缓冲液中，分别加人各种蛋白酶抑制剂（PMSF、EDTA、Pepstatin、DTT、SDS）至终质量浓度为1 mg/mL[28-29]，在室温下放置1 h 后，按照氨肽酶活的测定方法，于最适反应温度与最适pH 值条件下测定酶活，以不加抑制剂的样品为对照，计算其它样品的相对酶活（对照组酶活平均值减去试验组酶活平均值的绝对值与对照组酶活平均值的比值），比较各种抑制剂对氨肽酶活性的影响。
1.3.7.8 底物对酶活的影响试验 将酶液溶于缓冲液中，不改变酶活测定的其它条件，只更换底物（L-Leu-PNA、L-Arg-PNA、L-Val-PNA、L-Pro-PNA）[30]，按照氨肽酶活的测定方法，于最适反应温度与最适pH 值条件下测定酶活，以L-亮氨酸-对硝基苯胺作为对照，计算其它浓度下的相对酶活（对照组酶活平均值减去试验组酶活平均值的绝对值与对照组酶活平均值的比值），比较不同底物对亮氨酸氨肽酶的影响。
2 结果与分析
2.1 氨肽酶产生菌的筛选
豆酱以高渗环境抑制发酵过程中杂菌的污染，芽孢杆菌作为豆酱发酵过程中的优势菌株，在豆酱中具有较高的丰度。因此本试验对传统发酵豆酱中分离出的芽孢菌株对进行初筛，得到6 株具有黄色水解圈的芽孢菌株，并通过比较氨肽酶活复筛得一株氨肽酶活力较高的芽孢菌株，现将其命名为XYY1，继续后续试验。
2.2 氨肽酶产生菌的鉴定
XYY1 菌落呈白色、扁平状，表面粗糙且边缘褶皱不整齐的形态（如图2a）；革兰氏染色呈阳性，其菌体形态为杆状，单生，产生近中生的椭圆状芽孢，包囊稍膨大，无荚膜，无鞭毛，能运动（如图2b），扫描电镜下菌体呈长杆状（如图2c）。生化分析显示该菌可发酵阿拉伯糖、麦芽糖、甘露醇、木糖、葡萄糖，且VP 试验为阳性，能分解葡萄糖产生丙酮酸；不能发酵柠檬酸盐与丙酸盐，酶触试验与脲酶试验均为阳性，可降解淀粉，可将硝酸盐还原为亚硝酸盐（表3）。对XYY1 进行16S rDNA测序，所得序列在GenBank 中上传获得序列登录号为MW301117.1。通过NCBI 数据库BLAST 序列比对和系统发育树分析，证实菌株XYY1 与地衣芽孢杆菌（Bacillus lincheniformis）strain CIIRC、地衣芽 孢杆菌（Bacillus lincheniformis）strain MRPDSCV17203 等菌株聚类在同一分枝上（图3），结合形态学观察和生理生化检测结果，确定为地衣芽孢杆菌（Bacillus lincheniformis）[31]，命名为地衣芽孢杆菌XYY1（Bacillus lincheniformisXYY1），于中国典型微生物保藏中心专利保藏，菌株专利保存编号为M2022734。
表2 初筛产生水解圈的菌株
Table 2 A strain that produces hydrolytic rings at first screening
表3 菌株XYY1 的生理生化鉴定结果
Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strain XYY1
注：“+”表示结果为阳性，“-”表示结果为阴性。
2.3 氨肽酶产生菌的耐盐能力
芽孢杆菌可应用于如豆酱、泡菜等食品的发酵过程中[32]，而其作为发酵剂，必须具备一定的耐盐能力[33]。本试验通过菌株在含有不同质量分数NaCl 的液体培养基中的生长情况，分析菌株的耐盐性。因为本研究中筛选菌株的样品为传统发酵豆酱，其盐的质量分数大约在20%，XYY1 菌株筛选于高盐浓度的发酵豆酱，在NaCl 质量分数为10%、20%时菌株生长良好，当NaCl 质量分数为30%时菌株虽出现生长缓慢的情况，但仍有半数菌株可以正常生长。当NaCl 质量分数为40%时，菌株出现明显的生长受限，说明XYY1 菌株具有非常强的耐盐能力。
2.4 培养温度对XYY1 产氨肽酶活力的影响
温度是影响微生物生长和发酵的重要参数之一，通过温度的控制可以调控微生物代谢能力。由图4 可得，当培养温度为35～36 ℃时，XYY1 产氨肽酶活力逐渐上升，随后XYY1 产氨肽酶活力随温度升高开始降低。推测可能的形成原因是：培养温度过低会导致菌株生长繁殖减慢，减少了产氨肽酶的产量；培养温度过高，菌株的生长繁殖加快，提早进入生长衰亡期，菌株代谢能力减弱，导致产氨肽酶的活力下降[34]。当温度为36 ℃时XYY1产氨肽酶活力升至最大为（3 608.65±7.02）U，与35 ℃和37 ℃相比氨肽酶活力分别提高了68.25%，17.37%（P＜0.05）。一般而言，微生物生长和代谢产酶的最佳温度因种类不同而有所差异，如郭宇星等[35]研究发现瑞士乳杆菌产氨肽酶的温度优选为33～37 ℃，陈国恒等[36]研究发现嗜热链球菌KM-022 的最适产氨肽酶温度为40 ℃，张皎皎等[37]研究发现甲基营养型芽孢杆菌WM-1 的最适产氨肽酶温度为30 ℃。
2.5 培养时间对XYY1 产氨肽酶活力的影响
由图5 可得，培养时间在12～36 h 时，XYY1产氨肽酶活力逐渐上升，在36 h 时菌株产氨肽酶活力达到最高点，为（3 918.66±10.11）U，与24 h和48 h 相比氨肽酶活力分别提高了12.52%和23.00%（P＜0.05），随后开始缓慢降低。推测是由于菌株在36 h 正处于稳定期，次级代谢产物氨肽酶大量产生，随着培养时间继续延长，进入衰亡期后活菌数下降导致氨肽酶的合成量减少[38]。陈雅惠等[39]研究发现，随着培养时间的增加，地衣芽孢杆菌E7 培养体系中失活的酶量逐渐增加，导致氨肽酶活力逐渐降低，与本研究的试验结果相一致。不同种类的微生物最佳产酶时间虽具有差异，但通常细菌最佳产酶时间略短于霉菌，如蜡样芽孢杆菌M2 的最佳产酶时间为24 h[40]，溶藻弧菌S10 最佳产酶时间为36 h[41]，而团青霉M4 的最佳产酶时间为48 h[42]。
2.6 起始pH 值对XYY1 产氨肽酶活力的影响
pH 值是调控微生物生长代谢重要的参数之一，其通过影响微生物细胞结构，即细胞膜的通透性、微生物合成酶种类和组成以及营养物质的状态来影响微生物代谢活动[43]。起始pH 值对XYY1产氨肽酶活性的影响如图6 所显示，在起始pH值在4.5～6.5 范围时，XYY1 产氨肽酶活性持续提高，随着起始pH 值的变大，XYY1 产氨肽酶活性也呈现降低态势。起始pH 为6.5 时，XYY1 产氨肽酶活性最高为（3 668.66±6.45）U，与起始pH 5.5 和起始pH 7.5 相比氨肽酶活力分别提高了71.66%和16.57%（P＜0.05）。检测分离本文芽孢菌的豆酱样品pH 值为6.43，表明该菌生长环境pH值与其适宜产酶培养条件相吻合。
2.7 响应面试验
菌株XYY1 产氨肽酶含量响应面试验结果见表5，方差分析见表6。应用Design Expert 10 软件对表4 中的数据进行分析，回归模型如下：
表4 菌株在不同质量分数NaCl 下的生长情况
Table 4 Growth of strains at different NaCl mass fraction
注：“+”代表生长情况受限，“++”代表生长情况缓慢，“+++”代表生长情况良好。
表5 响应面分析试验设计方案及结果
Table 5 Response surface analysis test design scheme and results
表6 方差分析表
Table 6 Analysis of variance table
注：“*”表示差异显著（P＜0.05）；“**”表示差异极显著（P＜0.01）。
Y=3932.86 -182.71A -155.50B -8.32C -112.66AB -60.04AC -96.26BC -659.68A2 -373.94B2-636.46C2
提高对模型中的回归系数进行显著性试验，结果见下表6。一次项中的A、B、C；交互项中的B和C 之间的交互作用；二次项中的A 对XYY1 产氨肽酶活力都有显著影响（P＜0.05）。通过对比回归方程中各系数绝对值的大小，可以确定3 种因素对XYY1 产氨肽酶活性的影响顺序为A＞B＞C（培养时间＞培养温度＞起始pH 值）。由此可知，各个因素对氨肽酶活力的影响并不是简单的线性关系。去掉差异不显著项，可以得到优化后的回归模型为Y=3932.86-182.71A-155.50B-659.68A2-373.94B2-636.46C2。
模型有意义（P＜0.01），决定系数R2=0.9735，说明此模型可以解释97.35%的数据；变异系数CV=4.49%，CV 值较小，说明试验误差较小[44]。数据显示，本研究获取模型的响应值和自变量的线性关系显著，为地衣芽孢杆菌高产氨肽酶提供理论预测。利用响应面分析试验结果中的P 值可以看出，所选的3 个因素都能影响地衣芽孢杆菌生长繁殖代谢产物氨肽酶活性，其中对XYY1 产氨肽酶影响较为重要的原因是培养时间。这可能是由于特定环境温度可以增加菌株产氨肽酶的活力与稳定性[45]。
各变量间的相互作用对菌株产氨肽酶含量影响见图7 所示。
通过响应面可很明显的看出最优值点及各参数之间的交互作用[46]，由图7 可知，随各因素水平的增加，所有响应面开口均朝下，拟合曲线均为凸形，存在极大值，氨肽酶活力随着培养时间、培养温度及起始pH 值的变化呈先增大后减小的趋势。通过图7 可知，培养时间的坡度大于培养温度的坡度，表明在AB 交互作用中培养时间的影响比较大。培养温度和起始pH 值的椭圆程度大，表明AC 的交互作用影响也很显著，与方差分析结果一致。培养时间与起始pH 值的坡度陡峭且颜色变化快，表明BC 二者交互作用对菌株产氨肽酶活力影响较显著。
结合回归模型和响应面图分析得出最佳培养条件为：培养时间为34.528 h，培养温度为35.819℃，起始pH 值为6.513，此最优条件下预测XYY1产氨肽酶活力为4 039.70 U。结合实际情况，设定培养时间为35.5 h，培养温度为36 ℃，起始pH 值为6.5，在此条件下培养菌株并检测氨肽酶活力进行验证，试验结果为（4 132.75±11.94）U，与模型预测值基本吻合，表明模型可靠。
2.8 粗酶性质的研究
2.8.1 氨肽酶的最适反应温度 从图8 可见，反应温度为55 ℃时氨肽酶Lap-Y 的相对活性最高，达到121%。反应温度在50～60 ℃范围，相对酶活较高。温度高于55 ℃时，相对酶活开始降低，可能是因为高于最适反应温度，氨肽酶与水解底物结合受到影响，酶活下降。然而，在60 ℃和65 ℃时，Lap-Y 活性分别达到109%和89%，即在高温条件下，该酶仍有较高的活性。氨肽酶Lap-Y 最适反应温度为55 ℃，与常见氨肽酶相比结果相近，例如地衣芽孢杆菌的BLAP 最适反应温度为60 ℃[47]、嗜热脂肪芽孢杆菌的LapII 最适反应温度为55℃[48]。汪晓东等[49]发现枯草芽孢杆菌Zj016 来源的氨肽酶最适反应温度为55 ℃。
2.8.2 氨肽酶的热稳定性 从图9 可见，分别在50 ℃和60 ℃保温箱里保温60 min 后氨肽酶Lap-Y 仍保持80%左右的酶活；处理温度为70 ℃时，氨肽酶Lap-Y 热稳定性明显降低，保温60 min 后剩余酶活为初始酶活的50%；80 ℃保温60 min 后剩余酶活为初始酶活30%左右；在90 ℃保温60 min 后剩余酶活为初始酶活10%左右。说明该菌产氨肽酶具有良好的热稳定性。对比来自酱油曲霉的亮氨酸氨肽酶Lap1 75 ℃下保温60 min 只能保持10%的相对酶活力[50]，进一步证明本研究中的氨肽酶Lap-Y 具有良好的热稳定性，在食品加工产业应用上更具有优势。
2.8.3 氨肽酶的最适反应pH 值 从图10 可见，氨肽酶Lap-Y 最适pH 值为9.0，相对酶活有92%。细菌来源的氨肽酶绝大部分属于碱性氨肽酶，且最适反应pH 值一般为6.0～9.0，只有少数氨肽酶不在该范围内[51]。杨丽娜等[52]从渤海海域海泥、海水样品中分离出一株高产氨肽酶LapX 的蜡样芽孢杆菌，并进行酶学特性研究，结果表明氨肽酶LapX 的最适作用pH 值为8.5，当pH 值小于7.0 或大于10.0 时，其相对酶活均不足60%，这与本试验的研究结果相符合，提示该菌所产的氨肽酶Lap-Y 是一种弱碱性氨肽酶。
图1 产生水解圈菌株发酵液中的酶活力
Fig. 1 Enzyme activity in the fermentation broth of strains producing hydrolysis zones
图2 菌株XYY1 的形态特征
Fig. 2 Morphological characteristics of strain XYY1
图3 菌株XYY1 的系统发育树
Fig. 3 Phylogenetic tree of strain XYY1
图4 培养温度对XYY1 产氨肽酶活力的影响
Fig. 4 Effects of culture temperature on aminopeptidase production activity of XYY1
注：a、b、c、d 表示差异显著（P＜0.05）。
图5 培养时间对XYY1 产氨肽酶活力的影响
Fig. 5 Effects of culture time on aminopeptidase production activity of XYY1
注：a、b、c、d 表示差异显著（P＜0.05）。
图6 起始pH 值对XYY1 产氨肽酶活力的影响
Fig. 6 Effects of initial pH value on aminopeptidase production activity of XYY1
注：a、b、c、d 表示差异显著（P＜0.05）。
图7 培养时间、培养温度与起始pH 值交互作用对XYY1 产氨肽酶活力影响的响应面图
Fig. 7 The contour plot and surface response of culture time，culture temperature and initial pH value content on XYY1
图8 温度对Lap-Y 酶活的影响
Fig. 8 Effects of temperature on Lap-Y enzyme activity
图9 Lap-Y 的热稳定性
Fig. 9 Thermal stability of Lap-Y
图10 氨肽酶Lap-Y 的最适反应pH 值
Fig. 10 The optimal pH value for the reaction of aminopeptidase Lap-Y
2.8.4 氨肽酶的pH 值稳定性 图11 可以看出，pH 值在8.0～9.0 时酶的稳定性在缓慢上升，而当pH 值小于8.0 时酶稳定性较低，大于9.0 时酶的稳定性急剧下降，Lap-Y 在pH 8.0～10.0 范围相对稳定，在pH 8.0 和pH 10.0 缓冲液中酶活达到112%和96%，且pH 9.0 时酶活最稳定，推测可能是因为过高或过低的pH 值都会使酶蛋白变性而失活，所以在进行工业化生产时可通过控制pH值在8.0～10.0 之间以保持其稳定性[53]。综上，比起偏酸、中性或过碱性环境，弱碱性环境下的Lap-Y活性较好，稳定性最高，说明Lap-Y 有一定的耐弱碱性。
图11 Lap-Y 的pH 值稳定性
Fig. 11 pH value stability of Lap-Y
2.8.5 金属离子对氨肽酶酶活的影响 70%左右的氨肽酶都是金属氨肽酶，常见的金属离子有Zn2+、Co2+、Fe2+等[54]，金属氨肽酶的活性中心含有1～2 个金属离子，在催化过程或者稳定蛋白质结构方面起着重要的作用[55]。不同浓度的同一种金属离子和同一浓度的不同金属离子对氨肽酶酶活性作用效果均不同[56]。由表7 所示，Mg2+、Fe2+、Co2+和Ca2+离子能激活菌株产氨肽酶的活性，Mg2+、Fe2+、Co2+浓度在1.0 mmol/L 时激活作用比较强，Ca2+在0.1 mmol/L 时激活作用比较强，高浓度则抑制酶活性，其中Mg2+对氨肽酶Lap-Y 的激活作用是所有试验组中最强的。Zn2+和Cu2+能够抑制氨肽酶Lap-Y 的酶活，陈晓飞等[57]研究发现Fe2+能够维持酶的高活力稳定性和复杂空间结构，其对芽孢杆菌菌株产酶有积极作用，这和本试验结论比较相符。孟昭旭等[58]研究表明，氯化钙在低浓度时刺激了一些菌株的氨肽酶活性，在高浓度时有抑制作用，与本试验的研究结果相符合。
表7 金属离子对Lap-Y 酶活性的影响
Table 7 Effects of metal ions on Lap-Y enzyme activity
注：“-”表示对照组不添加金属离子。
2.8.6 抑制剂对氨肽酶酶活的影响 从图12 可见，丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF 和胃蛋白酶抑制剂Pepstatin 作用下的相对酶活分别为95%和97%，表明其二者对氨肽酶Lap-Y 活性无抑制作用。在金属螯合剂EDTA、蛋白质变性剂SDS 和还原剂DTT 作用下相对酶活明显降低，表明三者对氨肽酶Lap-Y 活性有明显抑制作用，可能因为上述成分与酶进行作用后导致酶分子构象发生变化，使得酶失活[59]。二价金属螯合剂EDTA 能强烈地抑制氨肽酶的活性[60]，说明该氨肽酶一种金属酶，与2.8.5 节中Mg2+、Zn2+和Co2+离子促进酶活的结果相一致。宋婷婷等[61]通过研究米曲霉重组AAP 的酶学性质，发现10 mmol/L 的碘乙酰胺（IAM）、PMSF 和Pepstatin 对AAP 只有轻微的抑制作用，EDTA 对AAP 的抑制作用十分显著，该试验结果与本文试验结果相符合。
图12 抑制剂对Lap-Y 酶活性的影响
Fig. 12 Effects of enzyme inhibitors on Lap-Y enzyme activity
2.8.7 不同底物对氨肽酶酶活的影响 由表8 可知，氨肽酶Lap-Y 对L-Leu-PNA 有较强的底物特异性，其作为底物时氨肽酶相对活力较高，符合氨肽酶M17 家族的水解特性，即具有严格的底物特异性的氨肽酶，它们只能特异性的水解某一种或一类氨基酸[62-63]。在氨肽酶Lap-Y 作用下，亮氨酸被释放游离出来，说明该酶优先水解N 末端氨基酸残基为亮氨酸的多肽。酶解大分子蛋白质使得肽链中呈苦味的疏水氨基酸暴露出来，故大多数蛋白质的水解液呈苦味。亮氨酸作为产生苦味的疏水氨基酸被氨肽酶Lap-Y 切除，从而去除蛋白质水解液的苦味。氨肽酶Lap-Y 这一特性可应用于大豆多肽的苦味的去除[64]。
表8 不同底物对Lap-Y 酶活性的影响
Table 8 Effects of different substrates on Lap-Y enzyme activity
注：“+”代表能测到酶活，“—”代表不能测到酶活。
3 结论
本文筛选出一株产氨肽酶的芽孢菌XYY1，经鉴定该菌株为地衣芽孢杆菌，通过响应曲面法优化XYY1 菌株的适宜培养条件：培养温度36℃、培养时间35.5 h、起始pH 值为6.5，在此条件下，XYY1 菌株产氨肽酶活力为（4 132.75±11.94）U，显著提高了79.52%。探究了该氨肽酶的酶学性质，该氨肽酶的最适反应温度55 ℃，在50 ℃条件下保存60 min 仍保持89%的酶活；最适反应pH 9.0，且在pH 8.0～10.0 之间都保持90%以上的酶活；Mg2+、Fe2+、Co2+和Ca2+金属离子促进酶活，且1.0 mmol/L 的Mg2+对氨肽酶起最强激活作用；EDTA、SDS、DTT 对酶都具有较强的抑制作用；XYY1 菌株所产的氨肽酶为单一酶，具有较强的底物特异性。本试验结果表明，产氨肽酶的地衣芽孢杆菌对食品、医疗等产业具有极高的应用价值，为发掘具有潜在产业化价值的氨肽酶奠定了基础。
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