高血压为在全球范围高度流行的慢性疾病，每年约1 040 万人死于高血压，是导致人口死亡的主要原因之一[1]。血管紧张素转化酶（ACE）作为生物体内调控血压的一种关键酶，在生物体内的血压平衡稳态中发挥重要的作用。目前，临床上广泛使用的降血压药物为ACE 抑制类药物，如卡托普利、赖诺普利、依那普利等，其降血压作用方式为抑制高血压患者体内ACE 的活性，阻止血管紧张素-Ⅰ（Angiotensin-Ⅰ，Ang-Ⅰ）转换为血管紧张素-Ⅱ（Angiotensin-Ⅱ，Ang-Ⅱ），从而起到显著的降低血压作用[2]。然而，随着ACE 抑制类药物的长期使用，会产生咳嗽、味觉失灵、皮疹等副作用[3-4]，而且高血压疾病迁延反复，几乎无法治愈。故而，全球范围对于高血压疾病的控制如今更倾向于前期预防而非后期治疗[5-6]。因此，开发绿色天然、安全无副作用的食源性ACE 抑制肽（Angiotensin -converting enzyme inhibiting peptide，ACEIP）作为膳食补充剂，用于预防、改善高血压症状，对于提高居民健康水平，缓解医疗压力具有很大的社会意义[7]。
许多研究显示，可从大豆、芝麻、金枪鱼等多种植物、动物蛋白中水解分离制得ACEIP[8-9]。其中，豆类来源的生物活性肽，因来源广，价格低及蛋白质含量高等工业生产优势而被关注[10]。黑豆[Glycine max（L.）merr.]营养价值较高，蛋白质含量35%左右。有报道称，由黑豆蛋白中水解分离的生物活性肽具有抗氧化、降血糖、降血压等功效[11-13]。
鉴于目前的研究聚焦于对高血压疾病的后期改善及治疗，对高血压发病的前期预防鲜有研究报道。课题组前期研究发现黑豆蛋白水解物具有良好的体外ACE 抑制作用[14]。本研究将通过动物实验，探究黑豆ACE 抑制肽（＜3 ku）对高血压疾病的预防及改善作用，旨在为将黑豆肽作为一种预防、改善高血压的膳食补充剂提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
原料：黑豆，购于超市，原产地内蒙古通辽。
实验动物：C57BL/6J 雄性小鼠60 只，7 周龄，18～20 g，SPF 级，购于江苏华创信诺医药科技有限公司。许可证号：SCXK（苏）2020-0009。
碱性蛋白酶（200 000 U/g），江苏锐阳生物科技有限公司；DA201-C 大孔树脂、G-15 葡聚糖凝胶，合肥博美生物科技有限公司；3 ku 超滤膜，美国Pall 公司；赖诺普利，江苏天士力帝益药业有限公司；L-NAME、4%多聚甲醛溶液，上海源叶生物科技有限公司；定量试剂盒，南京建成生物工程研究所有限公司。
1.2 仪器与设备
AL104 型电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；BP-2000 小动物无创血压分析系统，美国Visitech system 公司；TU-1950 紫外-可见分光光度计，北京普析通用仪器公司；Alphal-2冷冻干燥机，英国LABCONCO 公司；3-18KS 台式高速冷冻离心机，德国Sigma 公司；iMark 酶标仪，美国Bio-Rad 公司。
1.3 方法
1.3.1 BSP 样品的制备 参考前期研究[14]，黑豆经干燥后粉碎，无水乙醚脱脂，碱提酸沉法提取黑豆蛋白；配制3 g/100 mL 黑豆蛋白溶液，按6 g/100 mL 加入碱性蛋白酶，50 ℃下酶解2 h，期间保持pH 值为9，4 000 r/min 离心10 min，收集水解液；水解液使用DA201-C 大孔树脂进行脱盐；脱盐后的溶液经0.22 μm 微滤膜过滤后，使用3 ku 的超滤膜进行分级。BSP 溶液超滤质量浓度为200 μg/mL，在室温条件下进行超滤，压力小于5 MPa，收集分子质量3 ku 以下组分，经冷冻干燥后，制成黑豆ACE 抑制肽（BSP），用于后续实验。
1.3.2 动物饲养方式及分组 动物实验由安徽农业大学实验动物伦理委员会审核通过，伦理审查编号为AHAU2022006。所有小鼠均进行1 周的适应性喂养，饲养温度为18～22 ℃，湿度为50%～60%。
适应性喂养后的小鼠，随机取其中16 只分为正常对照组（Con）和L-NAME+BSP 高剂量预防组（L-NAME+BSP）。正常对照组采用饮用水灌胃8周，L-NAME+BSP 高剂量预防组将L-NAME 溶液代替饮用水，同时灌胃高剂量BSP 溶液4 周。
其余44 只采用0.5 mg/mL L-NAME 溶液代替饮水构建高血压模型[15]，以小鼠收缩压（Systolic blood pressure，SBP）升高20 mmHg 为建模成功标准。4 周后选取建模成功的小鼠随机分为5 组：高血压模型组（L-NAME）、赖诺普利药物组（Lisinopril，6.1 mg/kg，剂量由人与小鼠药物剂量换算系数确定）、低剂量组（25 mg/kg）、中剂量组（50 mg/kg）、高剂量组（100 mg/kg），所有小鼠继续饮用含L-NAME 饮用水，药物组及低、中、高剂量组分别采用赖诺普利水溶液和BSP 水溶液进行灌胃。
1.3.3 小鼠血压测定 使用BP-2000 小动物血压计测定小鼠血压，每7 d 进行一次血压测定，测定前所有小鼠在血压计上适应5 min，温度设定为37 ℃。
1.3.4 小鼠血浆生化指标测定 小鼠经4 g/100 mL 水合氯醛麻醉后眼眶取血，置于含肝素的离心管中，在4 ℃、4 000 r/min 条件下离心10 min，取血浆备用。血浆中血管紧张素转化酶（ACE）、血管紧张素-2（AngⅡ）、内皮素-1（ET-1）、白介素-6（IL-6）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）采用酶联免疫分析试剂盒测定。一氧化氮（NO）含量采用硝酸还原酶法测定。
1.3.5 小鼠心脏及肾脏切片染色 解剖小鼠后取其心脏及肾脏，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h 以上，在通风橱中取出脏器，将其修切平整，进行脱水浸蜡、包埋、取心脏、肾脏蜡块进行组织切片；将切片脱蜡后，用苏木素染5 min，自来水冲洗多余染料，1%分化液分化10 s，自来水洗涤，氨水反蓝10 s，自来水洗涤，伊红染色5 min，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ梯度脱水各5 min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明各5 min，最后采用中性树胶封片后进行显微镜观察。同理，对心脏进行Masson 染色，切片脱蜡后浸于Masson A 液中浸泡过夜，自来水冲洗，浸染于Masson B、C 液体积比1∶1 染液中1 min，自来水冲洗，1%盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，Masson D液浸染6 min，自来水漂洗，Masson E 液浸染1 min，Masson F 液浸染20 s，1%冰醋酸漂洗分化数秒，无水乙醇脱水，二甲苯透明5 min，中性树脂封片后进行显微镜观察。
1.4 统计分析
统计分析数据用平均数±标准差（SEM）表示。组间差异分析采用单因素方差分析（ANOVA）检验，P＜0.05 表示差异具有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 小鼠平均血压变化
BSP 灌胃4 周后各组小鼠血压平均值如图1所示。
图1 小鼠平均血压变化
Fig. 1 Changes in average blood pressure of mice
注：a 图中，“*”表示P＜0.050，“**”表示P＜0.010；b 图中，“*”表示与Con 组比较，“#”表示与L-NAME 组比较，“##”表示P＜0.010，“****”和“####”均表示P＜0.0001。
由图1a 可知，高血压模型小鼠仍保持高血压状态；赖诺普利灌胃4 周对高血压小鼠具有极显著的降血压作用（P＜0.01），降低约20 mmHg，基本降低至正常水平；低剂量BSP 灌胃具有轻微的降血压作用（P＞0.05）；中、高剂量BSP 对高血压小鼠具有显著的降压作用（P＜0.05），降压幅度约为10 mmHg，即中、高剂量的BSP 能够降低小鼠高血压，该结果与宋田源[16]及Jeong 等[17]的研究结果一致。由图1b 可知，L-NAME+BSP 组小鼠血压在灌胃2 周时仍与正常组小鼠无显著性差异（P＞0.05），灌胃4 周后血压虽升高了15 mmHg 左右，但仍显著低于模型组小鼠血压（P＜0.001）。在小鼠高血压疾病发生的同时灌胃高剂量BSP 能够明显减慢血压升高速度，起到延缓、预防高血压的作用。
2.2 小鼠血浆ACE 及AngⅡ含量测定
ACE 及AngⅡ是肾素-血管紧张素（RAS）系统的重要组成成分，在机体的血压控制上具有至关重要的作用，ACE 催化AngⅡ的产生，是血压升高的重要途径，ACE 抑制也是开发抗高血压功能性食品的目标[18]。
图2 表明，高血压模型组小鼠血浆中ACE、AngⅡ含量显著升高（P＜0.05）；中、高剂量组对小鼠血浆中ACE 含量具有显著地抑制作用（P＜0.05）；而低、中、高剂量组均显著降低了血浆中AngⅡ含量（P＜0.05），该结果与丁振江[19]和刘飞等[20]的研究结果一致。L-NAME+BSP 组对ACE、AngⅡ含量的抑制作用与高剂量组相当。BSP 能够对L-NAME诱导的RAS 轴失调起到显著地预防作用，这可能是其能够预防、延后L-NAME 所致高血压的一个重要原因[21，22]。
图2 BSP 灌胃4 周对高血压小鼠血浆ACE 及AngⅡ含量的影响
Fig. 2 Effects of BSP intake for 4 weeks on plasma ACE and AngⅡcontents in hypertensive mice
注：不同字母表示数据之间存在显著性差异（P＜0.05），下同。
2.3 小鼠血浆炎症反应标记物含量测定
图3 表明，BSP 对小鼠机体炎症反应具有一定的改善作用，各剂量组BSP 均对小鼠血浆中炎症因子MCP-1、IL-6 的升高具有显著降低作用（P＜0.05），且其作用具有随剂量增加而加强的趋势；L-NAME+BSP 组对IL-6 具有最佳的抑制作用。BSP 产生抗炎症作用的途径可能是抑制LNAME 诱导的高血压，从而保护血管内皮细胞及相关脏器免于过度损伤[23]，并由此抑制高血压初期炎症反应[24]，其生理作用更倾向于免疫提高，抗氧化应激，这与诸多研究结果相吻合[25]。
图3 BSP 灌胃4 周对高血压小鼠血浆MCP-1 及IL-6 含量的影响
Fig. 3 Effects of BSP intake for 4 weeks on plasma MCP-1 and IL-6 contents in hypertensive mice
图4 BSP 灌胃4 周对高血压小鼠血浆NO 及ET-1 含量的影响
Fig. 4 Effects of BSP intake for 4 weeks on plasma NO and ET-1 contents in hypertensive mice
2.4 小鼠血浆一氧化氮及内皮素-1 含量测定
NO 与ET-1 相互抑制，共同维持血压稳态，其含量的稳态可反应血管内皮细胞的正常功能与否。实验结果表明，高血压模型组小鼠血浆中NO含量显著降低且ET-1 含量显著升高；高剂量组和L-NAME+BSP 组显著改善、预防了NO 含量降低（P＜0.05），同时对ET-1 含量上升有显著地抑制作用（P＜0.05）。这一结果表明，BSP 对维持血管内皮细胞中NO/ET-1 的稳态[26]、内皮细胞正常功能具有重要作用[27]，这可能是BSP 对L-NAME 诱导小鼠高血压具有显著的预防、延后作用的又一重要原因[28]。
2.5 小鼠心脏病理学观察
图5 显示，正常组小鼠心脏心肌细胞排列整齐规则，横纹清晰，心肌细胞形态完整；高血压模型小鼠心肌细胞肿胀变形，心肌横纹模糊，出现严重的间质出血，炎症浸润现象；赖诺普利组心肌细胞排列较为整齐规则，心肌细胞轻微肿胀变形，无明显的炎性细胞浸润；与L-NAME 组相比，低剂量BSP 组心肌细胞排列相对整齐；中、高剂量组心肌细胞仅发生较为轻微的肿胀变形，无显著的细胞坏死、变性；L-NAME+BSP 组小鼠心肌细胞仅发生轻度肿胀变形。
图5 BSP 灌胃4 周对高血压小鼠心脏心肌细胞形态的影响（400x）
Fig. 5 Effects of BSP intake for 4 weeks on cardiac myocyte morphology in hypertensive mice（400x）
心肌纤维化是心血管疾病发展恶化的重要因素。如图6 所示，正常组小鼠心肌形态正常，无胶原沉积；L-NAME 组小鼠心脏蓝色胶原纤维大范围内沉积，显示出严重的心肌纤维化倾向；与LNAME 组相比，低剂量组小鼠心肌纤维化面积有所减小，而胶原纤维仍有较大面积积聚；中、高剂量则显示出对小鼠心肌纤维化较好的改善作用，胶原纤维仅在小部分产生；BSP 预防组小鼠与正常组无明显差异。
图6 BSP 灌胃对L-NAME 诱导高血压小鼠心脏心肌纤维化的影响（400x）
Fig. 6 Effects of BSP intake on myocardial fibrosis in L-NAME-induced hypertensive mice（400x）
可以认为，BSP 对于高血压小鼠心脏病变具有一定的保护作用，其可以减少心脏组织炎症的发生[29]，减轻心肌细胞的变性损伤、纤维化[30，31]，并可在高血压发病前期显著预防心脏组织的损伤及纤维化[32]，且BSP 对于高血压心脏病变的前期预防作用要强于其后期改善作用。
2.6 小鼠肾脏病理学观察
图7 显示，正常组小鼠肾组织细胞结构正常，肾小球未见萎缩；L-NAME 组小鼠肾小球出现严重变形萎缩，系膜细胞增生，炎性细胞浸润现象；赖诺普利对高血压小鼠肾脏具有明显的保护作用，肾小球轻微变形，仅出现少量炎症浸润；相较于L-NAME 组小鼠，低剂量组小鼠肾脏少量细胞出现空泡现象，肾小球仍显著变形萎缩；中、高剂量组小鼠肾小球轻微变形，仅出现少量的炎症浸润；L-NAME+BSP 组小鼠肾组织细胞结构相对正常，肾小球未见明显萎缩变形。这与Tsai 等[33]和Zhang 等[34]的研究结果一致。该结果显示，BSP 灌胃对小鼠肾脏炎症反应具有显著地抑制作用，对肾小球萎缩病变，基底膜增厚具有显著地改善作用。高血压发病前期摄入BSP 对肾脏病变的抑制与延后作用具有更实际的应用价值。
图7 BSP 灌胃4 周对高血压小鼠肾脏组织形态的影响（400x）
Fig. 7 Effects of BSP intake for 4 weeks on renal histomorphology in hypertensive mice（400x）
3 结论
BSP 对高血压小鼠的降压作用具有一定的量效关系，中剂量50 mg/kg 的BSP 已具有显著地降血压功效。高剂量100 mg/kg 的BSP 可有效减慢小鼠高血压疾病发生的速度，对L-NAME 诱导的小鼠高血压具有显著地预防和改善作用。BSP 可以通过有效避免高血压小鼠的RAS 系统紊乱，维持血管内皮细胞的正常功能，改善机体炎症反应并保护心脏、肾脏免受高血压所引起的病理损伤，起到预防、改善高血压的功效。综上，黑豆ACE 抑制肽可作为一种用于高血压前期预防和治疗期间的功能性食品。
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