细菌芽孢有极强的杀菌抗性，会造成食品腐败和食源性疾病[1]。杀灭芽孢是食品杀菌的关键[2]，需要寻求更有效的芽孢灭菌方法。芽孢表现出较强的耐杀菌性，其结构是影响这种抗性的关键因素之一[3]。芽孢结构可分为7 个层，从外到内依次为芽孢外壁、芽孢衣、芽孢外膜、芽孢皮层、芽孢细胞壁、芽孢内膜和核心[4]。芽孢外壁和芽孢衣起阻挡化学物质侵害的作用，位于芽孢的最外层。接下来的芽孢皮层保护芽孢免受高温损害。在芽孢的内部，芽孢内膜与营养体的细胞膜由磷脂双分子层构成，位于芽孢皮层之下。由于芽孢内膜的高度不通透性，因此芽孢核心水分含量很低，对热和化学物质有极强的抗性。
2.6-吡啶二羧酸（DPA）是一种独特的物质，仅存在于原核生物细胞壁上，占据芽孢干质量的5%～15%[5-6]。DPA 还可与蛋白质或其它生物分子相互作用形成复合物，主要功能是防止蛋白质的变性[6]。
高压热杀菌（HPTS）是一种将高压和高温相结合的杀菌方法，其工作原理是通过将食品置于高压容器中，然后在高温条件下施加高压，以迅速杀灭食品中的微生物，包括最难杀灭的芽胞[7]，常用的高压范围300～800 MPa，而温度通常在60～100 ℃之间，这使得高压热杀菌具有杀菌速度快，杀菌范围广，操作简便和不会影响食品的质地和口感的优点。对于含有潜在芽孢类致病菌和腐败菌的腌制食品，可考虑采用HPTS 技术，以确保食品的安全和质量。
氯化钠（NaCl）是一种很好的食品调味料，它具有一定的杀菌和抑菌作用，且随着氯化钠浓度的提高，杀菌作用增强。Hutton 等[8]发现，在培养基中添加NaCl，经热处理的芽孢的菌落总数减少。无论其它条件如何（pH 值、温度），2%NaCl 都能杀死一定数量的芽胞。腌制食品中含有大量氯化钠，可以改变细菌细胞膜的通透性[9]，从而产生一定的杀菌和抑菌效果[10]。
傅里叶变换红外光谱（FTIR）技术，是一种高效、快速且便捷的分析方法[11]，可同时检测多种化合物。用于评估细菌内脂质、蛋白质和核酸等分子的变化情况[12]。本文研究高压热杀菌（600 MPa、75℃）结合氯化钠（15%，25%、饱和氯化钠溶液）对枯草杆菌芽孢的杀菌效果。通过流式细胞术和傅里叶变换红外光谱分析氯化钠结合HPTS 对枯草杆菌芽孢的内膜、蛋白质和核酸的影响，为HPTS 技术在腌制食品中的应用提供参考。
1 材料和方法
1.1 材料与试剂
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），编号As 1.433，中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）；营养琼脂，北京奥博星生物公司；硫酸锰（分析纯），天津市大茂化学试剂厂；胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂（TSA-YE）培养基，北京索莱宝科技有限公司；氯化钠，北京索莱宝科技有限公司；甲醇（色谱纯），默克生物技术有限公司；磷酸二氢钠（分析纯），天津市福晨化学试剂厂；DPA（2，6-吡啶二羧酸），99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。碘化吡啶（PI），西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；溴化钾（分析纯），上海广诺化学科技有限公司。
1.2 仪器与设备
AL204 型电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；DSX-280B 型高压灭菌锅，上海申安医疗器械厂；HPP-600 MPa/5L 超高压灭菌装置，山西三水河科技股份有限公司；TGL-10B 型离心机，上海安亭科学仪器厂；UV-9000S 型紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；CyFlow Cube 8 流式细胞仪，日本SYSMEX（希森美康）株式会社；Spectrum Two 型傅里叶变换红外光谱仪，珀金埃尔默股份有限公司。
1.3 方法
1.3.1 枯草杆菌芽孢悬液的制备 采用枯草芽孢杆菌菌株As 1.433，根据Fan 等[13]的方法进行一些修改。将枯草芽孢杆菌活化（3 代以上）后，接种于已经灭菌的促芽孢生长锰盐营养琼脂培养基中。接种后，将试管放于恒温培养箱中（37 ℃）培养1 周。用无菌蒸馏水洗涤、离心，去除上清液后合并菌液，并重复上述步骤进行3 次。用紫外分光光度计调整芽孢浓度约为1.5×109 CFU/mL，90 d 内使用并储存在4 ℃下。使用时，将芽孢浓度至108 CFU/mL（OD600nm=1.0），30 d 内使用完毕。
1.3.2 HPTS 结合NaCl 处理枯草杆菌芽孢悬液试验前将聚四氟乙烯离心管放入121 ℃的高压灭菌锅中，灭菌后吸取30 mL 芽孢悬浮液（4 ℃下保存6 h）至离心管，离心后倒掉上清液，加入30 mL 质量分数分别为15%，25%、饱和的NaCl 溶液并搅拌均匀，转移至无菌聚乙烯塑封袋中，热封后，待处理。在HPTS 处理仓内，设条件20 min，600 MPa，处理温度为25 ℃和75 ℃。进行各项指标测定。
1.3.3 枯草杆菌芽孢的平板计数 根据Zhang等[14]的试验方法，记录存活的芽孢数。依照《食品安全国家标准 食品微生物学检验菌落总数测定》（GB 4789.2-2016）[15]对比结果，计算菌落总数。
1.3.4 枯草杆菌芽孢悬液中DPA 含量的测定 取离心（9 000 r/min、15 min）后上清液2 mL，通过0.22 μm 水相滤膜进行预处理，以便选用高效液相色谱法继续检测。根据相关文献[16]稍作修改，检测波长设置为272 nm，DPA（2，6-吡啶二羧酸）的保留时间约为4 min。
1.3.5 流式细胞法测定芽孢内膜通透性 将枯草杆菌芽孢菌液菌液离心（9 000 r/min、15 min），取2 mL 加入0.75 μL 的20 μmol 碘化吡啶（PI）染色剂，并在室温下避光处理15 min。使用流式细胞仪分别检测前向散射光（FSC）、侧向散射光（SSC）以及荧光通道FL2。在激发光488 nm 的条件下，碘化吡啶标记的细胞在615 nm 处发出红色荧光，并收集数据。
1.3.6 FTIR 光谱分析 FTIR 光谱分析如Nag等[17]所述。校正频谱波段到酰胺I 波段1 600-1～1 700 cm-1，并进行了二阶导数，观察峰形和位移并比较峰面积大小，计算了枯草芽孢杆菌芽孢蛋白各二级结构的含量。采用Origin 2019 分析了3 300～2 800 cm-1 脂质带，1 700～1 600 cm-1 蛋白带和1 300～900 cm-1 红外核酸带。
1.3.7 统计分析 每组试验均重复进行3 次。采用Origin 2018 和SPSS 24 软件进行统计学分析，采用Excel 2019 计算数据，以P<0.05 为显著性差异的标准。
2 结果和分析
2.1 HPTS 结合NaCl 处理对枯草芽孢杆菌芽孢的影响
如图1 所示，在25 ℃下600 MPa 作用20 min时，含15%，25%和饱和氯化钠的芽孢存活数（分别为7.95，7.91 和7.95 lg（CFU/mL）没有差异，与无氯化钠相比，对芽孢几乎没有灭活作用。但当处理温度为75 ℃时，芽孢失活率随着氯化钠浓度的变化而变化。在600 MPa、75 ℃和15%氯化钠处理20 min 后，芽孢的灭活量达到了最大值[5.54 lg（CFU/mL）]。而25%和饱和氯化钠则有效地削弱了HPTS 对芽孢灭活作用。Zhang 等[14]研究了HPTS和乙醇联合处理对枯草芽孢杆菌芽孢失活的影响。低浓度的乙醇可以增强HPTS 对芽孢的杀菌效果，而高浓度的乙醇杀菌效果不如低浓度的乙醇。这是因为高浓度乙醇可能显著抑制了水解酶的活性，进而阻碍了芽孢皮层的水解过程，使得芽孢能够保持对高温和高压的抵抗力。这与本文的现象一致，也是一个反常的现象。而Liu 等[18]研究表明，枯草杆菌芽孢在550 MPa、25 ℃、65 ℃和75℃的高温条件下分别用0.1%和0.3%的ε-PL 处理后，结果发现在550 MPa、75 ℃结合0.3%的ε-PL对芽孢灭活作用最好，HPTS 和ε-PL 协同作用降低了芽孢存活数量，增加了芽孢悬液中细胞内成分的释放。氯化钠浓度变化对HPTS 处理下芽孢灭活的影响趋势与ε-聚赖氨酸不一致。
图1 不同浓度的HPTS 结合NaCl 的芽孢灭活作用
Fig.1 Spore inactivation of different concentrations of HPTS combined with sodium chloride
2.2 HPTS 结合NaCl 对芽孢DPA 泄漏的影响
如图2 所示，在600 MPa、25 ℃处理下，随着氯化钠浓度的增加，DPA 的释放量不断减少，且释放量相对较低，说明高压处理下对芽孢内膜的损伤随着氯化钠浓度的增加而不断减少。在600 MPa、25 ℃处理下，氯化钠浓度的越高，DPA 释放量越大，变化趋势不大，但总体呈下降趋势，说明与不添加氯化钠相比，600 MPa、25 ℃结合氯化钠可以降低DPA 的释放量。在600 MPa、75 ℃处理下，氯化钠浓度的变化，DPA 释放量随之变化，15%质量分数的氯化钠，DPA 释放量达到最大，此时的泄漏率为91.9%。然而，随着氯化钠浓度进一步升高，DPA 的释放量不断显著降低。DPA 的释放与芽孢核心的水化及芽孢的杀菌抗性直接相关。图2 中的DPA 释放结果与图1 的杀菌效果是一致的。
图2 用HPTS 和NaCl 处理的枯草芽孢杆菌芽孢的DPA 泄漏率
Fig.2 DPA leakage rate of Bacillus subtilis spores treated with HPTS and sodium chloride
高瑀珑等[19]研究发现，经过HPTS 处理的枯草芽孢发生了结构破坏，导致芽孢内膜通透性发生改变，并显著增加DPA 的泄漏率（P＜0.05）。在HPTS 与氯化钠共同处理的情况下，DPA 的释放可能与芽孢内膜通透性或完整性的变化有关。为了深入了解这一情况，我们使用流式细胞仪对芽孢内膜的变化进行了分析。
2.3 HPTS 结合NaCl 处理对芽孢内膜通透性的影响
为了进一步探究这一特殊现象，采用流式细胞仪来检测芽孢内膜的受损情况。碘化吡啶（PI）是可用于细胞核染色和荧光检测等领域的化学试剂，能够穿透受损的细胞膜并与DNA 结合[21]。通过使用PI 染料标记，受损的芽孢在流式细胞仪检测时会发射红色荧光，而红色荧光的强度则反映了芽孢内膜的受损程度[22]。经过观察图3，发现在600 MPa-75 ℃的条件下，添加不同浓度的氯化钠处理后，芽孢内膜的通透性发生了明显的变化。具体而言，不添加氯化钠时，阳性区域偏移值为20.4%；这说明在600 MPa-75 ℃条件下，添加15%氯化钠时，通过检测芽孢的荧光标记来检测芽孢内膜，观察到阳性区域偏移值达到了最高值（57.0%），说明此时芽孢受损程度最大，内膜通透性变化最为明显。综上，600 MPa-75 ℃条件下，添加15%氯化钠对芽孢内膜结构变化程度大于25%和饱和氯化钠，这与菌落计数结果相符。此外，Mathys 等[23]指出HPTS 处理会损伤芽孢的内膜的结构。然而，氯化钠与HPTS 结合也会对芽孢的内膜造成不可逆的损伤，并导致DPA 的释放，DPA的释放与杀菌效果密切相关[24]。
图3 HTPS 结合不同浓度NaCl 处理对枯草芽孢杆菌内膜透性的影响
Fig.3 Effects of HTPS combined with different concentrations of NaCl on the endometrial permeability of Bacillus subtilis
2.4 HPTS 结合NaCl 对枯草杆菌芽孢内膜磷脂、蛋白质和核酸的红外光谱的影响
2.4.1 傅里叶变换红外光谱图 近年来，FTIR 在微生物学领域得到广泛应用。因为其能够综合检测微生物关键物质和关键结构的变化，可用于研究杀菌领域。通过检测杀菌处理后关键物质吸收峰位置和强度的变化，来揭示杀菌处理对关键物质和关键结构的损伤作用。章中等[25]对高压热结合酸对枯草芽孢杆菌的杀菌作用进行了研究，并采用傅里叶变换红外光谱法对芽孢成分进行了分析。结果表明，当pH 值降低至1 时，HPTS（550 MPa-75 ℃）结合酸对芽孢的杀灭作用显著增强，导致芽孢数量最多减少了6.25 个数量级CFU/mL；同时，蛋白质的二级结构发生变化、核酸物质发生变性。
如图4 所示，不同的处理条件对枯草杆菌芽孢的红外光谱产生了明显的影响，吸收峰的强度发生了多样化的变化。15%氯化钠结合HPTS（600 MPa-75 ℃）处理组的吸收峰的振动强度高于其它组。但总体峰形基本接近，从图中很难分析出特征峰位置变化情况。为了更好的监测枯草杆菌芽孢的红外光谱特征峰的变化，选择对傅里叶变换红外光谱图二阶求导。这样处理有助于提高特征峰的辨识度，使其变化更加清晰可见，从而更好地了解样品的特性和变化。
图4 HPTS 结合NaCl 对芽孢傅里叶变换红外光谱图的影响
Fig.4 Effect of HPTS combined with sodium chloride on Fourier transform infrared spectra of spores
2.4.2 HPTS 结合NaCl 处理后枯草杆菌芽孢红外光谱二阶导数图（3 000～2 800 cm-1）如图5 所示，HPTS 结合氯化钠处理前后枯草杆菌芽孢在3 000～2 800 cm-1 的二阶导数红外光谱图。在600 MPa 和75 ℃的15%氯化钠中处理20 min 后，达到最强吸收峰。Wang 等[26]研究发现细菌在3 000～2 800 cm-1 区域的变化，表明细胞膜可能由于脂肪酸中的C-H 拉伸振动而受到破坏，导致内膜形态结构的改变。第1 个吸收峰位于2 927～2 916 cm-1处，对应于细胞膜脂肪酸-CH2 官能团的反对称伸缩振动[27]。-CH2 吸收峰的位移表明细胞膜中RCH2-CH2-R' 的堆积属性和双层磷脂分子层的规则性和无规则性[28]。经HPTS 处理后，吸收峰位置偏移是因为脂肪酸酰基链“融化”或达到高度无规则构象[29]。随着氯化钠浓度的增加达到饱和，所对应的-CH2 吸收峰位置发生了改变，并且HPTS 结合15%的氯化钠比结合25%氯化钠位移明显。第2 个吸收峰位于2 855～2 849 cm-1 处，它代表了特定细胞膜官能团脂肪酸-CH3 的对称伸缩振动。结果表明，经HPTS 和氯化钠处理后，波峰位置基本没有变化，600 MPa、75 ℃结合15%氯化钠处理下，与其它处理组相比，吸收峰的强度达到最大。两个特征吸收峰均表明，15%氯化钠处理后，脂肪酸的甲基和亚甲基特征官能团的振动强度最高，枯草杆菌芽孢内膜结构变化最显著。600 MPa、75℃结合15%氯化钠处理下，芽孢内膜主要发生-CH2 的反对称振动，导致枯草杆菌芽孢内膜的磷脂脂质分子疏水尾链混乱度增大，从而破坏芽孢内膜的结构，而25%和饱和氯化钠却有利于保持官能团-CH2/-CH3 的稳定性并削弱了HPTS 处理对芽孢内膜的损伤。高瑀珑等[19]研究了HPTS 结合聚ε-赖氨酸对枯草杆菌芽孢的影响，在550 MPa、75 ℃下，与未添加ε-聚赖氨酸相比，添加0.1%的ε-聚赖氨酸处理后，吸收峰向大波数方向移动，随着ε-聚赖氨酸的添加量增加到0.3%，吸收峰的位移和芽孢内膜损伤更明显。氯化钠浓度变化对HPTS 处理下芽孢内膜损伤的影响趋势与ε-聚赖氨酸不一致。
图5 HPTS 结合NaCl 对芽孢内膜傅里叶二阶导数光谱图的影响
Fig.5 Effect of HPTS combined with sodium chloride on second-order Fourier derivative spectrogram of endomycospora
2.4.3 HPTS 结合NaCl 处理后枯草杆菌芽孢红外光谱二阶导数图（1 300～950 cm-1）在1 300～950 cm-1 处的傅里叶变换红外光谱反映DNA 碳骨架的振动特征[30]。1 080 cm-1 附近的吸收峰表示P=O的反对称和对称伸缩振动。如图6 所示，600 MPa，75 ℃时随着氯化钠浓度的增加，核酸特征吸收峰的振幅降低，削弱了HPTS 处理对芽孢DNA碳骨架的损伤。而600 MPa，75 ℃结合15%氯化钠处理下枯草杆菌芽孢核酸分子的P=O 对称伸缩振动最强，对芽孢DNA 碳骨架的稳定性的破坏最大。对比添加和不添加氯化钠处理后芽孢1 300～950 cm-1 红外光谱图，表明芽孢内核酸物质稳定性降低、相关蛋白变性、结构发生变化。Graf 等[27]研究了HPTS 结合酸对枯草杆菌芽孢的杀灭作用，在550 MPa-75 ℃条件下结合酸（pH=1）处理后，吸收峰位置向低波形函数方向移动，吸收峰强度降低。氯化钠浓度变化对HPTS 处理下芽孢内核酸物质的影响趋势与pH 值不一致。高浓度的氯化钠有利于芽孢DNA 碳骨架的稳定性。
图6 HPTS 结合NaCl 对芽孢核酸的傅里叶变换二阶导数光谱图的影响
Fig.6 Effect of HPTS combined with sodium chloride on Fourier transform second derivative spectra of spore nucleic acids
2.4.4 HPTS 结合NaCl 处理后枯草杆菌芽孢红外光谱二阶导数图（1 700～1 600 cm-1）酰胺I 带（1 700～1 600 cm-1）代表了特定官能团-C=O 的拉伸振动，与蛋白质的二级结构有关。如图7 所示，在该范围内有两个吸收峰显著增强。在HPTS 结合氯化钠处理过程中，蛋白质发生变性导致氢键断裂。第1 个吸收峰位于1 660 cm-1 附近，各浓度氯化钠所对应的吸收峰的位置基本没有变化[31]。然而随着氯化钠浓度的增加，与对照组相比，吸收峰面积都有所增加，15%氯化钠的峰面积达到最大，吸收峰的震动强度最大，吸收峰的位置也发生了移动。说明当温度压力一定时，15%氯化钠对蛋白质二级结构的影响最大。第2 个吸收峰位于1 638～1 618 cm-1 处，代表酰胺I 带蛋白的β-折叠结构HPTS 结合氯化钠处理后，均出现了不同程度的偏移，吸收峰的峰形和特征官能团的振动强度也有显著变化。综上，随着氯化钠浓度增加到饱和状态，两个吸收峰的特征官能团的振动强度逐渐减小。HPTS 与15%氯化钠结合对枯草杆菌芽孢的蛋白质结构有很强的破坏作用，而饱和氯化钠会削弱HPTS 处理对蛋白质分子氢键的破坏，在一定程度上保护了芽孢的蛋白质分子[32]。
图7 HPTS 结合NaCl 对芽孢蛋白质傅里叶变换二阶导数光谱图的影响
Fig.7 Effect of HPTS combined with sodium chloride on Fourier transform second derivative spectra of spore proteins
2.4.5 HPTS 结合氯化钠处理对枯草杆菌芽孢酰胺I 带蛋白二级结构的影响 对傅里叶变换红外光谱图进行蛋白质二级结构拟合，采用二阶导数和Gaussian 法去卷积拟合得到了吸收峰[33]，结果如图8 所示。各亚峰与蛋白质二级结构对应的关系为：不同峰的位置与蛋白质的二级结构相关：1 650～1 660 cm-1 代表α-螺旋结构，1 610～1 640 cm-1 和1 690～1 700 cm-1 表示β-折叠结构，1 660～1 690 cm-1 表示β-转角结构，1 640～1 650 cm-1 表示无规则卷曲结构[34]。对各处理芽孢样品，确认每个子峰，并计算每种二级结构的含量，结果见表1。
表1 不同浓度的NaCl 结合600 MPa 和75 ℃处理对枯草杆菌芽孢蛋白二级结构的影响
Table 1 Effects of different concentrations of sodium chloride combined with 600 MPa and 75 ℃on secondary structure of Bacillus subtilis spore protein
注：同一列中不同的小写字母存在显著性差异（P<0.05）。
图8 不同处理的枯草杆菌芽孢蛋白质酰胺I 带拟合曲线
Fig.8 Fitting curves of Bacillus subtilis spore protein amide I bands under different treatments
蛋白质的构象的稳定性决定了其生理功能。这种稳定性可以受多种因素的影响，包括静电力、氢键、疏水键、范德华力、二硫键以及与溶剂分子的相互作用[37]。试验结果表明，高压热杀菌改变了芽孢蛋白质的结构。Ho 等[38]研究发现，因为氯化钠作为一种强电解质，它能够引起蛋白质分子内部的化学反应，导致蛋白质的二级结构发生改变，进而失去其原有的生物学功能。在600 MPa 和75℃的处理条件下，枯草芽孢的蛋白质二级结构发生了变化（P<0.05）。尤其是在添加了15%氯化钠的600 MPa-75 ℃处理条件下，α-螺旋结构的比例为16.09%。而在600 MPa-75 ℃结合25%的氯化钠和饱和氯化钠的条件下，α-螺旋结构的比例分别为20.30%和20.87%。值得注意的是，当氯化钠的浓度为15%时，α-螺旋结构的比率显著降低，转化为β 旋转角和β-折叠，蛋白质二级结构肽链的稳定性下降，对芽孢造成损害。与15%氯化钠相比，25%氯化钠和饱和氯化钠的α-螺旋结构增加，保持了α-螺旋结构的稳定性，有效的保护了芽孢蛋白结构。
3 结论
试验结果表明，高浓度氯化钠不但没有增加HPTS 处理杀灭枯草杆菌芽孢的效果，反而对HPTS 处理下的芽孢有保护作用。15%质量分数的氯化钠增加了HPTS 处理芽孢对细胞膜、蛋白质和核酸的损伤，杀菌效果和DPA 释放量均为最大，而25%质量分数和饱和浓度氯化钠却有利于增加HPTS 处理下芽孢内膜、蛋白质和核酸的稳定性，饱和浓度氯化钠下芽孢的杀灭效果和DPA释放量均为最小。这可能是因为随着氯化钠浓度的增加，水分活度降低，水分子更难进入芽孢核心，而芽孢核心的水分含量对芽孢的杀菌抗性至关重要，芽孢核心水分含量越低，芽孢越难被杀灭。本文为HPTS 技术在腌制食品中的应用提供了理论参考。
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